UNIVERSIDAD REGIONAL AMAZÓNICA Ikiam

Laboratorio de Bioquímica 1
Informe N° 3

Nombre o Integrantes: Richar Fernando Sigcha Oña Fecha: 06-06-2023

Tema: Identificación de las proteínas presentes en el veneno de las serpientes Bothrops asper y
Lachesis muta mediante electroforesis SDS-PAGE.
Objetivo general
1.1. Identificar las proteínas presentes en el veneno de las serpientes Bothrops asper y Lachesis
muta mediante electroforesis SDS-PAGE, con el propósito de determinar su composición
proteica y las diferencias presentes en las mismas.
2. Objetivos específicos
2.1 Preparar las muestras de veneno de Bothrops asper y Lachesis muta para su análisis
mediante electroforesis SDS-PAGE.
2.2 Realizar la electroforesis SDS-PAGE utilizando geles de poliacrilamida y los protocolos
adecuados.
2.3 Comparar los resultados de las proteínas presentes en los venenos de las serpientes
Bothrops asper y Lachesis obtenidos en la electroforesis SDS-PAGE.
3 Introducción
Las proteínas son macromoléculas fundamentales en los seres vivos, desempeñando una amplia
variedad de funciones biológicas. Están compuestas por cadenas lineales de aminoácidos, que se
unen mediante enlaces peptídicos, además, "las proteínas son moléculas biológicas complejas y
versátiles que desempeñan roles esenciales en todos los aspectos de la vida celular y tienen una
variedad de funciones críticas para el organismo" (Nelson, D.L., Cox, M.M. Lehninger
Principles of Biochemistry, 7th ed., W.H. Freeman and Company, 2017). Las proteínas se
forman a través de un proceso conocido como síntesis de proteínas o traducción, en el cual la
secuencia de nucleótidos en un ARN mensajero (ARNm) se traduce en una secuencia específica
de aminoácidos. Durante esta síntesis, los aminoácidos se unen en una cadena polipeptídica que
se pliega en una estructura tridimensional única y funcional.
Las proteínas se pueden clasificar de diferentes formas, siendo una de las más comunes la
clasificación en función de su forma estructural:
1. Proteínas globulares: Son proteínas plegadas en una estructura compacta y esférica.
Ejemplos de proteínas globulares incluyen enzimas, hormonas y anticuerpos.
2. Proteínas fibrosas: Se caracterizan por tener una forma alargada y estructura repetitiva.
Un ejemplo de proteína fibrosa es la queratina, presente en el cabello y las uñas.
Las proteínas cumplen diversas funciones en los organismos vivos. Algunas de sus funciones
clave incluyen:
1. Enzimática: Las enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas en el
organismo, acelerando las tasas de reacción.
2. Estructural: Las proteínas proporcionan soporte y rigidez a las células y tejidos,
participando en la formación de estructuras como el colágeno en los tejidos conectivos.
3. Transporte: Algunas proteínas se encargan de transportar moléculas y sustancias a
través de las membranas celulares o en la sangre, como las proteínas transportadoras de
oxígeno, como la hemoglobina.
4. Regulación: Las proteínas pueden actuar como reguladores del metabolismo y la
expresión génica, controlando procesos celulares clave.
5. Defensa: Los anticuerpos, una clase de proteínas, son fundamentales en la respuesta
inmunológica y defensa contra agentes patógenos.
Para separar las proteínas y visualizarlas cuantitativamente se realiza mediante La electroforesis
SDS-PAGE es una técnica que utiliza un gel de poliacrilamida y el detergente SDS para separar
y visualizar proteínas según su tamaño molecular. Durante la migración electroforética, las
proteínas se separan en función de su tamaño, permitiendo analizar su composición proteica y
estimar su tamaño molecular. Esta técnica es ampliamente utilizada en investigaciones
bioquímicas y moleculares para identificar proteínas, cuantificar su presencia y obtener
información sobre su tamaño (Laemmli, 1970), este método utiliza los siguientes reactivos los
cuales son escenciales para lograr el resultado espereado:
1. Dodecil sulfato de sodio (SDS): El SDS es un detergente aniónico que desnaturaliza y
recubre las proteínas con carga neta negativa proporcional a su tamaño. Esto permite
una migración electroforética basada en el tamaño de las proteínas.
2. Buffer de carga: El buffer de carga, generalmente llamado buffer de carga de SDS-
PAGE, se utiliza para ajustar el pH de la muestra y proporcionar una conductividad
adecuada para la migración electroforética.
3. Bromofenol azul: Es un colorante utilizado como indicador de seguimiento en el SDS-
PAGE. Se añade al buffer de carga para visualizar el progreso de la migración de las
