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PRODUCCIÓN Y

EVALUACIÓN
TOXICOLÓGICA DE
BIOINSECTICIDAS

PRÁCTICA N 2 DE BIOTECNOLOGÍA

DOCENTE: DRA. ROSA ALTAMIRANO DÍAZ

PRESENTADO POR:

BRAVO ROMERO, ANGELA FABIOLA.


LOPEZ MONTOYA, VICTOR W.
HUAMÁN CAICHYHUA, NADIA.
RAMOS BURGOS, ALFREDO.
VALVERDE LUNA, KATHERINE.

X CICLO

ICA – PERÚ
2010
PRÁCTICA DE BIOTECNOLOGÍA
PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE BIOINSECTICIDAS

PRACTICA Nº 2:
PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE BIOINSECTICIDAS

I. INTRODUCCIÓN

Las plagas tanto urbanas como rurales son una amenaza constante para la salud y la calidad de
vida humana (Dulmage, et al., l990), son también la causa de grandes pérdidas económicas en los
cultivos (Kaelin, et al., l994). Hasta ahora la única forma eficaz de controlar estos insectos plaga se
basa en la aplicación de pesticidas químicos, aunque ello trae en consecuencia problemas
ecológicos; por tanto el uso irracional de los agroquímicos ha sido causa de contaminación
ambiental en todo el planeta. Una posible alternativa para solucionar este problema es el control
biológico, definido como el uso de un organismo natural o modificado genéticamente y/o sus
productos para reducir los efectos de insectos plaga.
Se ha reportado la existencia de más de 1500 especies de microorganismos entomopatógenos
con potencial para el control microbiano de insectos, en relación a su diversidad se señalan:
hongos, virus, protozoarios y bacterias, en donde las últimas son las de mayor importancia. De las
bacterias la más sobresaliente pertenece al género Bacillus (3).
Bacillus thuringiensis, es una bacteria GRAM positiva esporulada, nativa del suelo, caracterizada
por producir inclusiones paraesporales de constitución proteica (ICP), también denominadas δ-
endotoxinas, con actividad tóxica frente algunas especies de insectos de los órdenes Lepidoptera,
Diptera, Coleoptera, Hymenoptera, Homoptera, Orthoptera, y Mallophaga, y contra otros
organismos, como ácaros, nematodos y platelminos (1).
Desde su descubrimiento en el siglo pasado, B. thuringiensis se ha convertido en el
entomopatógeno más utilizado a nivel mundial, con ventas que representan de 90% del mercado
de bioplaguicidas, y además es aprovechado para obtener plantas resistentes a insectos (2).
En este informe se evaluó en forma rápida y efectiva la actividad insecticida de las proteínas cry,
producidas en un Biorreactor, de la cepa nativa Bacillus thuringiensis var. Kurstaki para ratificar
su valor como alternativa para el control biológico sobre plagas agrícolas.

Modo de acción de las biotoxinas de Bacillus thuringiensis


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PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE BIOINSECTICIDAS

II. MATERIALES

Material biológico:  Porta y cubre objetos

 Cepa de Bacillus thuringiensis var. kurstaki Varios:


 20 larvas de Spodoptera sp. (Lepidóptero)
 Hojas y granos de Maíz  Algodón
 Gasa
Equipo:  Papel aluminio
 25 vasos de unisel
 Balanza analítica  Ligas
 Microscopio  Cinta de pH.
 Centrifuga
 Biorreactor de tanque agitado y aireado. Insumos y Reactivos:

Cristalería:  Agar nutritivo


 Azul de Comassie
 Matraz Erlenmeyer de 500 y 2000 mL  Colorantes para tinción de Gram
 Pipetas de 5 y 10 mL  Glucosa
 Vaso de precipitados de 250 y 1000 mL  Extracto de levadura
 10 tubos de centrífuga  Harina de soya
 Pure de tomate
Utensilios:  KH2P04
 CaC03
 Asa y porta-asa microbiológica  MgS04-7H20
 Espátula  MnS04- H20
 Mechero o lámpara de alcohol  FeS04-7 H20
 Pinzas de disección  CaC12-4 H20

III. PROCEDIMIENTOS GENERALES

 Obtención de Biomasa de Bacillus thuringiensis var kurstaki.


