UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

INFORME DE LABORATORIO 3

EFECTOS DE LOS INHIBIDORES ENZIMÁTICOS EN PROCESOS

BIOENERGÉTICOS (COBAYOS)

Alumna:
Barreto Jiménez, María Claudia

NRC:

7968

Docente:

JEISSON DAVID CABOS SANCHEZ

PIURA, PERÚ

Fecha: 2022/07/02
 LABORATORIO N° 3
EFECTOS DE INHIBIDORES ENZIMÁTICOS EN PROCESOS
BIOENERGÉTICOS (COBAYOS) EXPERIMENTO 1. CADENA
RESPIRATORIA EN MÚSCULO DE COBAYO

A. Obtención del cofactor NAD+

1. Ponga a hervir 20 ml de agua destilada en un vaso de precipitación
2. Sacrificar un cobayo
3. Extraer enseguida los músculos de las patas y colóquelo en el vaso 5 a
10 minutos
4. Enfríe y vacíe el contenido a un mortero con 2 gramos de arena y triturar
hasta obtener una masa fina
5. Centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos
6. Separar el sobrenadante que contiene los cofactores y colóquelo en un
recipiente con hielo
B. Obtención de enzima Lactato Deshidrogenasa y componentes de la
cadena respiratoria
1. Extraer el hígado del cobayo sacrificado y homogenizarlo en un mortero
con aproximadamente 2 gramos de arena
2. Añadir 6 ml de suero fisiológico (NaCl 0.9 %) y obtenga una pasta fina
3. Añadir otros 6 ml de suero fisiológico diluyendo la pasta
4. Centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos
5. Separar el sobrenadante que contiene la enzima en un tubo y dejarlo
incubando a temperatura ambiente por 15 minutos
6. Conserve la preparación en un recipiente con hielo. Marque el tubo con E
7. Para utilizar la enzima E dilúyala con buffer fosfato pH 7.2 a razón de 1
ml de E por 4 ml de buffer
8. Con 2 ml, sin diluir de E, realice una centrifugación diferencial a fin de
obtener núcleo y mitocondrias
9. Armar el siguiente sistema:
 10. Observar los cambios en las coloraciones.

RESULTADOS:

Los cambios de coloraciones que se obtuvieron en los tubos de ensayo fueron los siguientes:

TUBO 1: Sí decolora ya que están presentes la coenzima y el sustrato.

TUBO 2: No decolora porque no hay presencia de coenzima ni sustrato.
TUBO 3: Sí hay decoloración a pesar de que no hay cofactor, en la enzima agregada hay
otros cofactores.
TUBO 4: Sí hay oxidación por lo tanto no se decolora.
TUBO 5: No hay enzima que degrade al sustrato y además que en el núcleo no
encontramos enzima de LDH, es por eso que se queda azul, ya que no hay procesos de
oxidorreducción
TUBO 6: En la mitocondria encontramos enzimas de la cadena respiratoria, por lo que hay
proceso de oxidorreducción, por eso hay decoloración
EXPERIMENTO 2. ACCIÓN DE INHIBIDORES ENZIMÁTICOS EN LA RESPIRACIÓN
CELULAR
1. Separe el corazón de un cobayo y córtelo en pequeños trozos y colóquelos en un
mortero
2. Agregue aproximadamente 2 gramos de arena y 5 ml de buffer fosfato pH 7.0 y
homogenícelo hasta obtener una pasta fina y agregue otros 5 ml de buffer fosfato
pH 7.0
3. Incube esta mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos, removiéndola con
un agitador cada 2 a 3 minutos
4. Separe el sobrenadante por centrifugación a 3000 rpm por 2 minutos y consérvelo
en un tubo sumergido en hielo. Rotular como PC (preparado de corazón)
5. Armar el siguiente sistema:

6. Mezclar los tubos. Añadir 1 ml de aceite mineral, suavemente por las paredes
7. Incubar a 37 °C por 30 minutos.
 8. Observar los cambios de color.

RESULTADOS:

Los cambios de coloraciones que se obtuvieron en los tubos de ensayo fueron los siguientes:

TUBO 1: Existe decoloración por la presencia de los procesos oxido-reducción .

TUBO 2: Sí hay decoloración porque se agregó un inhibidor que compite, por ello se
completa al 100%.
TUBO 3: En el homogeneizado del corazón si hay presencia de cofactores, por lo tanto
TUBO 4: Sí decolora a pesar de que inhibe la cadena oxidativa.
TUBO 5: Hay presencia de un metal pesado que se precipita a las proteínas, por ello no
decolora.

