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Computadora

Macromoléculas:
17
Experimentos con proteínas
Este ejercicio está diseñado para introducirlo al estudio de las macromoléculas. Las proteínas, el ADN, el ARN y
los polisacáridos como el almidón, el glucógeno y la celulosa son macromoléculas. Las macromoléculas se
forman al conectar muchas moléculas más pequeñas entre sí. Los componentes individuales de una
macromolécula se denominan monómeros. Las proteínas están compuestas de monómeros llamados
aminoácidos. Todos los aminoácidos tienen un grupo carboxilo, un grupo amino y un carbono central o alfa. El
carbono central de cada aminoácido contiene una cadena lateral que a menudo se denomina grupo R. Los
aminoácidos forman polímeros cuando el grupo carboxilo y el grupo amino de dos aminoácidos forman un
enlace peptídico como se muestra en la Figura 1. En la reacción se forman agua y un dipéptido. Se pueden
agregar más aminoácidos al grupo carboxilo de este dipéptido hasta que se forme un polipéptido.

Figura 1
Hay 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en las proteínas, y cada uno tiene un grupo R diferente. Estas
cadenas laterales son muy importantes porque imparten a cada aminoácido características diferentes. Los
aminoácidos se pueden caracterizar como polares, no polares o cargados. Los aminoácidos cargados se
caracterizan además como ácidos o básicos. Los aminoácidos no cargados pueden considerarse neutros. En la
Figura 2 se muestran tres aminoácidos diferentes. El ácido aspártico es ácido, la lisina es básica y la alanina es

neutral. La secuencia de aminoácidos

que componen un polipéptido se
denomina estructura primaria de la
proteína. La estructura primaria
determina cómo se plegará la
proteína, lo que determinará su
función. Las formas dentro de un
polipéptido se denominan estructura
secundaria. La estructura
tridimensional de un polipéptido
completo se conoce como su
estructura terciaria.
estructura.
Figura 2
En este ejercicio utilizará el
Ensayo de Bradford para determinar el contenido proteico de dos muestras. El ensayo de Bradford es un ensayo
extremadamente sensible para proteínas. El reactivo de Bradford contiene un tinte llamado Coomassie G-250 que
puede interactuar con el grupo R de aminoácidos específicos. Una de sus muestras es la leche. La proteína
dominante en la leche se llama caseína y está compuesta por 224 aminoácidos. Trece

Biología Avanzada con Vernier 17 - 1

computadora 17

de estos aminoácidos reaccionan con el colorante en el reactivo de Bradford. Estos aminoácidos

incluyen un triptófano, cuatro argininas, cuatro tirosinas y cuatro histidinas.

Cuando el tinte en el reactivo de Bradford interactúa con estos aminoácidos específicos, la solución se vuelve azul.
Cuanto mayor sea la concentración de proteína en solución, más profundo será el color. Si se permite que un
conjunto de concentraciones de proteína conocidas reaccionen con una concentración conocida de reactivo de
Bradford, podemos medir la absorbancia de las soluciones resultantes para crear una curva estándar. Cuando un
gráfico de absorbanciacontraSi se grafica la concentración de las soluciones estándar, debería resultar una relación
directa, como se muestra en la Figura 3. La relación directa entre la absorbancia y la concentración de una solución
se conoce como la ley de Beer. Para determinar la concentración de proteína de una solución desconocida, podemos
medir su absorbancia y ver dónde cae en la curva estándar. Debido a que la relación es lineal, también podríamos
calcular la concentración de proteína usando la fórmula de la curva estándar.

En la segunda parte de este ejercicio,

comparará el reactivo de Bradford con
el reactivo de Biuret. El reactivo de
Biuret también se usa para detectar
proteínas en solución, pero no es tan
sensible como el ensayo de Bradford.
El reactivo de Biuret se volverá de color
púrpura en presencia de proteína. El
reactivo de Biuret contiene iones de
cobre que pueden interactuar con
hebras de moléculas de proteína. Estos
complejos se forman entre los enlaces
peptídicos de diferentes cadenas
polipeptídicas. Como resultado, la
intensidad del cambio de color estará
directamente relacionada con la
cantidad de proteína en la solución.

figura 3

OBJETIVOS
En este experimento, usted
-Cree una curva de proteína estándar utilizando el ensayo de Bradford.

