Instituto de Biologa Vegetal y Biotecnologa Bases Biolgicas y Bioqumica

Facultad de Ciencias de la Salud Odontologa

Observacin de mitocondrias, actividad catalasa de peroxisomas, respiracin celular, fermentacin alcohlica de la glucosa y Bioenergtica

INTEGRANTES: - Nadia Quinteros V. - Javier Maldonado S. - Rebeca Martnez P. - Paola Parra V. - Richard Seplveda PROFESOR: - Alejandro Vega FECHA: 09/07/2012

INTRODUCCIN Los seres vivos poseen diferentes y variadas funciones que ayudan a mantener una correcta homeostasis. Todo esto es un proceso dinmico, es decir, permanentemente se estn realizando cambios, procesos, funciones, etc., y adems se necesita energa para poder tener un orden y organizacin, por lo cual se necesitan sistemas de generacin energtica. Es por ello que es de real importancia la obtencin de la energa, la cual se puede adquirir de muchas formas, siendo los principales sistemas de generacin de energa, la Mitocondria en eucariotas, y los Cloroplastos en procariotas, para de esa manea realizar muchas de las actividades llevadas diariamente. Pero los organismos vivos poseen un metabolismo, el cual determina como se utilizar dicha energa, existiendo muchas formas de obtencin y/o degradacin de las macromolculas ingresadas con alto potencial energtico. Dichas formas son en relacin al entorno que le rodea, el que puede ser aerbico o anaerbico. La respiracin celular es un Proceso Aerbico, por lo que en el medio hay presencia de oxgeno, para de esa manera oxidar completamente la molcula orgnica (sustrato), llevndose a cabo una transformacin energtica por medio de reacciones qumicas, siendo los reactantes: O2 y Metabolito; y los productos: CO2, H2O y Energa (ATP). Este proceso consta de 4 etapas, formacin de cido Pirvico, ciclo de Krebs, cadena respiratoria y fosforilacin oxidativa. Los ltimos tres procesos se realizan dentro de la mitocondria. Existe un colorante bsico, llamado Verde de Janus, el cual reconoce la presencia de Mitocondrias. Esto se debe a que las mitocondrias poseen enzimas oxidativas, las cuales son capaces de oxidar a dicho colorante, produciendo una coloracin verde. No as fuera de la mitocondria, donde el colorante est reducido. Para evidenciar este proceso es necesario reconocer los productos de la reaccin, ya sea ATP, agua o dixido de carbono. Se espera que lo ms fcil sea evidenciar el CO2 como desecho, el cual es un anhdrido acido, por lo que acidifica la solucin en la que est presente. Este cambio puede observarse fsicamente gracias a indicadores de pH, dentro los cuales se encuentran el Naranja de Metilo (pH viraje 3,1- 4,4) Tornasol (pH viraje 6,1 7,2), Fenolftalena (pH viraje 8,3 10), etc. La Fermentacin es un es un ejemplo de Proceso Anaerbico, el cual es un proceso catablico de oxidacin incompleta que no requiere oxgeno, siendo el producto final un compuesto orgnico, teniendo reacciones qumicas que presentan reactantes: Metabolito, y productos: H2O, CO2, ATP y Etanol. Para el hombre ha sido provechoso el conocimiento y uso de este proceso metablico ya que utilizando hexosas como sustratos (glucosa y fructosa) sobre los cuales actan las

enzimas especficas producidas por microorganismos (levaduras, bacterias, etc.) han obtenido derivados alcohlicos comercializables. Es importante mencionar que estos procesos pueden ser evidenciados fcilmente en la levadura, ya que este hongo tiene la particularidad de poder realizar procesos aerbicos como anaerbicos. Todos estos proceso metablicos que se estn realizando continuamente en el organismo necesitan ser regulados y mediados por diversas enzimas, que ayudan a que ocurra una reaccin, facilitando la formacin de productos en una menor cantidad de tiempo, gracias a la disminucin de la energa de activacin. Existen gran cantidad de enzimas, de todos los tipos, pero es importante mencionar una en particular, con la cual se trabajar: La Catalasa. Esta enzima est presente en los peroxisomas presentes principalmente en el hgado y Rin, debido a que su funcin est relacionada con la detoxificacin. Los peroxisomas contienen enzimas que actan catalizando reacciones en las que se forma perxido de hidrgeno, el cual es txico, por lo que la Calasa degrada el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno gaseoso, produciendo la siguiente reaccin: Flavn Oxidasa -------------> R + H2O2 Catalasa -----------------> 2H2O + O2

R H2 + O2

2H2O2

OBJETIVOS Observar microscpicamente la presencia de Mitocondrias en levadura. Evidenciar la actividad de la catalasa en diferentes tejidos, observando diferencias significativas. Poner en evidencia el fenmeno de respiracin celular. Explicar en trminos de causas y efectos los aspectos tericos de la fermentacin alcohlica fundamentando a partir de los datos obtenidos.

