Cuantificasion de Morales Garduño Jose

proteinas.
Adalberto.
 Objetivos:

• Conocer métodos decuantificación

de proteínas.
• Aprender la cuantificación de
proteínas con el fin de llevar acabo
su detección
Algunos
metodos:
• Bradford
• Biuret
• Lowry
Método de Bradford

• Se basa en la unión del reactivo

ComassieblueG250 a las proteínas en
medio ácido
• Origina color azul intenso A=595nm
• Aminoácidos como arginina, triptófano,
tirosina,histidina y fenilalanina
Ventajas:

• Rápido
• Compatibilidad
• Sensible
• No existe interferencia de cationes y
carbohidratos.
• Mide proteinas alto peso molecular.
Desventajas:

• interferencia con detergentes.

• PROTEÍNA-COLORANTE puede unirse a las celdas de cuarzo.
• El color varía
• La proteína estándar debe seleccionarse con mucho cuidado
 Material:
• Epps
• Pipeta
• Reactivo de Bradford
• Espectrofotómetro de luz visible
• Poliestireno
• Las muestras más utilizadas para el ensayo
de Bradford son la albúmina de suero
bovino. (BSA) y γ-globulina bovina (BGG)
solución. También se puede utilizar
ovoalbúmina.
Procedimiento:
• Encienda el espectrofotómetro
• Lugar 1, 5, 10, 15, 20 y 30 µl (en duplicado) de un 1 mg / ml de solución
de BSA (u otra proteína utilizada como estándar – ver nota 1 debajo) en
doce tubos de microcentrífuga, y diluir a 100 µl con agua destilada (o el
tampón de solubilización de proteínas). De esta manera pones 1, 5, 10,
15, 20 y 30 µg de proteína BSA en la muestra.
• En otros dos microtubos, lugar 100 µl de cada uno de agua destilada (o el
tampón de solubilización de proteínas) usado como blanco.
• Agregar 1 mL de solución de reactivo Bradford y mezcle bien invirtiendo
los tubos. Mezclar suavemente para evitar la formación de espuma, lo
que reducirá la reproducibilidad.

• Deje reposar los tubos durante al menos 2 minutos a temperatura

ambiente y hasta una hora
• Mida la absorbancia en 595 nm usando una microcubeta (1 ml)
• Cree una curva estándar trazando la absorbancia en 595 nm contra el
contenido de proteínas (en µg).
• Pipetee muestras duplicadas que contengan 1-20 µg
en un volumen total de 100 µl en 1.5 Tubos de
microcentrífuga de polietileno de mL. Si no conoce la
concentración aproximada de la muestra, analizar un
rango de dilución (1, 1/10, 1/100, 1/1000) como en
la siguiente tabla para tener una muestra con una
absorbancia que se encuentre dentro del rango de la
calibración de la curva.
• Recuerda multiplicar el contenido de proteína
obtenido por el factor de dilución. (es decir. 1, 10,
100, 1000) al final del análisis para determinar el
contenido real de proteína.
• Agregar 1 ml de reactivo colorante
• Deje reposar los tubos durante al menos 2 minutos a
temperatura ambiente y hasta una hora
• Mida la absorbancia en 595 nm y calcule el
contenido de proteína consultando la línea de
calibración construida anteriormente..
Comentarios
• El reactivo colorante utilizado en el método Bradford reacciona principalmente con residuos de
arginina y menos con histidina., lisina, tirosina, triptófano, y residuos de fenilalanina. Obviamente,
el ensayo es menos preciso para proteínas básicas o ácidas.
• El método Bradford está sujeto, como se mencionó, a variaciones en la sensibilidad entre las
proteínas individuales. Esta variabilidad se puede reducir realizando cambios en el método. Estos
cambios requieren aumentar el contenido de tinte o el pH de la solución. Por ejemplo, el
aumento del pH mediante la adición de NaOH al reactivo permite la solubilización de las
proteínas de la membrana mejora la sensibilidad del ensayo y reduce en gran medida la variación
observada con diferentes proteínas. Sin embargo, el ensayo modificado es mucho más sensible a
la interferencia de los detergentes en la muestra.
• Para la medición de rutina del contenido de proteínas de muchas muestras, el método Bradford
puede adaptarse para su uso con un lector de microplacas. En este caso el autor redujo a 0.2 ml el
volumen total del ensayo, con el uso de volúmenes iguales de muestra y reactivo colorante
diluido.
 Método de Biuret

• Se basa en la formación de un complejo

coloreado entre el ion cúprico y los grupos
amónicos en medio alcalino, formando un
complejo Violeta.
• Esta prueba sirve para la detección de sub-
péptidos en adelante y la absorvancia del color
producido es leída a 540nm.
 Ventajas.

• Método más simple de proteínas.

• Pocas substancias no proteicas
interfieren en la reacción de biuret.
• Económico.
Desventajas:

• Presencia de sales de amonio

puede inhibir la formación de
color
• 2-4 mg de proteína por prueba
 Tubos de ensayo o falcon de 15ml

reactivo de biuret

gotero
Material: clara de huevo

50ml de leche

50 gr de milanesa o carne magra (cruda)

 • Colocar en tres tubos de ensayo
una pequeña cantidad de clara de
huevo, leche y un trozo de carne
cruda.
Procedimiento • Colocar en cada tubo de ensayo 10
gotas del reactivo de biuret.
• Observar la coloración de la
muestra.
Resultado:

• Las cadenas de proteínas presentes en la clara de huevo, la leche y la milanesa, cuando

fueron sometidas al reactivo de Biuret, que en su composición tiene NaOH al 10% (el cual
no participa de la reacción pero es de fundamental importancia su presencia ya que
proporciona el medio básico necesario) junto con el CuSO4, reaccionan con el sulfato
cúprico y se tornan de color violeta lo que nos indica que la reacción fue positiva.
Anexo Reactivos:

Reactivo de Biuret:
• Reactivo preparado del siguiente modo. Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y
6,7 g NaEDTA en 700 ml de H2O. Mientras se agita añadir 200 ml de
NaOH 5N y luego 1g de KI como estabilizante. Guardar en frasco de
plástico.
Reactivo de Bradford:
• Reactivo preparado del siguiente modo: mezclar 10 mg de Comassie
Blue G-250 con 10 ml de fosfórico al 88% y 4,7 ml de etanol absoluto.
Añadir H2O hasta 100 ml. Filtrar a través de papel de filtro y guardar en
la oscuridad.
Método de Lowry

• Combina la reacción de Biuret

con la reducción del reactivo de
follinciocalteau.
• Dos reacciones.
Ventajas y
Desventajas.
• Ventajas
• Altamente Sensible
• Mas especifico
-Desventajas
-Procedimiento mas largo
-Incompatible con detergentes y
agentes reductores
-Algunos compuestos interfieren con
el ensayo.
Gracias!