-Determine la concentración de proteína de la leche y una bebida alta en proteína.

-Determine si el ensayo de Bradford puede detectar tanto proteínas como aminoácidos.
-Determine si el ensayo de Biuret puede detectar tanto proteínas como aminoácidos.

17 - 2 Biología Avanzada con Vernier

 Macromoléculas: experimentos con proteínas

MATERIALES
computadora seis tubos de centrífuga de 15 ml
Registrador de interfaz de Solución de triptófano al 1 %
computadora VernierPro Solución de proteína de leche sin grasa al
Colorímetro o espectrómetro+ 1% Mezcla de reactivos Biuret
Veinte cubetas de 1,5 mL con tapa* Quick Start Bradford Reactivo Solución
Micropipeta de 20–200 µL** salina tamponada con fosfato (PBS) Leche
Micropipeta de 100–1000 µL** Puntas de estándar de γ-globulina bovina (baja en
micropipeta de 200 µL (1 caja) Puntas de grasa o sin grasa)
micropipeta de 1000 µL (1 caja) Dos bebida rica en proteinas
microtubos de 1,5 mL
+ No se requiere interfaz si se usa un espectrómetro.
* Si utiliza un colorímetro, utilice cubetas de 3 ml suministradas por Vernier y duplique el volumen de todos los reactivos.
* * Se pueden sustituir por pipetas de transferencia graduadas adecuadas (1 y 5 ml).

PROCEDIMIENTO

Parte I Determinación del contenido de proteína en diferentes muestras utilizando el ensayo de Bradford

Usuarios de colorímetros y espectrómetros

1. Obtenga y use gafas y guantes.

2. Obtenga tres tubos de centrífuga de 15 ml.

- Etiqueta un tuboPBy agregar 10 ml de PBS.

- Etiquete los otros dos tubosBRy agregue 15 mL de Quick Start Bradford Reagent a cada uno.

3. Obtenga dos microtubos de 1,5 ml.

- Etiqueta un tuboMETROy agregue 980 μl de PBS. Luego agregue 20 µL de leche.

- Etiqueta el otro tuboHPy agregue 980 μl de PBS. Luego agregue 20 µL de bebida alta en proteínas.

4. Obtenga siete cubetas vacías con tapas y un juego de estándares de γ-globulina bovina para crear un nuevo
juego de estándares de proteína.

a. Llene cada cubeta con 1 ml de reactivo de Bradford.

b. Etiquete una cubeta2.0y agregue 20 µL de solución del estándar de 2,0 mg/mL. Tape la
cubeta e inviértala suavemente tres veces.
C. Etiquete la siguiente cubeta1.5y agregue 20 µL de solución del estándar de 1,5 mg/mL.
Tape la cubeta e inviértala suavemente tres veces.
d. Etiquete la siguiente cubeta1.0y agregue 20 µL de solución del estándar de 1 mg/mL. Tape
la cubeta e inviértala suavemente tres veces.
mi. Etiquete la siguiente cubeta0.75y agregue 20 µL de solución del estándar de 0,75 mg/mL.
Tape la cubeta e inviértala suavemente tres veces.
F. Etiquete la siguiente cubeta0.5y agregue 20 µL de solución del estándar de 0,5 mg/mL.
Tape la cubeta e inviértala suavemente tres veces.
gramo. Etiquete la siguiente cubeta0.25y agregue 20 µL de solución del estándar de 0,25 mg/mL.
Tape la cubeta e inviértala suavemente tres veces.
H. Etiquete la siguiente cubeta0.125y agregue 20 µL de solución del estándar de 0,125 mg/
mL. Tape la cubeta e inviértala suavemente tres veces.

Biología Avanzada con Vernier 17 - 3

computadora 17

5. Obtenga dos cubetas vacías con tapas y los microtubos etiquetados con M y HP.
a. Llene cada cubeta con 1 ml de reactivo de Bradford.
b. Etiquete una cubeta con unMETROy agregue 20 µL del microtubo M. Tape la cubeta e
inviértala suavemente tres veces.
C. Etiquete la otra cubetaHPy agregue 20 µL del microtubo HP. Tape la cubeta e inviértala
suavemente tres veces.