INTERPRETACIÓN Y DISCUSIÓN:

-El principio químico de la reacción se basa en: el succinato se deshidrogena y forma

fumarato, por la acción de una flavoproteína Deshidrogenasa succínica en la cual tendrá
unidades de FAD unidos covalentemente a residuos de histidina, esta enzima hará que se
transfieran en primer lugar dos electrones y dos protones al FAD, formando entonces FADH2.

-Estamos ante la presencia de una reacción redox, como vemos en los reactivos el succinato
se encuentra reducido y el FAD está oxidado inicialmente, cuando ocurre la conversión por la
enzima deshidrogenasa succínica hace que se pierde dos electrones de los carbonos
centrales del succinato por lo que ahora esta se oxida formando entonces, el
fumarato.
-Se pudo comprobar este proceso producido el fumarato y el FADH2 al usar el mismo
principio de redox pero con indicadores aceptores artificiales de electrones, en nuestro caso
azul de metileno.

-La reacción de azul de metileno, se basa en que capta los dos electrones del FADH2 y los
une a los nitrógenos produciendo cambio de color azul a transparente.
CONCLUSIONES:

- El azul de metileno funciona en este laboratorio como indicador redox, ya que presenta
color bien definido en cada uno de sus estados de oxidación. Éste posee en su forma
oxidada una coloración azul y al aceptar hidrógenos provenientes del sustrato origina
su forma reducida
que es incolora. Esto nos permitió ver en cuáles de los tubos hubo actividad
enzimática y cuál fue la velocidad de la reacción.

- Los tubos que poseían inhibidores demoraron más tiempo en decolorar, con esto
pudimos observar la función de un inhibidor enzimático que es la de unirse a la enzima
y disminuir su actividad. En estos tubos no observamos una ausencia de actividad
enzimática, sino que tardaron mayor tiempo en reaccionar que el tubo 2, que no
contenía inhibidor.
CUESTIONARIO

1. Haga un esquema de la cadena respiratoria con todos los complejos

2. ¿Cómo explica los resultados en el núcleo y en las mitocondrias?

- Los fragmentos son las muestras del material mitocondrial concentrado que se
puede utilizar en los procesos bioquímicos de la mitocondrias en la muestra.
- La base del método consiste en analizar una muestra de cultivos y luego separar la
parte mitocondrial a través de la centrifugación.
3. ¿Cómo actúa la coenzima?
- En la cresta mitocondrial de la cadena respiratoria de transporte de electrones la
coenzima Q se encarga de hacer el transporte de los electrones desde el complejo I y
II hasta el complejo III.
4. En el esquema de la cadena respiratoria señale el lugar de acción de los
inhibidores.
 5. Si se usa el succinato, ¿qué complejo de la cadena
respiratoria está participando?
- El succinato actúa con el complejo II de la cadena respiratoria.
6. ¿Cómo actúa el malonato?
- El maltonato actúa cuando ocurre la inhibición de una enzima que se encuentra
dentro de una vía metabólica, el sustrato se acumula ya que no se puede transformar
en un producto. Ante la presencia de este inhibidor se detiene el Ciclo de Krebs y por
lo tanto la maquinaria de producción de ATP.
7. Explique la acción del bicloruro de mercurio
- El cloruro de mercurio actúa inhibiendo, es decir, impide la acción de la enzima ya que
la catalasa no reacciona con el peróxido de hidrógeno.
8. ¿A qué nivel actúa el cianuro?
- El cianuro actúa a nivel del complejo IV o citocromo oxidasa inhibiendo y evitando que
pasen los electrones provenientes del citocromo C.
9. ¿Cuál es el rol del azul de metileno?
- El azul de metileno es un compuesto que reacciona con una molécula de agua cuando
hay presencia de un oxidante, como el oxígeno disuelto, se formará un radical oxhidrilo
OH que podrá oxidar algunas moléculas, es decir oxida algunas sustancias actuando
como un indicador redox.

Experimentos de práctica: adaptados de copias de Bioquímica de los Drs. Lezama P y

Obeso W. 2015.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. RodwelL V, Bender D, Botham K, Kennelly P, WEIL, P. Harper.

Bioquímica Ilustrada 2016