1. Lab. de biocatálisis: Det.

de proteínas y azúcares reductores

PRÁCTICA DE LABORATORIO #1: CUANTIFICACIÓN

EXPERIMENTAL DE PROTEÍNAS Y AZÚCARES REDUCTORES.
BIOCATÁLISIS 19-01
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
FACULTAD DE INGENIERÍA

OBJETIVOS:

Utilizar metodologías analíticas basadas en métodos espectrofotométricos para la cuantificación de

proteínas y azúcares reductores.

Identificar las diferencias entre los términos precisión y exactitud cuándo se llevan a cabo
experimentos en el laboratorio.

1. Introducción.

Las proteínas son compuestos esenciales para la vida. A nivel biológico cumplen diferentes papeles
en el transporte, catálisis de reacciones, protección inmunológica, crecimiento y diferenciación
celular, entre muchos otros. Estructuralmente están compuestas por aminoácidos, los cuales se unen
a través de enlaces peptídicos.

Para el estudio de las proteínas es clave el conocimiento de su composición y concentración en los

sistemas biológicos. Existe varias metodologías para la cuantificación de proteínas que van desde
métodos sofisticados y de alto costo, hasta procedimientos muy económicos y de corto tiempo.
Métodos como el de Bradford, son ampliamente utilizados debido a su fácil aplicación y
reproducibilidad.

Existen diferentes métodos de seguimiento de ensayos enzimáticos, entre ellos se encuentran

métodos del tipo directo e indirecto. Uno de los métodos más empleados del tipo indirecto en
biocatálisis es el del DNS, este se emplea con el fin de cuantificar los productos de reacción
espectrofotométricamente, específicamente azúcares reductores. El objetivo de la presente práctica,
es emplear la metodología de Bradford para cuantificar la proteína total de muestras de enzimas
comerciales y extracto de levadura; además, utilizar el método del DNS para evaluar el cambio en
la concentración de azúcares reductores.

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2. Requerimientos preliminares a la práctica.

2.1. Elabore un diagrama de flujo esquemático donde se describa el procedimiento a realizar

durante el desarrollo de la práctica. Señale los puntos críticos que considere en las diferentes etapas
del proceso.

2.2. Lea de manera comprensiva el contenido de la guía, antes de la sesión de trabajo y consulte
sobre los aspectos que no comprenda. Comparta estas inquietudes con sus compañeros y con el
docente hasta que haya claridad conceptual.

2.3. Consulte sobre la diferencia entre los términos de exactitud y precisión, y cómo se hacen los
cálculos para la preparación de soluciones.

2.4. Revise previo a la práctica de laboratorio la hoja de seguridad de los siguientes materiales: (1)
Azul de Coomasie G-250, (2) Reactivo DNS (ácido 3,5-dinitrosalicilico)

2.5. Se recomienda traer para la práctica: Sharpie, cinta de enmascarar, calculadora y tijeras.

3. Fundamento teórico.

Las proteínas son las macromoléculas más versátiles en los sistemas vivos, y desempeñan funciones
cruciales en todos los procesos biológicos. Estas funcionan como catalizadores, transportan y
almacenan otras moléculas como el oxígeno, proporcionan apoyo mecánico y protección
inmunológica, generan movimiento, transmiten impulsos nerviosos, controlan el crecimiento y la
diferenciación celular (Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L., 2002).

Todas las proteínas están formadas por monómeros llamados aminoácidos, cuya estructura está
conformada por un carbono central (carbono α) el cual en sus 4 enlaces está unido a un grupo
amino, un grupo carboxilo, un átomo de hidrógeno y una cadena lateral (R), tal como se muestra en
la Figura 1.

Figura 1. Aminoácido generalizado. (Tomado de: Mathews, Van Holde &Ahern, 2002).

Los aminoácidos, pueden unirse entre ellos de modo covalente por formación de un enlace amida
entre el grupo α-carboxilo de un aminoácido y el grupo α-amino de otro. Este enlace se denomina
enlace peptídico y los productos que se forman a partir de esta unión se llaman péptidos (Matthews
et al, 2002). Dependiendo del número de aminoácidos, los péptidos pueden tener varias
clasificaciones tales como: oligopéptidos (2-10 aminoácidos), polipéptidos (10-100 aminoácidos) y
proteínas (más de 100 aminoácidos).

