Taller de laboratorio de Bioquímica 5

Actividades
1. Entre al logo A y realice todas las actividades. Adjunte pantallazo que compruebe que tuvo
las respuestas correctas NO realice los ejercicios de ‘Cálculo del punto isoeléctrico’
RTA:

2. Haga click al ícono B. Ahí se abrirá el simulador

a) Investigue para que se usan las diferentes matrices cromatográficas. Están separadas en
tres grupos, debe indicar en qué situaciones se recomienda usar cada matriz
 Superdex 75: Esta matriz se utiliza para proteínas recombinantes etiquetadas con un
rango de fraccionamiento de Mr entre 3000 y 70000.1
 Superdex 200: Esta matriz se utiliza para MAbs y distintos tipos de anticuerpos con un
rango de fraccionamiento Mr entre 10000 y 600000.1
 Superosa 6: Esta matriz se utiliza para proteínas de un mayor tamaño y/o complejos
proteicos con un rango de fraccionamiente Mr entre 5000 y 50000001
 Superosa 12: Esta matriz se utiliza con eluyentes de baja fuerza ionica (<0,05 M) para
logran interacciones hidrofóbicas y lograr selectividad con lípidos, péptidos y
compuestos aromáticos de poco tamaño, Trabaja en un rango de fraccionamiento Mr
entre 1000 y 3000002
 Sephacryl 100: Esta matriz se utiliza para separar péptidos y proteínas pequeñas
(proteínas globulares de fraccionamiento 110110)3 Con un Mr entre 1×103–1×105.4
 Sephacryl 200: Esta matriz se utiliza para purificar anticuerpos, proteínas séricas y
proteínas de tamaño medio (proteínas globulares de fraccionamiento 5102.510)3 Con un
Mr entre 5×103–2.5×105.4
 Sephacryl 300: Esta matriz se utiliza para purificar anticuerpos, proteínas séricas y
proteínas de tamaño medio3 Con un Mr entre 1×104–1.5×106.4
 CM-Celulosa: Esta matriz es un intercambiador de cationes y son utilizadas como soporte
para proteínas biológicamente activas ya que no desnaturaliza dichas proteínas.5
 DEAE-Celulosa: Esta matriz es una resina cargada positivamente la cual se utiliza para
la separación y purificación de proteínas y ácidos nucleicos.6
 IR-Sepharose 4B: Esta matriz se utiliza para la purificación de alta capacidad para
proteínas de fusión glutatión-S-transferasa (GST). 7
 ConA-Sepharose 4B: Esta matriz actúa con proteínas que interaccionan específicamente
y de manera reversible con ciertos residuos de azúcares. Se utilizan para aislar y separar
glicoproteínas, glicolípidos, polisacáridos.
 Hitrap Chelating HP: es una columna cromatográfica preempaquetada con la resina
Chelating Sepharose High Performance. Esta resina contiene un ion metálico a elección
permitiendo la purificación de proteínas marcadas con polihistidina por cromatografía de
afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC). 8
 2’5’ADP-Sepharose 4B: Esta matriz se caracteriza por la retención de deshidrogenasas.9
b) Investigue de qué se compone cada uno de los 10 tampones de elución y en qué se
recomienda su uso
 Glicelina-HCl: Como su nombre lo indica este tampón está compuesto por glicerina y
acido clorhídrico y se utiliza para muestras que requieren un pH Ácido.
 Acetato: Este tampón está conformado por acido acético y acetato y se suele utilizar para
soluciones que requieren un pH no muy ácido.
 Citrato: Este tampón esta hecho de ácido cítrico, citrato de sodio y sal y se suele utilizar
para estabilizar compuestos que requieren un pH ácido casi neutro.10
 Cacodilato: Este tampón esta hecho de cacodilato de sodio y sacarosa, este se suele
utilizar para estabilizar moléculas a un pH casi neutro.11
 Hepes: Este es un tampón que se prepara sintetizando el compuesto de Hepes y
posteriormente se agraga hidróxido de sodio y una sal para ajustar el pH, este compuesto
se usa para mantener las muestras a un pH Neutro. 12
 Tris-HCl: Este tampón se prepara como su nombre lo indica utilizando Tris y
posteriormente añadiendo ácido clorhídrico hasta ajustar el pH al deseado, en este caso
7,4. 13
 Borato: Este tampón esta hecho de Tris borato y EDTA, este se utiliza para la separación
del ADN 14
 Glicina-NaOH: Este tampón está formado por glicina (aminoácido no esencial) e
hidróxido de sodio por lo cual se suele utilizar para estabilizar muestras que requieran un
pH un poco básico.
 Carbonato: Este tampón está formado por un anion carbonato y bicarbonato, se utiliza
para mantener muestras a un pH basico
 Piperidina: este tampón esta compuesto mayormente por piperidina que es un compuesto
heterocíclico no aromatico que contienen un atomo de nitrógeno y al tener un par de
electrones libres actua como báse. Se utiliza para mantener muestras a un pH Básico.
c) Investigue en qué se usa cada una de las 13 enzimas presentes en ‘proteínas componentes’
 Aprotinina: a aprotinina se utiliza principalmente durante la cirugía repetida de
derivación de arterias coronarias para reducir la cantidad de sangrado durante y después.15
 Ribonucleasa A: Es utilizada para aislar el DNA libre de RNA, también hidrolisa RNA
en los residuos C y U Cortando entre el grupo fosfato 3´.16
 Anhidrasa Carbónica: Esta enzima cataliza la conversión reversible del CO2 a
bicarbonato. 17
 Ovalbúmina y Conalbúmina: La albúmina ayuda a mantener el líquido en el interior del
torrente sanguíneo sin que se filtre a otros tejidos. También transporta varias sustancias
por el cuerpo, por ejemplo, hormonas, vitaminas y enzimas.18
 Aldolasa: Esta enzima sirve o se utiliza para descomponer algunos azucares y así producir
energía en el cuerpo humano, también se utiliza en la medicina como marcador para
enfermedades musculares.19
 Ferritina: La ferritina es una enzima natural del cuerpo la cual ayuda en medicina para
detectar la cantidad de hierro presente en el cuerpo y así determinar si existe un déficit
de este.20
 Tiroglobulina: Esta proteína es producida por la tiroides y sirve para ayudar en el
metabolismo y el cerecimiento.21
 His6-Luciferasa: Estos son compuestos bioluminicentes los cuales producen dicha luz
gracias a la oxidación asi que se puede utilizar para observar si ocurre o no una oxidación
gracias al brillo que producirá.22
 Glucosa-6P Deshidrogenasa: Esta es una enzima que mantiene la homeostasis de los
eritrocitos frente a los insultos oxidativos gracias a la producción de nicotinamida adenina
dinucleótido fosfato reducidad o NADPH.23
 Glutamato Deshidrogenasa: Esta enzima se encarga de catalizar la reacción de oxidación
del glutamato a 2 – oxoglutaeato produciendo amoniaco en el proceso.24
 Glutatión Reductasa: esta enzima se encarga de catalizar la reducción de glutatión
oxidado a glutatión reducido para posteriormente utilizarlo para la reducción del peróxido
y lipoperoxidos.25
 Fosfogluconato deshidrogenasa. Esta enzima se encarga de la producción de
nicotidamina adenina dinucleótido fosfato reducido (NADPH).26
3. Haga click en el ícono C y resuelva las 10 actividades. Nota: Si la página no le arroja
‘respuesta correcta’ y usted cree que lo está haciendo bien, señale su respuesta y lo adjunta
en el documento a entregar
RTA:
RTA: El Con A-shepharose 4 B es un una matriz cromatografica que se caracteriza por su
afinidad a capturar y o retener biomoléculas de tipo glicosidas, glicoproteínas y glicolípidos,
Ya que la triglobulina, la conalbúmina y la ovalbúmina son glicosidas dichas proteínas son
retenidas.
 ¿Qué característica comparten las proteínas que se retienen en 2’5’ADP-Sepharose 4B?
RTA: Este compuesto se caracteriza por retener deshidrogenasas por lo tanto la característica
más importante que comparten los compuestos retenidos por 2’5’ADP-Sepharose 4B es que
son deshidrogenasas.9