proteínas en el gel.
4. Marcador de peso molecular: Consiste en proteínas de tamaño conocido y se utiliza para
estimar el tamaño de las proteínas desconocidas en la muestra.
Las proteínas se desnaturalizan durante la electroforesis SDS-PAGE debido al tratamiento con
SDS y las condiciones de la corrida. El SDS despliega las proteínas en una conformación lineal,
rompiendo las interacciones y estructuras secundarias y terciarias. Sin embargo, vale la pena
destacar que la desnaturalización es reversible en muchos casos, lo que permite recuperar la
estructura y función nativas de las proteínas una vez finalizada la electroforesis.
La serpiente Bothrops asper, también conocida como terciopelo, es una especie de serpiente
venenosa que se encuentra en diversas regiones de América Central y del Sur. Por otro lado, la
serpiente Lachesis, también conocida como serpiente de cascabel suramericana, es una especie
de serpiente venenosa que habita en las selvas tropicales de América Central y del Sur, previos
estudios han determinado que la composición proteica de sus venenos son los siguientes:
Bothrops asper:
 Metaloproteinasa de serina (SVMP): Estas enzimas están involucradas en la
degradación de proteínas de la matriz extracelular y pueden tener efectos hemorrágicos
y necrotizantes.
 Fosfolipasa A2 (PLA2): Son enzimas que hidrolizan los fosfolípidos de las membranas
celulares, causando daño tisular y activando diversas vías inflamatorias.
 Lectinas C-type: Proteínas que se unen a carbohidratos específicos y pueden tener
efectos en el sistema inmunitario y la coagulación sanguínea.
 L-aminoácido oxidasa: Una enzima que puede causar toxicidad local y sistémica.
 Péptidos antimicrobianos: Componentes del veneno que poseen actividad
antimicrobiana y pueden ayudar en la defensa del animal.
Lachesis muta:
 Metaloproteinasa de serina (SVMP): Al igual que en Bothrops asper, las SVMP están
presentes en el veneno de Lachesis muta y están asociadas con efectos hemorrágicos y
necrotizantes.
 Fosfolipasa A2 (PLA2): Enzimas que pueden causar daño tisular y tienen actividad
proinflamatoria.
 Lectinas C-type: Proteínas que pueden tener influencia en la coagulación sanguínea y la
respuesta inmunológica.
Y sus pesos moleculares son los siguientes:
Bothrops asper:
 Metaloproteinasa de serina (SVMP): Alrededor de 20-100 kDa.
 Fosfolipasa A2 (PLA2): Alrededor de 12-15 kDa.
 Lectinas C-type: Alrededor de 15-30 kDa.
 L-aminoácido oxidasa: Alrededor de 120-140 kDa.
 Péptidos antimicrobianos: Pueden tener una amplia gama de pesos moleculares, desde
unos pocos kDa hasta más de 10 kDa.
Lachesis muta:
 Metaloproteinasa de serina (SVMP): Similar a Bothrops asper, alrededor de 20-100
kDa.
 Fosfolipasa A2 (PLA2): Alrededor de 12-15 kDa.
 Lectinas C-type: Alrededor de 15-30 kDa.
4 Materiales y Métodos
4.1 Materiales de plástico
Regla
Cinta de embalaje
4.1.1 Material de vidrio
Capilares (5)
Vaso precipitado 50mL (1)
Vidrio Reloj (1)
4.1.2 Material de metal
Placa de Aluminio TLC (1)
4.1.3 Reactivos
Triptófano 2%
Tirosina 2%
Glicina 2%
Arginina 2%
Sustancia desconocida
Ninhidrina 0.2%
4.1.4 Equipos
Brazo extractor Qalsident System
Cámara de extracción
Bomba de Vacío Fisher Technical Compañy
Calentador Magnético
4.2 Otros materiales
Lápiz (1)
Servilleta (1)
4.3 Métodos
4.3.1 Cromatografía de capa fina TLC
Primero, con ayuda de la regla se realizó dos líneas verticales dejando un espacio en los dos
bordes de 0.5 cm y se colocó 5 puntos a la misma distancia, de forma delicada como se muestra
en el Gráfico 1, se procedió a realizar el curado de los capilares utilizando servilleta,
posteriormente se coloco una gota de cada muestra en cada punto señalado (Gráfico 2), a
continuación, con ayuda de las pinzas metálicas se colocó la placa de aluminio cuidadosamente
en el vaso de precipitación con solvente y se esperó que el agua suba hasta llegar a la línea
superior (Gráfico 3) y se retiró la placa del solvente enseguida, a continuación se coloco un
poco de cinta de embalaje en la parte de atrás de la placa de aluminio para sujetarla a la
servilleta, posteriormente, con ayuda del brazo extractor se seco completamente toda la placa
(Gráfico 4), luego, se conectó la bomba de vacío con ninhidrina y se bañó la placa, finalmente
se coloco la placa en el calentador magnético a 105°C y se observo el resultado al cabo de pocos
minutos (Gráfico 5).
5 Resultados
Gráfico 1. Delimitación de los puntos con lápiz en la placa de TLC
 Gráfico 2. Curado de los capilares.