 Obtención de Cristales Proteicos toxicos.
 Evaluación toxicológica de los cristales proteicos de B. thuringiensis sobre larvas de insectos
plaga (bioensayos).

3.1. OBTENCIÓN DE BIOMASA DE Bacillus thuringiensis.

PROCEDIMIENTO:

 REACTIVACIÓN DE LA CEPA

Repicar por estría una cepa nativa de B. thuringiensis en tubos


con agar nutritivo. Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.
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 PREPARACIÓN DEL INOCULO.

Proliferación celular:
Se sembró en toda la superficie de 1 placa con agar nutritivo e incubó a 37ºC por 24
horas.

Cosecha celular:
a. Añadimos 3 ml de caldo nutritivo en la placa con el cultivo y 5 perlas de vidrio estériles.
Luego movimos las placas suavemente hasta obtener una suspensión celular.
b. Tomamos la suspensión celular y lo colocamos en un frasco schott de 150 ml estéril y
se enrazó hasta 50 ml con caldo nutritivo. Antes, comprobamos la formación de
esporas y cristales de la Cepa, haciendo una coloración con Azul de Comassie.

Obtención del inóculo:


a. Se incubó el frasco schott con la suspensión celular en agitación a 150 rpm a
temperatura ambiente por 18 a 24 horas (alternativa estufa a 37 ºC).
b. Realizamos el recuento celular mediante siembras por incorporación en agar nutritivo
de diluciones seriadas del cultivo hasta 10-5.

Concentración del inóculo:


7.8 x 107 UFC/ml.

 PREPARACIÓN DEL BIORREACTOR.

Armar y esterilizar el biorreactor tanque agitado y aireado.

 PRODUCCIÓN DEL BIOINSECTICIDA

a. Se colocó 1 ml. del inóculo y el medio base + harina de soya al 0.6% hasta un volumen
de trabajo de 1800ml. en el biorreactor. (Concentración inicial de fermentación
aproximadamente 4.3 104 UFC/ml).

Componentes de Medio de Fermentación (Componente g/l)

Glucosa 5.0 FeS04-7 H20 0.028


Harina de soya 6.0 CaC12-4 H20 0.030
Pure de tomate 40 ml Ajustar el pH, con NaOH 1 N. a 7.0.
KH2P04 2.5 Los medios se esterilizan a 121°C durante 15
CaC03 1 minutos.
MgS04-7H20 0.0001
MnS04- H20 0.04
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Calculo de la Concentración Inicial de Fermentación

Ci = 7.8 x 107 UFC/ml. CIF = ?


V1= 1 ml. V2 = 1801 ml.

Ci x V1 = CIF x V2
(7.8 x 107 UFC/ml.)x(1 ml.) = (CIF)x(1801 ml.)

CIF = 4.3 104 UFC/ml

b. Insuflamos aire estéril a 1.72 VVM.

Cálculo del VVM

PRUEBAS
Tiempo (seg.) Volúmen (ml.)

1.7 40
1.9 38
1.7 42
1.8 44
1.9 40
Promedio = 1.8 seg. Promedio = 40.8 ml.

0.030 min (1.8 seg) ----- 40.8 ml. 1 VVM ----- 1300 ml.
1 min ---------------------- X X ------------ 1800 ml.

X = 1360 ml. X = 1.72 VVM

c. Poner en funcionamiento por espacio de 24 - 48 horas a temperatura ambiente.

Concentración final de Femrnetación:


1.52 x 1012 UFC/ml.

Biorreactor en funcionamiento

d. Dejar en reposo por 48 h para que las células esporulen y formen los cristales
proteicos.
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3.2. OBTENCIÓN DE CRISTALES PROTEICOS TOXICOS.

Con los cristales proteicos se llevará a cabo un bioensayo en el que se pondrán en contacto con
larvas de Spodoptera sp. que son plagas de plantas.

PROCEDIMIENTO:

1. Verificación del crecimiento celular y formación de precipitados.

Se observó la turbidez del medio de cultivo a las 48 horas lo que indicó el crecimiento
bacteriano y después de 48 horas la formación esporas y de cristales proteicos por la
aparición de precipitados en el reactor y aclaración del medio.