MATERIALES Y MTODOS Materiales Solucin de glucosa al 5% Microscopio Porta y cubre objetos Verde de Janus al 0,001 P/V Aceite de inmersin Agua destilada Caja de Petri Papa y Rbano Trozo de Hgado y rin de cerdo o ave Agua Oxigenada (Perxido de Hidrgeno) Hojas de Afeitar Reloj o Cronmetro Fenolftalena Pajillas plsticas para refresco Solucin de NaOH al 2,5% Vaso de precipitado de 250 cc Papel de pH Bao termorregulador Termmetro 3 Tubos de ensayo 3 Tubos de hemlisis Solucin de glucosa al 1% Solucin de sacarosa al 1% Solucin de maltosa al 1%Levadura seca o granulada

Mtodos 1. Laboratorio de observacin y funcin de organelos celulares A. Observacin al microscopio de levadura 1. Sobre un porta objetos limpio se agreg dos gotas de agua y un granito de levadura, se agit hasta que la levadura estuviese bien repartida en toda el agua. 2. Se observ la estructura en el microscopio con objetivo de inmersin, posteriormente se analiz lo observado.

B. Observacin microscpica en mitocondrias 1. Se coloc en una caja de Petr 5 gotas de levadura en incubacin y se agreg una gota de colorante verde de Janus, el cual se dej actuar aprox. durante 2 minutos. 2. Luego se hizo una preparacin microscpica y se observ con el objetivo de inmersin. C. Fermentacin alcohlica de la glucosa 1. Se enumer 3 tubos de ensayo de 1 a 3 y se procedi a identificar los tubos de hemlisis. 2. Luego se aadi a cada tubo de hemlisis 2 ml de solucin de carbohidratos (tubo1 glucosa, tubo2 fructosa y tubo 3 maltosa); se agreg levadura a cada uno de los tubos (1 punta de esptula). 3. Se Introdujo los tubos de hemlisis invertidos dentro de los tubos de ensayo (campana de Durham). 4. Se coloc los tubos en una gradilla y se llev a bao termorregulador a 37 C por 30 minutos. 5. Se sac los tubos del bao termorregulador y se observ los cambios ocurridos en los tubos, luego se compar el tiempo y la intensidad del fenmeno en cada uno. 6. Se anot los resultados al final de la observacin, posteriormente se interpret los fenmenos ocurridos y se elaboraron las conclusiones. D. Actividad de la catalasa en tejidos animales y vegetales 1. En un corte fino de rbano y uno de papa se agregaron 3 gotas de H2O2. 2. En un corte fino de tejido heptico y renal se agregaron 3 gotas de agua oxigenada. 3. Se analiz las velocidades de reaccin en los cuatro tejidos considerando: 0 = no hay reaccin, 1 = muy lento, 5 = muy rpido
2. Laboratorio Bioenergtica y fermentacin alcohlica E. Bioenergtica

1. Se coloc en el vaso de precipitado 100ml de agua destilada, luego se agreg 3 gotas de fenolftalena. Despus de esto se registr en la tabla el nmero de gotas que se utiliz y se anot los cambios observados que posteriormente sirvieron de control. Se midi el pH antes y despus de agregar fenolftalena. 2. Por medio de una pajilla se sopl dentro de la solucin por 40 segundos, luego se midi el pH.

3. Despus de medir el pH se agreg NaOH en gotas hasta que la solucin volvi al color rosado de un principio. Luego se anot el nmero de gotas que se requiri para esto y se midi el pH. 4. Un miembro del grupo trot durante 2 minutos sin descansar, despus sopl por la pajilla en la solucin durante 40 segundos, con la frecuencia respiratoria que se produjo por el ejercicio. Luego se midi pH.

RESULTADOS Y DISCUSIN Resultados A, B y C A. Observacin de levaduras al microscopio Al observar al microscopio se pudo ver que eran organismos unicelulares, en donde principalmente lo que se observaba era la pared celular, adems del ncleo como un pequeo punto de un color ms intenso (figura. 1).

Figura 1. Observacin microscpica de la levadura en incubacin con objetivo de 40x.