Gráfico 3. Placa dentro de la cámara que contiene la fase móvil.

Gráfico 4. Secado de la placa con el brazo extractor

Gráfico 5. Resultados obtenidos

 Rf Observaciones
Tirosina 0.63
Arginina 0.39 Mantuvo su forma inicial y
su color fue morado
Triptófano 0.73 Presento barrido de tono
rosado
Glicina 0.48 Mantuvo su forma inicial y
su color fue anaranjado
Sustancia desconocida 0.39 Mantuvo su forma inicial y
su color fue morado

6 Discusión
La cromatografía de capa fina TLC está compuesta de sílice y aluminio el cual al colocarse con
un solvente adecuado puede determinar una gran cantidad de compuestos, en este experimento
se utilizo para determinar la presencia y reconocimiento de un aminoácido cualitativamente y
cuantitativamente por medio de la tinción y el calculo del Rf, por ende la sustancia desconocida
y la arginina eran las mismas y por ende presentaron las mismas características, sin embargo en
la glicina a pesar de que mantiene su forma su coloración fue distinta, mayoritariamente sucede
este evento por reacciones internas que ocurren entre los aminoácidos, en triptófano presento un
barrido de tonalidad rosada, el barrido puede ser causado por varios factores, como la
sobrecarga de muestra, la aplicación incorrecta de la muestra en la placa o la presencia de
impurezas en la muestra. Estos factores pueden afectar la capacidad de retención de la muestra
en la fase estacionaria de la placa y provocar una difusión lateral de la muestra a medida que el
solvente se mueve. El Rf de cada sustancia determina la cantidad que se desplazo en la placa
con ayuda de la fase móvil.
7 Conclusiones
La cromatografía en capa fina (TLC) junto con el reactivo ninhidrina fue exitosa en la
identificación de aminoácidos en la muestra desconocida. Se determinó la presencia de los
aminoácidos arginina, tirosina, triptófano y glicina en la muestra, siendo la sustancia
desconocida identificada como glicina. La técnica de TLC permitió la separación de los
aminoácidos y su visualización en la placa mediante la reacción con la ninhidrina. Se logró
evaluar la separación y migración de los aminoácidos arginina, tirosina, triptófano y glicina en
la placa de sílice utilizando el solvente adecuado. Los valores de Rf obtenidos fueron 0.39 para
el triptófano y la arginina, 0.63 para la tirosina y 0.41 para la glicina. Estos valores de Rf
permitieron la identificación y caracterización de cada aminoácido en la muestra desconocida.
La reacción con el reactivo ninhidrina fue fundamental para la identificación cualitativa de los
aminoácidos presentes en la muestra desconocida. La ninhidrina reaccionó con los aminoácidos,
generando un cambio de color que permitió su visualización en la placa TLC. Mediante esta
reacción, se confirmó la presencia de arginina, tirosina, triptófano y glicina en la muestra
desconocida, siendo esta última la sustancia identificada. La combinación de la técnica de TLC
y la reacción con la ninhidrina resultó eficaz en la identificación de los aminoácidos presentes
en la muestra.
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