 Dada una mezcla de tres proteínas, A, B y C, con puntos isoeléctricos pIA = 4.2, pIB = 7.0
y pIC = 7.7, ¿podrían separarse empleando una sola cromatografía?
RTA: Si se utiliza un tampón que mantenga el pH a más o menos 7 y una matriz
cromatográfica Superdex, Superosa o sepharyl las muestras se separaran correctamente sin
retención y se podrá observar cada uno de los picos lo que significa que con una sola
cromatografía se obtendría el resultado.
Ilustración 1: Soporte de la actividad 9
4. Haga click en el ícono D
a). Adjunte 3 pantallazos de los cromatogramas obtenidos para la muestra A utilizando Muy
baja velocidad de progreso, velocidad de progreso media y velocidad de progreso alta

Ilustración 2: Muestra A con baja velocidad de progreso

Ilustración 3: Muestra A con media velocidad de progreso

Ilustración 4: Muestra A con alta velocidad de progreso

b). Adjunte 3 pantallazos de los cromatogramas obtenidos para la muestra B utilizando Muy
baja velocidad de progreso, velocidad de progreso media y velocidad de progreso alta
Ilustración 5: Muestra B con baja velocidad de progreso

Ilustración 6: Muestra B con media velocidad de progreso

Ilustración 7: Muestra B con alta velocidad de progreso

5. Haga click en el ícono E Desarrolle el experimento y determine qué aminoácidos hay en
las muestras problema 1 y 2. Adjunte pantallazo como soporte