B. Observacin de mitocondrias Se observ la presencia de muchos de estos organismos unicelulares (levaduras), en donde a la vez se vea en su interior organelos de color negro azulado, si bien no se notaba muy claramente cul era el organelo, al comparar la figura 1, con la 2 se puede apreciar que en la figura 2 exista una mayor grado de oscuridad y notoriedad de las estructuras internas de las clulas.
Figura 2. Observacin microscpica de la levadura al agregarle verde de janus con objetivo de inmersin.

C. Fermentacin alcohlica de la glucosa Para identificar cul de los azcares tuvo una mayor reaccin, se observ la presencia de burbujas en el interior de cada tubo arrojando que donde se produca mayor cantidad de burbujas era en el tubo con glucosa, luego fructosa y finalmente maltosa.

Discusin A, B, C La levadura posee una pared celular notoria, como mtodo de proteccin, debido a que es un organismo unicelular, por dicha razn la pared celular permite dar rigidez a la estructura, proporcionando de esta manera soporte a los organelos internos. A pesar que en la observacin microscpica no se observaron muchos organelos de la levadura, estas por el hecho de ser un organismo eucaritico posee una estructura bastante similar a las plantas, como vacuolas, pared celular, mitocondrias, etc. Es importante mencionar que por el hecho de tener mitocondrias, adems es capaz de realizar respiracin celular. Las levaduras como mencion anteriormente al ser organismo eucariticos poseen mitocondrias, lo anterior se comprob, ya que al agregar verde de Janus, estos organelos se tean de color negro azulado, debido a que el verde de Janus es un colorante bsico que tie mitocondrias y cuando est en presencia de oxgeno se oxida a color azul, mientras que al no haber oxgeno el indicador se reduce a rosa, por lo tanto al notar organelos de color negro azulado en el interior de las clulas se puede inferir que estamos hablando de mitocondrias, en segundo lugar se puede mencionar que estbamos en presencia de un medio aerbico, ya que a travs del colorante se detect la presencia de oxgeno y con esto a la vez podemos mencionar que las levaduras (hongos) son capaces de hacer el proceso de respiracin celular, porque debemos recordar que a estas levaduras se les haba agregado glucosa y como sabemos segn la teora para que haya respiracin celular es necesario la presencia de un sustrato (de preferencia hexosas) y 02. Sin embargo, a partir de lo realizado en el procedimiento C, se pudo comprobar que la levadura no slo es capaz de oxidar carbohidratos en presencia de oxgeno, tambin es capaz de hacerlo en un medio anaerbico y con esto logra generar los mismos productos de la respiracin celular a excepcin del etanol, para lo anterior las levaduras poseen enzimas especficas, de las cuales los humanos estamos desprovistos, por lo mismo en ausencia de oxgeno nosotros realizamos fermentacin lctica. Adems es importante mencionar que a travs de los procedimientos realizados se pudo observar que el azcar de preferencia en el proceso de fermentacin alcohlica es la glucosa, lo anterior debido a que este es un monosacrido, por lo tanto no es necesario romper enlaces para producir la fermentacin como es el caso de la maltosa, tambin es necesario considerar que el catabolismo de este azcar se hace mucho ms fcil que el de la fructosa, resultando el proceso ms espontneo, debido a las enzimas presentes en el organismo. D. Actividad de la catalasa de tejido vegetal y animal sobre agua oxigenada (H202) Al agregar H2O2 a los diferentes tejidos se producan burbujas, debido a la presencia del oxgeno gaseoso en el agua (ambos compuestos formados en la reaccin catalizada).

El siguiente grfico (Figura. 3) se muestra las velocidades de reaccin al agregar H202 a cada uno de los siguientes tejidos. Papa Rbano Hgado Rin

Las velocidades de reaccin se estimaron con velocidades de 0 a 5 en donde: 0 = no existe reaccin, 1= muy lento, 5 = muy rpido).

Figura 3. Grfica de las velocidades de reaccin de los diferentes tejidos.