6. Prepare un blanco llenando una cubeta vacía con 1 mL de reactivo de Bradford y 20 µL de PBS. EtiquetaloB.
Para utilizar correctamente las cubetas, recuerde:

- Limpie el exterior de cada cubeta con un pañuelo sin pelusa. Manipule las cubetas
- solo por el borde superior de los lados acanalados. Elimine las burbujas golpeando
- suavemente la cubeta sobre una superficie dura. Coloque siempre la cubeta de
- modo que la luz pase por los lados transparentes.

Solo usuarios de espectrómetro (los usuarios de colorímetro pasan a la sección Colorímetro)

7. Use un cable USB para conectar el espectrómetro a su computadora. Elija Nuevo en el menú
Archivo.

8. Calibre el espectrómetro.
a. Coloque la cubeta en blanco en la ranura para cubetas del espectrómetro.
b. Elija Calibrar ►Espectrómetro en el menú Experimento. El cuadro de diálogo de calibración mostrará
el mensaje: "Esperando 90 segundos para que la lámpara se caliente". Después de 90 segundos, el
mensaje cambiará a "Calentamiento completo".
C. Haga clic en Finalizar calibración y permita que finalice la calibración. Hacer clic .
9. Determine la longitud de onda óptima para examinar la absorbancia del reactivo de Bradford cuando se
une a la proteína y configure el modo de recopilación de datos.

a. Retire la cubeta en blanco. Invierta suavemente la cubeta M dos veces y luego colóquela en el
espectrómetro.
b. Hacer clic . Se mostrará un gráfico de espectro completo de la solución. Tenga en cuenta que un área
del gráfico contiene una absorbancia máxima. Hacer clic para completar el análisis.
C. Almacene los datos eligiendo Store Latest Run en el menú Experiment.
d. Para configurar el modo de recopilación de datos y seleccionar una longitud de onda para el análisis, haga clic en Configurar
recopilación de datos del espectrómetro, .

mi. Seleccionar abdominalescontraLa concentración como modo de recogida de conjuntos. Se seleccionará la

longitud de onda de absorbancia máxima (-max). Verifique que la absorbancia máxima esté cerca de 595 nm.

F. IngresarConcentración de proteínacomo el nombre de la columna. IngresarPr. concentrado. como el nombre corto.

Ingresarmg/mLcomo las Unidades.

gramo. Hacer clic . Retire la cubeta del espectrómetro y continúe con el paso 10.

Solo usuarios de colorímetro

7. Conecte el colorímetro a la interfaz de la computadora. Prepare la computadora para la recolección de

datos abriendo el archivo “17 Macromoléculas” delBiología Avanzada con Verniercarpeta de registrador
Pro.

8. Abra la tapa del colorímetro, inserte el blanco y cierre la tapa.

17 - 4 Biología Avanzada con Vernier

 Macromoléculas: experimentos con proteínas

9. Para calibrar el Colorímetro, presione el botón < o > en el Colorímetro para seleccionar la longitud de onda
de 635 nm (Rojo). presione elCALIFORNIAhasta que el LED rojo comience a parpadear y luego suelte el
CALIFORNIAbotón. Cuando el LED deja de parpadear, la calibración está completa. Retire la cubeta del
colorímetro y continúe con el paso 10.

Usuarios de colorímetros y espectrómetros

10. Ahora está listo para recopilar datos de absorbancia para los siete estándares de proteínas. Haga clic en Obtener la cubeta.
con la etiqueta 2.0. Limpie el exterior con un pañuelo y colóquelo en el dispositivo (cierre la tapa si usa un colorímetro).
Espere a que el valor de absorbancia que se muestra en la pantalla se estabilice, luego haga clic en
. Ingresar2.00como la concentración, y luego presioneINGRESARo haga clic
. El par de datos que acaba de recopilar ahora se trazará en el gráfico. Eliminar el
cubeta del dispositivo.

11. Obtenga la cubeta con la etiqueta 1.5. Limpie el exterior y colóquelo en el dispositivo. Cuando el valor de
absorbancia se estabilice, haga clic en , ingresar1.50y presioneINGRESAR.

12. Repita el procedimiento del Paso 11 para los estándares de proteína restantes. Cuando haya terminado con la
solución estándar de 0,125 mg/mL, haga clic en .