Como parte esencial para el estudio de la estructura de una proteína, la actividad de una enzima o el
contenido proteínico de un alimento, es importante conocer cuantitativamente la concentración de

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las proteínas. Existen diferentes metodologías para su cuantificación, tal como se observa en la
Tabla 1; sin embargo, la selección del método adecuado para la determinación de proteínas
depende de 5 criterios: (1) Concentración de proteínas en la muestra, (2) cantidad de proteína total,
(3) especificidad de método, (4) presencia de compuestos que interfieran y, (5) facilidad y
reproducibilidad (García & Vásquez, 1998).

Tabla 1. Métodos de cuantificación de proteínas.

Longitud
Sensibilidad
Método de onda Mecanismo de acción Ventajas Desventajas
(μg)
(nm)
Reacciona directamente con
Procedimiento
aminoácidos específicos y
rápido y simple. No compatible con
Bradford 465-595 10-100 estructuras terciarias de las
Sensibilidad detergentes
proteínas. El colorante
moderada
cambia de rojo a azul.
El Cu en medio alcalino se
une a proteínas formando un
Linealidad
complejo con el nitrógeno de
limitada.
los enlaces peptídicos y la
Interferencia con
reducción en medio básico
Lowry 650-750 4-40 Alta sensibilidad detergentes o
del reactivo de Folin-
agentes reductores
Ciocalteau por los grupos
Procedimiento
fenólicos de los residuos de
lento
tirosina presentes en la
mayoría de las proteínas.
Específico para
enlaces
Reacciona con enlaces
Biuret 546 100-800 peptídicos Baja sensibilidad
peptídicos de las proteínas.
Menores
interferencias.
Específico para
enlaces
El Cu es reducido en peptídicos.
presencia de proteínas a pH Poca
elevado y el ácido interferencia.
BCA 562 5-100 Reactivos costosos
bibinconínico quela a iones Sensibilidad
de cobre formando considerable.
complejos color púrpura Adecuado para
enzimas
inmovilizadas.
Baja sensibilidad.
Absorción del enlace
Absorción 205 Procedimiento Alta interferencia,
20-1000 peptídico. Absorción de
UV 280 rápido y fácil especialmente con
tirosina y triptófano
ácidos nucleicos

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La sensibilidad depende del Costoso.

Fluorescenci número de aminas presentes Varias sustancias
390-475 0.5-50 Alta sensibilidad
a Reacciona con grupos que causan
aminos primarios interferencias
Adaptado de: García & Vásquez, 1998; Bisswanger H, 2012

Entre los métodos más utilizados para cuantificación de proteínas se encuentran la metodología de
Bradford. A continuación, se describirá el principio de funcionamiento de este método:

Método de Bradford. El reactivo azul brillante de Coomasie no reacciona químicamente con la

proteína, sino que forma un complejo estable a través de interacciones no covalentes. El azul de
Coomasie G-250 (Figura 2) es usado para estimar la cantidad de proteína en solución, esto se debe
a que la formación del complejo está acompañada de un cambio en la absorbancia entre 465-595 nm
(Whitford, 2005). Dicho complejo toma aproximadamente 2 minutos en formarse y permanece
estable por 1 hora. Este ensayo se caracteriza por ser muy reproducible y rápido, por lo que puede
ser usado para el procesamiento de un gran número de muestras (García & Vásquez, 1998).

Figura 2. Estructura de azul de Coomasie G-250 (Tomado de Whitford, 2005)

El método presenta interferencia con buffers altamente alcalinos, sin embargo, esto puede ser
contrarrestado con el uso de blancos apropiados. Tris, ácido acético, 2-mercaptoetanol, sacarosa,
glicerol, EDTA y trazas de detergentes como Triton X-100, dodecil sulfato de sodio (SDS) y
Hemosol tienen ligeros efectos que pueden ser eliminados preparando buffers adecuados. No
obstante, cuando la concentración de detergentes en la muestra es alta, se presenta una gran
interferencia. Por otra parte, reactivos como el cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de
sodio, etanol y sulfato de amonio no tienen efectos sobre el ensayo (García & Vásquez, 1998).

Entre los métodos más utilizados para la cuantificación de azúcares reductores se encuentra el
método del DNS. Este método se basa en la reducción de este compuesto (de color amarillo) por la
glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo ladrillo), cuya
presencia puede detectarse por lectura de la absorbancia en la zona de 540-570 nm (Tena Aldave,
2008), como se muestra en la Figura 3.

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Figura 3. Método del DNS para cuantificación espectrofotométrica de azúcares reductores

Otros conceptos relevantes para el desarrollo de la práctica.