Para identificar la actividad catalasa se debe tomar en cuenta que la funcin de esta enzima es tomar el perxido de hidrgeno y catalizar una reaccin que produce agua y oxgeno gaseoso, con esto pasamos de algo que es txico a compuestos que ya no lo son. En la figura 3 se puede observar que el hgado fue el tejido que tuvo mayor velocidad de reaccin, por lo tanto con lo anterior se puede inferir que es el tejido que tiene mayor actividad catalasa, esto se debe principalmente a que una de las funciones del hgado es la destoxificacin de compuestos xenobiticos, por tal motivo en estas clulas se acumulan una mayor cantidad de radicales libres, por lo tanto presenta una mayor cantidad de peroxisomas. En s al realizar el procedimiento no pudimos comprobar lo anterior, pero si pudimos comprobar que el hgado es el tejido que tiene mayor cantidad de actividad catalasa en comparacin con los otros 3 (rin, papa, rbano). Al realizar el procedimiento pudimos observar que el rin tambin tiene actividad catalasa, con lo anterior podemos suponer que al igual que el hgado presenta peroxisomas, ya que la catalasa se encuentran presente en esto organelo. La actividad catalasa de las clulas del rin es considerable, sin embargo es menor que en el hgado. La actividad

catalasa que presentan las clulas del rin se debe principalmente a que este rgano filtra la sangre, proceso en el cual tambin se producen radicales libres. Posteriormente tenemos la papa con una velocidad de reaccin mayor a la del rbano, pero menor que el hgado y el rin, con lo anterior se puede sugerir la idea de que la actividad catalasa de las clulas vegetales es menor que la de las clulas animales, por lo tanto existe una menor cantidad de enzimas catalasa, sin embargo la reaccin ocurri de todos modos, por lo tanto se puede mencionar que las clulas vegetales tambin presentan peroxisomas. La diferencia de la velocidad de reaccin entre la papa y el rbano, se debe principalmente a que el tubrculo de la planta presenta en sus clulas amiloplastos, los cuales contienen material de reserva, por lo en esta parte de una planta (tubrculo) est habiendo una mayor actividad metablica, trayendo como consecuencia la produccin de una mayor cantidad de radicales libres, por esto existe una mayor cantidad de actividad catalasa que en la papa. E. Bioenergtica Luego de tener los 75 ml de agua destilada en el vaso precipitado, y de agregarle Fenolftalena, no se logra apreciar ningn cambio en la coloracin, debido a que el pH del agua destilada es 7 y sus intervalos de cambio de color de la fenolftalena son los siguientes: pH 0 - 8,0 = Incolora; pH 8,0 - 9,8 = Rosada; pH 9,8 - 14 = Magenta. Por lo tanto se procede a agregar NaOH (Hidrxido de Sodio), la cual es una solucin bsica, ya que libera iones OH- en disolucin acuosa. As, mientras mayor sea la concentracin de esta base, mayor ser el pH; Y se puede observar claramente el cambio en el color a Rosado. Se usaron las siguientes cantidades de cada sustancia agregada y se observ el siguiente cambio de pH: 3 gotas de Fenolftalena y 3 gotas de NaOH pH incial: 7 pH final: 9 Luego de soplar, y hacer ejercicio, volviendo a soplar, se observaron los siguientes cambios: ELEMENTO Control (Sin soplar) Normal (Sin ejercicio) Despus de Ejercicio N Gotas de NaOH 3 7 10 Cambio Observado Su pH cambi de 7 a 9, luego de aadir NaOH. Su pH se torna 7 al soplar, y vuelve a 8 al aadir gotas de NaOH. Luego de soplar el pH es 7, y vuelve tornarse el pH a 9 gracias a NaOH.

Tabla resumen de datos obtenidos en exp. Bioenergtica

Es importante destacar que al mider pH, se est midiendo la concentracin de H3O+ y la adems la concentracin de OH-, y se logr gracias al indicador usado, Fenolftalena. Cuando se sopla, lo que se hace es, traspasar dixido de carbono a la solucin, debido a que es un desecho de la respiracin, pero al hacer ejercicio la cantidad de CO2 aumenta notablemente, esto se debe a que Existe una directa relacin entre consumo de O2 y produccin de CO2, debido a que algunos de los desechos de la respiracin celular son CO2 y agua. Por lo tanto cuando hay un aumento del requerimiento de O2 por ejercicio para recibir energa, se producir al mismo tiempo los desechos de la produccin de ese ATP. La reaccin formada al agregar Dioxido de Carbono al agua, es la siguiente:

CO2 + H2O H2CO3

Por tanto se forma Acido Carbnico, lo cual explica el cambio de pH observado en el cambio de coloracin, debido a que el ste acidifica la solucin, disminuyendo el pH por bajo del pH de viraje de la Fenolftalena.