Fermento luego de 48 horas - Formación


de Precipitados

2. Decantación y centrifugación del fermento.

Se decantó cuidadosamente el medio de fermentación y se separó los complejos espora -


cristal en tubos (uno por cada mesa de trabajo) mediante centrifugación a 5000 rpm por 5
min. No se midió el volumen del sedimento, pero si se midieron los volúmenes de los tubos
antes de centrifugar.

Distribución del sedimento en Centrífugación a 5000 RPM


tubos por grupo.
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3. Verificación de los cristales proteicos. (Procedimiento no ejecutado)

4. Lavado de los complejos espora-cristal. (Procedimiento no ejecutado)

5. Se conservó el complejo de espora-cristales en congelación

Conservar a T° de congelación

3.3. EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE LOS CRISTALES PROTEICOS DE B. thuringiensis SOBRE


LARVAS DE Spodoptera sp. (BIOENSAYOS)

PROCEDIMIENTO:

1. Recolección de larvas.

Se priorizó en conseguir posturas de lepidópteros desde el cultivo hospedero, para la


obtención de estadíos uniformes y mejor interpretación de resultados.

Distribución del sedimento en tubos


por grupo.

2. Identificación de larvas

Se identificaron larvas de Spodoptera sp. (Lepidóptero de importancia agroindustrial) que


según sus características morfológicas pertenezcan a estadios I y II.

Características Macroscópicas de
Spodoptera sp.
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3. Preparación de la dosis de biotoxina.

Se homogenizaron los complejos espora – cristal de cada grupo y se prepararon para la


posterior sumergida del alimento de las larvas.

Homogenización
Tubos Centrifugados con el
Complejo Espora - Cristal

4. Resuspender la toxina conservada en 500ml de SSF estéril (1 mg/ml) (Procedimiento no


ejecutado)

5. Bioensayo:

 Se lavó cuidadosamente con agua destilada estéril la superficie de las hojas que servirán
de alimento de las larvas a ensayar.

Lavado del alimento

 Empleamos 2 vasos de vidrio de 1 litro cubierta con un tul en la parte superior: uno de
ellos se utilizará como ensayo (E) y el otro como control negativo (N).
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 Para el vaso E: colocamos 2 a 3 granos de maíz en la superficie con la suspensión de


bioinsecticida en estudio.

Alimento de larvas con Biotoxina

 Para el vaso N: colocar 2 a 3 granos de maíz en la superficie con SSF estéril.

Alimento de larvas con SSF

 A cada vaso se colocó 10 larvas de lepidóptero de I o II estadio.

Control (+) y Control (-)


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 Observamos cuidadosamente la ingestión de las hojas por parte de las larvas y anotamos
el tiempo de efecto de la toxina hasta un lapso de 72 horas y anotar los resultados.

III. RESULTADOS

A. Cultivo de la Bacteria

Cultivo de la cepa de Bacillus thuringiensis utilizada.

B. Observación de Esporas y Cristales (1000X)

Tinción de Esporas y Cristales con Azul de Comassie


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C. Bioensayos

TABLA N°1
Suceptibilidad de diferentes especies larvas de Lepidopteros frente a toxinas de Bacillus
thuringiensis durante 72 horas.

HORAS
Tipo de Larva Evaluación 0.5 1 2 4 6 12 24 48 72 T

Heliothis Positivo G1 - - - - - - - 1 1 2
Negativo G1 - - - - - - 1 - - 1
G2 - - - - - 1 2 2 2 7
Spodoptera G3 - - - - 3 2 5 5 - 15
Positivo G4 - - - - - - 1 4 5 10
G6 - - - - - - 3 4 2 9
G2 - - - - - 2 2 4 4 12
G3 - - - - 1 - - - - 1
Negativo G4 - - - - - - - 1 9 10
G6 - - - - - - - - - 0
G7 - - - 1 - 2 3 3 1 10
Onmiodes Positivo G5 - - - 2 - 3 - - 5 10
G7 - - - - - - 2 5 3 10
Negativo G5 - - - - - 2 2 - 6 10
* Resultados esperados

TABLA N°2
Suceptibilidad de Spodoptera sp. (Grupo 2) frente a toxinas Bacillus thuringiensis durante
72 horas.

HORAS
Evaluación 0.5 1 2 4 6 12 24 48 72 Total
Ensayo - - - - - 1 2 2 2 7
Negativo - - - - - 2 2 4 4 12

Larvas muertas después de 72 horas


con características de la infección de
Bacillus thuringiensis
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GRÁFICO N°1
Número de larvas muertas vs tiempo en días.