La implementación de diferentes técnicas analíticas para la determinación de un compuesto

particular, en este caso, una proteína, requiere para su análisis algunos conceptos como los de
exactitud y precisión (ver Figura 4), con el fin de calificar las metodologías, ver su
reproducibilidad, y estimar qué tan alejados se encuentran los valores obtenidos experimentalmente
del valor verdadero del compuesto en la muestra determinada.

Figura 4. Exactitud y precisión. Tomado de Grech, 2013.

Exactitud (Sierra, Quintanilla & Gómez, 2009). La exactitud de un método se define como la
capacidad de dicho método para generar resultados próximos al valor real o teórico (µ). La
exactitud mide el error sistemático del método y se puede medir en términos absolutos (E a) como la
diferencia entre el valor medio obtenido con el método aplicado ( x ), tal como se expresa en la
siguiente ecuación: Ea =x−μ; o también se puede medir la exactitud en términos relativos (error
sistemático relativo, Er) como el porcentaje que representa E a respecto al valor teórico:

Ea
Er = × 100
μ

Precisión (Sierra et al, 2009). La precisión de un método, está definida como el grado de
concordancia entre los resultados obtenidos cuando un método se aplica repetidamente y desde el

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inicio, sobre distintas porciones representativas de una misma muestra. La precisión mide el error
aleatorio de un método y puede ser estimada de diferentes formas:

 Repetibilidad: Grado de concordancia entre los resultados obtenidos cuando un método es

aplicado a la misma muestra repetidas veces por un único analista en un tiempo breve.
 Precisión intermedia: Grado de concordancia entre los resultados obtenidos cuando un
método es aplicado a la misma muestra repetidas veces por un único analista en distintos
días.
 Reproducibilidad: Grado de concordancia de los resultados obtenidos cuando el método es
aplicado a la misma muestra repetidas veces por analistas y en laboratorios diferentes.

La precisión de un método puede expresarse como la desviación estándar absoluta (sd), varianza,
desviación estándar relativa (RSD) o coeficiente de variación (CV) de los resultados obtenidos. El
cálculo de cada una de ellas se realiza teniendo en cuenta las siguientes ecuaciones:

sd sd
sd=√ ∑ (x −x¿)/(n−1)¿ RSD= CV = ×100
x x

Siendo: n: número de datos y x : valor medio de los datos obtenidos

4. Seguridad durante la práctica

4.1. Equipos de protección personal.

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

 Bata de laboratorio
 Guantes de nitrilo
 Gafas de seguridad
 Zapatos cerrados

Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su
intercambio con los demás compañeros de laboratorio.

4.2. Manejo de residuos químicos y biológicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los
residuos generados en las prácticas del laboratorio en forma adecuada. Por ello el estudiante debe:

1. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los
cuales están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.
2. Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no
controladas y potencialmente peligrosas.
3. No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el desarrollo de la
práctica.

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NOTA: Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le
indicará la forma correcta de hacerlo.

5. Materiales y métodos

5.1 Materiales y reactivos

Revise que cuenta con los materiales para la elaboración de la práctica, es decir, para llevar a cabo
el método de determinación de proteínas (Bradford) y determinación de azúcares reductores
(Método DNS) (Tabla 2):

Tabla 2. Materiales y equipos requeridos para cuantificación de proteínas y azúcares reductores.

Materiales y equipos Reactivos
Eppendorf de 1.5ml (15) Generales
Tubos de 20ml (7) Extracto de levadura (0.2 gr)
Pipeta de 5 mL (1) Albumina (BSA, 5 mL): 1 mg/mL.
Micropipeta de 20-200 μL (con puntas) Proteasa comercial (0.2 gr)
Micropipeta de 100-1000 μL (con puntas) Agua destilada
Pipeteador (x1)
Beaker de 20 mL (2) Bradford
Gradilla tubos de 20ml (1) Reactivo azul de Coomasie: 20 mL
Cronómetro Reactivo DNS (ácido 3,5-
Espectrofotómetro Genesys 20* dinitrosalicilico) (5 mL)
Celdas para espectrofotómetro (15) Solución de glucosa a 2mg/ml (5ml)
Frasco lavador
Gradilla Eppendorf 1.5ml
*El espectrofotómetro será compartido entre 2 grupos. Cada mesa tendrá disponible 2 equipos para
un total de seis.