Ilustración 8: Aminoácidos etapa 1 Fase estacionaria

Ilustración 9: Aminoácidos etapa 2 introducción en la fase móvil

Ilustración 10: Aminoácidos etapa 3 Revelado

RTA: La muestra 1 contiene Arginina, Valina y triptófano Mientras la muestra 2 tiene
Arginina, Glicina, Valina, Leucina y Triptófano
6. Haga click en el ícono F Desarrolle el experimento y determine qué aminoácidos hay en
las muestras problema 1 y 2. Adjunte pantallazo como soporte

Ilustración 11: Lípidos etapa 1 Fase estacionaria

Ilustración 12 Lípidos etapa 2 introducción en la fase móvil

Ilustración 13: Lípidos etapa 3 Revelado
RTA: La muestra 1 Contiene un fosfolípido (una fosfatidilcolina), colesterol y un
triacilglicerol (trioleoilglicerol) Mientras que la muestra 2 contiene un fosfolípido (una
fosfatidilcolina), un ácido graso (oleico) y un éster de colesterol (linoleato de colesterol).
Referencias.
1. Nueva generación de columnas de exclusión molecular (SEC) para purificación
preparativa a pequeña escala y análisis de proteínas - - GE amplía el rango de la
nueva generación de columnas SEC.
https://www.bionity.com/es/productos/128309/nueva-generacin-de-columnas-de-
exclusin-molecular-sec-para-purificacin-preparativa-a-pequea-escala-y-anlisis-de-
protenas.html.
2. Columnas de cromatografía de filtración en gel, Tricorn TM Superose TM 12 GL |
VWR. https://es.vwr.com/store/product/10616562/gel-filtration-chromatography-
columns-tricorntm-superosetm-12-gl.
3. Amazon.com: 17-0612-01 - Sephacryl S-100 HR - Sephacryl HR Gel Filtration
Media, GE Healthcare - cada uno (25.4 fl oz) - cada uno: Industrial & Scientific.
https://www.amazon.com/-/es/17-0612-01-Sephacryl-S-100-Filtration-
Healthcare/dp/B07T33HSWM.
4. HiPrep Sephacryl High Resolution columns and Sephacryl High Resolution media.
5. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO 10 grupos de estudiantes.
6. Arce Hernández, A. A., Nieuwahuys, J. & Hannema, A. J. Purificación del
componente C1s del sistema complemento y obtención de un antisuero específico.
Rev. Cuba. Hematol. Inmunol. y Hemoter. (1999).
7. Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) Medios de glutatión SepharoseTM
4B: Chromatography Ver productos | Fisher Scientific.
https://www.fishersci.es/shop/products/ge-healthcare-glutathione-sepharose-4b-
media-3/p-3667192.
8. HiTrap Chelating HP Cytiva - 5 columnas x 1 ml (17-0408-01) | CYTIVA.
https://www.lobov.com.ar/hitrap-chelating-hp-ge-healthcare-5-columnas-x-1-ml-17-
0408-01---det--17040801.
9. Alhama Carmona, J. Nuevas aplicaciones de la cromatografia de afinidad rapida a la
separacion de enzimas. (1992).
10. Citrate buffer | Lesielle. https://www.lesielle.com/int/es/citrate-buffer-446.
11. Campos Rosende, A. Metodología de la microscopía electrónica de
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Facultad de Medicina UASLP Preparación de Buffer Tris 10 mM-EDTA 1mM (TE
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https://antoniogomezmartin.wordpress.com/2012/03/08/preparacion-tbe-tae/.
15. Aprotinin. https://mychart.geisinger.org/staywel/html/Drug Sheets/26,41es.html.
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17. Agudelo R., C. D., Corena-McLeod, M. & Robledo R., S. M. Anhidrasa carbónica
de Plasmodium falciparum: Un blanco Útil para el diseño de medicamentos
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KidsHealth. https://kidshealth.org/es/parents/test-tgab-esp.html.
22. Wilson, T. & Woodland Hastings, J. Bioluminescence. Annual Review of Cell and
Developmental Biology vol. 14 197–230 (1998).
23. Bello Gutiérrez, P. & Mohamed Dafa, L. Glucose-6-phosphate dehydrogenase
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24. Vaustat, D. & Rollet, R. Glutamate dehydrogenase. Its diagnostic value in
Clostridioides difficile diarrhea. Rev. Argent. Microbiol. 50, 264–268 (2018).
25. Cisneros Prego, E. La glutation reductasa y su importancia biomédica. Rev. Cuba.
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26. Bonilla, J. F., Sánchez, M. C. & Chuaire, L. Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(G6PD): respuesta de los hematíes y otras células humanas a la disminución en su
actividad. Colomb. Med. (2007).