LARVAS

DÍAS
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IV. DISCUSIÓN

Algunas especies de bacterias Gram positivas (principalmente de los géneros Bacillus,


Clostridium, Sporosarcina y Thermoactinomyces), disponen de una notable estrategia
adaptativa cuando se ven sometidas a privación de nutrientes en su medio ambiente: si los
niveles de fuentes de C, N, o P caen por debajo de un umbral, esto constituye una señal a la
célula de que se avecina un largo período de privación de nutrientes. Entonces, la célula se
implica en una serie de complejos cambios genéticos, metabólicos y estructurales (proceso de
esporulación o esporogénesis), que conducen a la diferenciación, en el interior de la célula
vegetativa original, de una célula durmiente (la endospora). La célula-madre, la célula
vegetativa original que generó la endospora finalmente se autolisa, liberando la espora, que es
capaz de permanecer en estado criptobiótico, durmiente, varios decenios, incluso siglos.

En el laboratorio tras reactivar el cultivo de Bacillus thuringiensis nosotros logramos inducir la


esporulación de B. thuringiensis al cambiarla de un medio rico en nutrientes (Agar nutritivo) a
un biorreactor de tanque agitado con pocos nutrientes, además de que para asegurar que la
mayoría de los bacilos lograran la esporulación y lisado celular (liberándose también los
cristales), se mantuvieron en este medio durante 5 días.

En el ensayo de la biotoxicidad de los cristales proteicos de Bacillus thuringiensis inicialmente


utilizamos un total de 26 larvas, las cuales distribuimos en números iguales para lo que
corresponde al bioensayo y a la muestra control.

La acción citotoxica en las larvas destinadas al bioensayo produjo un total de 7 larvas muertas
encontrando resultados similares con el grupo 6 en el cual, a través de un mismo bioensayo,
termino con un total de 9 larvas muertas.

En relación del grupo 3 afirmamos que obtuvimos solo un 50 % del total de muertes que logro
este grupo, el cual llego a 15 larvas muertas por la actividad de la biotoxina. Con respecto a las
muertes obtenidas en los grupos 4, 5 y 7, por acción del bioinsecticida, observamos que no
obtuvimos mucha desventaja con dichos grupos.

Por último el desarrollo obstaculizado de las larvas, con respecto a su condición de control,
manifestó que las muertes de las larvas control se debieron a factores de nutrición y/o mala
manipulación (muerte por aplastamiento). Y es así que nuestro grupo en conjunto con el grupo
4, 5 y 7 representaron más del 50 % de los grupos que obtuvieron muertes altas en el trabajo
control.
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V. CONCLUSIONES

 La toxina es eficiente y demostró su capacidad citotoxica.

 Las dosis de toxina obtenidas a partir de 1.52 x 1012 fue eficiente contra las larvas plaga.

 La toxina es específica, demostrando mayor efectividad en Spodoptera sp. que en otras


larvas de plaga.

 Las condiciones de temperatura, humedad, presión no intervienen en la acción citotoxica


de la toxina.

 La observación, en intervalos, de las larvas permitió la verificación de la acción de la toxina


manifestándose en parálisis o en muertes de larvas.

 Las larvas presentaron una característica general: el abdomen se torno más oscuro que el
resto de su cuerpo, ya que la larva tiene acción citotoxica en el tracto digestivo originando
deshidratación aquí.

 Las larvas control tuvieron una importancia relevante ya que se mantuvieron vivas hasta la
falta de alimento pero demostrando la efectividad de la toxina.

VI. REFERENCIAS

1. Feitelson, J; J. Payane y L. Kim. 1992. Bacillus thuringiensis: Insectos y más allá. Biotecnology
10(3), 271-275.

2. Schnepf, E; N. Crickmore; J. Van Rie; D. Lereclus; J. Baum; J. Feitelson; D.R. Zeigler y D.H.
1998. Bacillus thuringiensis y su cristales proteicos pesticidas. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62,
775-806.

3. Vega I; Cultivo de Bacillus thuringiensis y su uso como bioinsecticida. Instituto Politecnico


Nacional. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. México. 2008. Pag. 2-3.