5.2 Preparación de soluciones estándar de BSA

Para la construcción de la curva de calibración de proteína, se prepararán soluciones de albúmina

(BSA) como estándar, a partir de la solución de 1 mg/mL de BSA. Para ello, se van a preparar 6
soluciones con distintas concentraciones entre 0.0-1 mg/mL, en tubos Eppendorf de 1.5 mL. Cada
una de estas soluciones tendrá un volumen final de 1000 µL, para determinar el volumen
correspondiente de agua destilada que se debe adicionar a cada Eppendorf, utilizar la ecuación 1.
Los puntos de la curva estarán dados por las concentraciones de las soluciones preparadas. La
Tabla 3, está diseñada para que cada grupo calcule el volumen de agua y de solución de BSA
requerido para la preparación de las soluciones en las concentraciones requeridas.

5.3 Determinación de proteína total por el método de Bradford

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Antes de iniciar el procedimiento para el cálculo de proteína con el método de Bradford, cada grupo
debe tomar 12 celdas para espectrofotómetro y marcarlas con las concentraciones de las soluciones
de BSA preparadas en el punto 5.2, se debe tener en cuenta que cada una de las 6 soluciones se hace
por duplicado. Luego de esto, realizar a cada muestra el siguiente tratamiento (Bisswanger, 2012):

1. Medir 100 μL de cada una de las soluciones de BSA preparadas y adicione en la celda
correspondiente de acuerdo a la marcación.
2. A cada muestra, adicionar 1.9 mL de reactivo Azul de Coomasie G-250. Luego de esto, mezcle
por reflujo haciendo uso de la micropipeta para homogenizar la solución.
3. Esperar mínimo 2 minutos para leer en el espectrofotómetro a 595 nm. Recuerde calibrar el
espectrofotómetro con el blanco (solución con concentración de BSA: 0 mg/mL). Anote los
resultados en la Tabla 4.
4. Para la medición de proteínas en las muestras problema, tome 100 μL ya sea de la muestra de
extracto de levadura o de enzima proteasa y realice por duplicado el mismo tratamiento
anteriormente descrito para medición de absorbancia. Anotar datos en Tabla 5.

5.4. Elaboración de curva de calibración de glucosa para el método DNS

Para la construcción de la curva de calibración cada grupo debe tomar 7 tubos de ensayo, se
prepararán soluciones a partir de una solución stock de glucosa de 2 mg/mL. Los puntos de dicha
curva estarán dados por las concentraciones entre 0.0-1.4 mg/mL y el volumen final de estas
soluciones será de 500 µL (usar tubos de ensayo de 20 mL). Para determinar el volumen
correspondiente de agua destilada que se debe adicionar a cada tubo de ensayo, utilizar la ecuación
1. La Tabla 6, está diseñada para que cada grupo calcule el volumen de agua destilada y de
solución de glucosa para la preparación de las soluciones en las concentraciones requeridas. Sobre
las soluciones de glucosa agregar el DNS. Una vez preparadas las soluciones de glucosa, cubrir los
tubos con papel aluminio y marcarlos con las concentraciones respectivas.

1. Agregar 500 μL de reactivo DNS a cada tubo con la solución de glucosa, agitar.
2. Calentar los tubos a una temperatura entre 94-100°C por 5 minutos.
3. Enfriar utilizando agua fría o baño de hielo durante 30s y adicionar 3.5 mL de agua destilada a
cada tubo, agitar.
4. Transferir parte del contenido de los tubos a celdas para espectrofotómetro previamente
marcadas. Leer en el espectrofotómetro a 540 nm. Recuerde calibrar con el blanco (solución
con concentración de glucosa: 0 mg/mL). Anote los resultados en la Tabla 7.
5. Elabore una gráfica de absorbancia versus concentración. Con los resultados obtenidos,
determine la ecuación de la recta y su coeficiente de correlación.

6. Resultados y discusión

6.1 Para el método de Bradford, elabore una gráfica de absorbancia versus concentración a partir
de los resultados obtenidos para las soluciones estándar de albúmina (BSA), obtenga la
ecuación de la recta y su coeficiente de correlación.
6.2 Determinar la concentración de las muestras problema utilizando la correlación lineal
obtenida con el método de Bradford.