13. En la Tabla 1, registre los valores de absorbancia.

14. Examine el gráfico de absorbanciacontraconcentración. Para ver si la curva representa una relación directa entre
estas dos variables, haga clic en Ajuste lineal, . Se mostrará una línea de regresión lineal de mejor ajuste para
sus puntos de datos. Esta línea debe pasar cerca oa través de los puntos de datos.

15. En la Tabla 1, registra la ecuación de esta línea en el espacio proporcionado.

16. Ahora está listo para recolectar datos de absorbancia para sus incógnitas. Obtenga la cubeta con la
etiqueta M. Limpie el exterior de la cubeta y colóquela en el dispositivo (cierre la tapa si usa un
colorímetro). Cuando el valor de absorbancia mostrado se estabilice, registre el valor en la Tabla 2.
Importante:La lectura en la pantalla es en vivo, por lo que esnonecesario hacer clic leer
el valor de absorbancia

17. Elija Calculadora de interpolación en el menú Analizar.

18. Verifique que se muestre el valor de absorbancia que registró. Si no es así, ingrese el valor de absorbancia
en el espacio correcto. Se mostrará la concentración de proteína en mg/mL. Registre el valor de
concentración en la Tabla 2. Haga clic en . Un punto en el gráfico será
mostrado para esta muestra de proteína.

19. Obtenga la cubeta etiquetada con HP. Limpie el exterior de la cubeta y colóquela en el dispositivo.
Cuando el valor de absorbancia mostrado se estabilice, registre el valor en la tabla de datos y
cálculos.Importante:La lectura en la pantalla es en vivo, por lo que esnonecesario hacer clic
para leer el valor de absorbancia.

20. Repita los pasos 17 y 18, luego continúe con el paso 21.

Parte II Comparación de reactivos de Bradford y Biuret

21. Obtenga otro tubo de centrífuga de 15 mL y etiquete el tubo conBI. Agregar 10 mL del Reactivo
Biuret.

Biología Avanzada con Vernier 17 - 5

 computadora 17

22. Obtenga otros dos tubos de centrífuga de 15 ml.

- Etiqueta un tuboNMFy agregue 4,0 mL de solución de proteína de leche sin grasa al 1%.
- Etiqueta el otro tuboPRTy agregue 4,0 mL de solución de triptófano al 1%.

23. Obtenga tres cubetas vacías con tapas.

a. Llene cada cubeta con 1 ml de reactivo de Bradford.
b. Etiquete la primera cubetaBR Ty agregue 100 μL de solución de triptófano al 1%. Tape la cubeta
e inviértala suavemente tres veces.
C. Etiquete la siguiente cubetaBR My agregue 100 µL de solución de proteína de leche sin grasa al 1%.
Tape la cubeta e inviértala suavemente tres veces.
d. Etiquete la siguiente cubetaBR Cy agregue 100 µL de PBS, el control.

24. Obtenga tres cubetas vacías más con tapas.

a. Llene cada cubeta con 1 ml de reactivo de Biuret.
b. Etiquete la primera cubetaPOCOy agregue 500 μL de solución de triptófano al 1%. Tape la
cubeta e inviértala suavemente tres veces.
C. Etiquete la siguiente cubetaB My agregue 500 µL de solución de proteína de leche sin grasa al 1%. Tape
la cubeta e inviértala suavemente tres veces.
d. Etiquete la siguiente cubetaBI Cy agregue 100 µL de PBS, el control.

DATOS Y CÁLCULOS
tabla 1

Concentración de proteína
Absorbancia
(mg/mL)

2.00

1.50

1.00

0.750

0.500

0.250

0.125

Ajuste lineal para curva estándar

_________________________

17 - 6 Biología Avanzada con Vernier

 Macromoléculas: experimentos con proteínas

Tabla 2

Concentración
concentración de proteína concentración real
Muestras Absorbancia de la etiqueta
(mg/mL) (mg/mL)
(mg/mL)

Leche

Alto en proteína

Concentraciones de proteína calculadas a partir del ajuste lineal

Leche

Alto en proteína

Tabla 3

Muestra reactivo de Bradford reactivo de biuret

triptófano

Proteína de leche sin grasa

Control

PROCESAMIENTO DE DATOS

Parte I Determinación del contenido de proteína en diferentes muestras utilizando el ensayo de Bradford