CONCLUSIN En el presente experimento se pudo comprobar distintos fenmenos que son importantes para el ser humano, los cuales mantienen un buen funcionamiento corporal interno ante diversos factores que pueden alterar el equilibrio u homeostasis. Uno de los principales fenmenos es la obtencin de la energa a travs de 2 formas distintas, aerbica y anaerbica. Se pudo evidenciar la respiracin celular como ejemplo de proceso aerbico, mediante la medicin cualitativa de Dixido de Carbono, el cual es un desecho del proceso. La presencia de ste se pudo comprobar gracias al cambio de pH que se produjo en agua destilada luego de soplar con una paja. Gracias a la fenolftalena (indicador de pH) se comprob este cambio de pH, lo que muestra la existencia de CO2, el cual al mezclarse con agua forma un cido, disminuyendo el pH. Este proceso de Respiracin Celular es llevado en gran parte dentro de la mitocondria, organelo energtico por excelencia de los eucariotas. Se pudo observar la presencia de stas en la levadura, gracias a un marcador llamado Verde de Janus. Se pudo observar microscpicamente una gran cantidad de mitocondrias debido a que se les dejo en un medio con suficiente oxgeno, por lo que tenan los medios necesarios para poder dividirse, ya que al tener gran cantidad de productos, se est formando ms energa, y por lo tanto se necesitan ms mitocondrias. Los organelos oxidativos son las mitocondrias y los peroxisomas. Ambos trabajan en ambientes aerbicos haciendo diversas reacciones qumicas. De gran importancia es que las mitocondrias, mediante sus reacciones internas logran formar gran contenido de ATP que aporta a los otros componentes celulares. Sin embargo, los peroxisomas realizan oxidaciones sin la capacidad de generar ATP. El proceso de fermentacin, ejemplo de proceso anaerbico, se pudo comprobar gracias a la obtencin de algunos productos de la reaccin, como es el caso de dixido de carbono, evidencindolo como pequeas burbujas situadas en las paredes de los tubos de ensayo. En este proceso se tena el reactante, los metabolitos, los que fueron maltosa, glucosa y fructosa, de los cuales se pudo comprobar su afinidad con la levadura, es decir la reaccin ocurre ms rpido, estableciendo el siguiente orden decreciente: Glucosa, Fructosa y Maltosa. Y finalmente el proceso enzimtico, el cual regula los procesos anteriores, se trabaj y se evidenci la actividad de una enzima en particular, la Catalasa. En distintos tejidos se comprob dicha accin, evalundola en una escala de velocidad, logrando comprender su principal efecto, la destoxificacin celular. Este proceso se logr apreciar de manera fsica, gracias a uno de los productos de la reaccin ocurrida, el CO2, logrando ver burbujas en mayor y menor cantidad, que rodeaban los diferentes tejidos.

En el metabolismo de los seres humanos son liberados reactivos perxidos, los cuales son dainos para el organismo, es por esto que es muy importante la accin de los peroxisomas, encargados de degradar tales productos, mediante la enzima catalasa. Los peroxisomas se encuentran en grandes cantidades en el hgado debido a su importante accin de destoxificacin y eliminacin de sustancias inocuas. El perxido de hidrgeno es un antisptico general. Su mecanismo de accin se debe a sus efectos oxidantes: produce OH y radicales libres que atacan una amplia variedad de compuestos orgnicos, entre ellos lpidos y protenas que componen las membranas celulares de los microorganismos. La enzima catalasa presente en los tejidos degrada rpidamente el perxido de hidrgeno, produciendo oxgeno, que dificulta la germinacin de esporas anaerobias. Es importante mantener una homeostasis en nuestro organismo, ya que todos los procesos y funciones que se realizan estn interconectados entre s, todo funciona de manera acoplada y en forma dinmica, por lo que un problema pudiera afectar y alterar el equilibrio, impidiendo tener una funcin adecuada de nuestro organismo, lo cual nos impide tener una vida saludable.

REFERENCIAS - 7.3 Qu Son Los Radicales Libres? N.d. http://ocw.unican.es/ciencias-de-lasalud/biogerontologia/materiales-de-clase-1/capitulo-7.-dano-oxidativo-yenvejecimiento/7.3-bfque-son-los-radicales-libres/skinless_view, accessed July 8, 2013. - RESPIRACIN CELULAR N.d. http://www.genomasur.com/lecturas/Guia09.htm, accessed July 3, 2013. - Respiracin Celular: Fermentacin Alcohlica N.d. http://www.maph49.galeon.com/respcel/review5b.html, accessed July 7, 2013. - Introduccin Al Metabolismo N.d. http://genomasur.com/lecturas/Guia03.htm, accessed July 7, 2013. - Qu Es El Peroxisoma? | Gua Metablica N.d. http://www.guiametabolica.org/informacion/qu-es-el-peroxisoma-0?enfermedad=13, accessed July 6, 2013.