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6.3 Teniendo en cuenta los conceptos de exactitud y precisión mencionados en la presente

práctica, cuantifique cada una de estas para el método de Bradford tomando los valores
estimados para las muestras de extracto de levadura y enzima proteasa. Tener en cuenta que la
concentración real de proteína en el extracto de levadura es 0.2-0.5 mg/ml y enzima proteasa
0.005-0.010 mg/ml.
6.4 La mayoría de los detergentes comerciales presentan en su composición enzimas para la
degradación de proteínas, carbohidratos y grasas de la ropa durante la etapa de lavado. ¿Si es
solicitada la medición de proteínas en una muestra de detergente ARIEL, que método de
cuantificación utilizaría? Justifique su respuesta.
6.5 Para el método del DNS, elabore una gráfica de absorbancia versus concentración a partir de
los resultados obtenidos para las diferentes soluciones de glucosa, obtenga la ecuación de la
recta y su coeficiente de correlación.
6.6 Usted tiene una solución de maltosa con sacarosa, y desea cuantificar la concentración total
de azúcares presentes en la muestra. Un amigo le sugiere utilizar el método del DNS,
¿seguiría la recomendación dada por su amigo? Justifique su respuesta.

7. Bibliografía

Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L (2002). Biochemistry. 5th edition. New York: W H Freeman;
Chapter 3, Protein Structure and Function. Disponible en:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21177/

Bisswanger H. (2012). Practical Enzymology (360 p). Second edition. Wiley Blackwell.

Cano H, Méndez S & Cruz J. (2013). Manual de prácticas de laboratorio de Bioquimica.

Universidad Industrial de Santander

Cooper & Hausman. (2005). La Célula. 5ª edición. Editorial Marbán, Madrid.

García H & Vázquez R. (1998). Cuantificación de proteínas: una revisión. Biotecnología, 3(2), 77-
88.

Grench P. (2013). Introducción a la ingeniería. Un enfoque a través del diseño. Editorial Pearson.
Segunda edición.

Mathews C.K, Van Holde K.E. & Ahern K.G. (2002). Bioquímica. 3ª Edición. Pearson Educación.

Sierra I, Quintanilla D & Gómez S. (2009). Análisis Instrumental (256 p). Netbiblo.

Whitford D. (2005). Proteins: Structure and Function (542 p). Wiley.

Elaborado por: M.Sc. Maria Isabel Rodriguez.

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ALUMNO: _________________________________________ CÓDIGO: ___________________

ALUMNO: _________________________________________ CÓDIGO: ___________________

DATOS DEL LABORATORIO

Tabla 3. Concentraciones de solución de albumina bovina (BSA)

Concentración de BSA
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
(mg/mL)
Volumen solución BSA (µL)
Volumen de agua destilada (µL)
Volumen total (µL) 1000 1000 1000 1000 1000 1000

Tener en cuenta la ecuación 1 para la preparación de soluciones:

C 1 ×V 1 =C2 ×V 2; siendo: C: concentración; V: Volumen. (1)

Tabla 4. Resultados de absorbancia obtenidos de soluciones de albumina con método de Bradford.

Concentración Muestra
(mg/mL) 1 2 Promedio
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0

Tabla 5. Absorbancia de muestras problema con el método de Bradford.

Extracto de levadura Enzima proteasa
Absorbancia 1
Absorbancia 2

Tabla 6. Concentraciones de glucosa para la construcción de curva de calibración de DNS.

Concentración de glucosa
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.4
(mg/mL)
Volumen stock de glucosa (µL)
Volumen de agua (µL)
Volumen total (µL) 500 500 500 500 500 500 500
Tener en cuenta la ecuación 1 para la preparación de soluciones.

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Tabla 7. Absorbancia de soluciones de glucosa (método de DNS).

Concentración Absorbancia
(mg/mL) obtenida
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.4

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Anexo 1.

Antes de la práctica: Los estudiantes deben llegar con la tabla 3 y 6 calculada, es decir, con los
volúmenes que deben medir.

Durante la práctica: El profesor debe preparar al inicio de la clase, dos muestras problema para la
medición de proteína, 10 min antes de la práctica.

Para el extracto de levadura primero se preparará una solución inicial con 0.2 g de muestra y agua
destilada hasta 200 mL y para la enzima proteasa la solución será preparada con 0.2 g de muestra
y agua destilada hasta 20 mL.

Calentar el baño a 90°C para el ensayo DNS.

La práctica debe durar 2h 30min, y se dejarán 30min para organizar y dejar limpio el laboratorio.

Al finalizar la práctica: El profesor se debe llevar una copia de los resultados experimentales (pag
10 y 11). Los estudiantes deben preparar el informe de este laboratorio, y llevar para la practica 2-7
la curva de calibración de azúcares reductores (DNS) y la curva de determinación total de proteínas
(Bradford) obtenida en la práctica 1.

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