1. Determine la concentración de proteína real de sus muestras. Recuerde que diluyó sus muestras originales
de leche y alta en proteínas por un factor de 50 antes de realizar el ensayo de Bradford. Multiplique la
concentración de proteína que observó para cada muestra por 50 para obtener la concentración de
proteína real de su muestra. Registre este valor en el espacio provisto en
Tabla 2.
2. Obtenga de su instructor los valores de proteína publicados para cada muestra. Estos valores generalmente se
encuentran en las etiquetas de información nutricional del envase de la bebida de leche o proteína. Convierta los
valores publicados a mg/mL de proteína. Para ello, divide la cantidad de proteína por ración por el volumen de
cada ración. Es posible que deba convertir de onzas líquidas a ml. Escriba estos valores en el espacio provisto en
la Tabla 2.

3. Calcular la concentración real de proteína de cada muestra utilizando la fórmula de la curva

estándar. Use la absorbancia que observó para cada muestra como suyvalor y luego resolver para
X. Multiplique el valor resultante por 50 para obtener la concentración de proteína real. Escriba
estos dos números en el espacio provisto en la Tabla 2.

Parte II Comparación de los reactivos de Bradford y Biuret

4. Examine las cubetas que contienen el reactivo de Bradford de la Parte II. ¿El contenido de la cubeta se
volvió de color azul? Escriba sus observaciones en el espacio provisto en la Tabla 3.

5. Examine las cubetas que contienen el reactivo de Biuret de la Parte II. ¿El contenido de la cubeta se
volvió de color púrpura? Escriba sus observaciones en el espacio provisto en la Tabla 3.

Biología Avanzada con Vernier 17 - 7

computadora 17

PREGUNTAS
Parte I Determinación del contenido de proteína en diferentes muestras utilizando el ensayo de Bradford

1. Compare los valores de proteína que observó para cada muestra con los valores de proteína publicados.
¿Son los valores cercanos? Si no lo son, ¿puedes pensar en alguna razón por la que serían diferentes?

2. Compare sus valores de proteína observados con los valores de proteína que calculó usando la
fórmula para la curva estándar. ¿Los valores son diferentes o son iguales? ¿Hay alguna razón
por la que deberían ser diferentes?

Parte II Comparación de los reactivos de Bradford y Biuret

3. ¿El reactivo de Bradford se volvió de color azul en presencia de proteína de leche sin grasa? Si lo hiciera,
¿puede explicar por qué haría esto? ¿Qué pasa con la solución al 1% del aminoácido triptófano?
¿Reaccionó el reactivo de Bradford con este aminoácido a pesar de que no es una proteína? ¿Puedes
explicar por qué sucedería esto?

4. ¿El reactivo de Biuret se volvió de color púrpura en presencia de proteína de leche sin grasa? Si lo
hiciera, ¿puede explicar por qué haría esto? ¿Qué pasa con la solución al 1% del aminoácido
triptófano? ¿Reaccionó el reactivo de Biuret con este aminoácido a pesar de que no es una proteína?
¿Puedes explicar por qué esto sucedería o no?

5. ¿Cómo se relacionan los resultados de esta parte del ejercicio con la estructura primaria y/o
secundaria de una proteína dada?

EXTENSIONES
1. La dilución en serie es el método típico que se utiliza para crear una curva estándar. Siga las instrucciones a
continuación para crear una nueva curva estándar y luego repita la Parte I de este ejercicio. Nota:Los
nuevos estándares de proteínas no incluyen un estándar de 1,5 mg/mL.

a. Obtenga la solución de 2,0 mg/mL del conjunto estándar de γ-globulina bovina.

b. Obtenga cuatro microtubos vacíos y un microtubo con 1 ml de PBS.
C. Agregue 100 μL de PBS a cada microtubo vacío.
d. Etiqueta el primer tubo1.0y agregue 100 µl del estándar de globulina gamma de 2,0 mg/ml. Tape e
invierta el tubo tres veces.
mi. Etiqueta el siguiente tubo0.5y agregue 100 µL del tubo etiquetado como 1.0. Tape e invierta el tubo
tres veces.
F. Etiqueta el siguiente tubo0.25y agregue 100 µL del tubo etiquetado como 0.5. Tape e invierta el tubo
tres veces.
gramo. Etiqueta el siguiente tubo0.125y agregue 100 µL del tubo etiquetado como 0.25. Tape e invierta tres
veces.

2. La proteína dominante en la leche se llama caseína y está compuesta por 224 aminoácidos. Trece de estos
aminoácidos reaccionan con el tinte en el reactivo de Bradford para volver azul la solución. Su curva
estándar se basa en la proteína γ-globulina bovina, que no está compuesta por el mismo número y/o
proporción de aminoácidos. La leche en polvo descremada contiene la proteína caseína. Use la solución
de proteína de leche sin grasa de la Parte II para crear una nueva curva estándar. Su stock actual de
solución de proteína de leche sin grasa es de 10 mg/mL (1%). Diluya el caldo por un factor de 5 en PBS
para obtener una solución de 2 mg/mL. Repita los pasos en la Extensión 1 para

17 - 8 Biología Avanzada con Vernier

 Macromoléculas: experimentos con proteínas

generar su conjunto de estándares de proteínas. Luego repita la Parte I de este ejercicio y compare sus
resultados.

3. Compare el reactivo de Biuret con el reactivo de Bradford. Para hacer esto, repita la Parte I de este ejercicio
pero use el reactivo de Biuret en lugar del reactivo de Bradford. Deberá crear 1 ml de cada estándar de
proteína para crear una curva estándar. Agregue 500 µL de cada estándar de proteína a una cubeta
debidamente etiquetada y luego agregue 1 mL de reactivo de Biuret. Mida la absorbancia de cada cubeta
a 540 nm para crear su curva estándar. Determine la concentración de proteína de sus muestras
agregando 500 µL de cada muestra diluida a una cubeta y luego agregue 1 mL de reactivo Biuret. Mida la
absorbancia de cada cubeta a 540 nm. Luego use la fórmula para la curva estándar o la calculadora de
interpolación para determinar la concentración de proteína de sus muestras. Compare sus resultados
usando este método con los resultados que obtuvo usando el ensayo de Bradford.

4. Diseñe un experimento que cuantifique las diferencias cualitativas que observó en la Parte II de este
ejercicio. Puede comenzar repitiendo la Parte II de este ejercicio. Luego mida cada cubeta con la
absorbancia adecuada. Para el reactivo de Bradford medir la absorbancia a 595 nm. Para el
El regente de Biuret mide la absorbancia a 540 nm.

5. El reactivo de Bradford es un método muy sensible para determinar las concentraciones de proteínas. Diseñe un
experimento para determinar la sensibilidad de este método. Puede comenzar creando un conjunto de
estándares de proteínas que estén en el rango de 1–10 µg/mL. Cree 1 ml de cada estándar. Comience por
determinar si puede usar la misma proporción de reactivo de Bradford con respecto al estándar de proteína
para crear una curva estándar en este nuevo rango. Si no puede, intente aumentar el volumen de solución de
proteína que agrega a cada cubeta.

6. Los aminoácidos se clasifican en polares, no polares, básicos o ácidos. Esta clasificación se basa en sus grupos R o
cadenas laterales. La mayoría de los aminoácidos polares y no polares se consideran neutros.
Podemos determinar fácilmente si un aminoácido es básico, ácido o neutro usando LoggerPro, un
sensor de pH, un poco de agua destilada y un agitador magnético. Puede comenzar con los aminoácidos
arginina, tirosina y ácido aspártico.

a. Coloque un sensor de pH en 250 ml de agua destilada. Asegúrese de que la barra de agitación magnética esté girando
a una velocidad moderada.

b. Recopile datos de pH usando LoggerProy una interfaz de computadora Vernier.

C. Después de que hayan transcurrido unos segundos, agregue una cantidad muy pequeña de ácido aspártico al agua
destilada.

d. Registre el pH durante al menos un minuto.

mi. Deseche el agua destilada y luego repita el experimento para la tirosina y la arginina.
F. Determina si cada aminoácido es básico, ácido o neutro.
gramo. Compara tus resultados con la descripción de cada aminoácido en un libro de texto. ¿Sus datos
respaldan lo que está en su libro de texto?

Biología Avanzada con Vernier 17 - 9