BLOQUE I

TEMA 4. DETERMINACIÓN DE LOS COMPUESTOS

NITROGENADOS
IMPORTANCIA DEL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS
 Determinación de su actividad biológica
 Investigación de propiedades funcionales
 Composición nutricional de los alimentos
Vamos a hacer un análisis de compuestos nitrogenados cuando queremos
conocer el contenido total en proteínas, o la composición de aminoácidos de
un alimento, cuando quiero conocer el contenido de una proteína en particular,
el nitrógeno no proteico…

Principalmente las encontramos en leguminosas (soja) en el caso de productos

de origen vegetal y en productos animales. En producto lácteos secos con poca
agua, alto contenido en proteínas.

El tofu es la soja fermentada.

i. Determinación de nitrógeno total y nitrógeno proteico

A) Procedimiento Kjeldahl
Para determinar el nitrógeno orgánico total o nitrógeno proteico el método oficial
es el Kjeldahl. Consta de 3 partes:
- Digestión: ponemos en contacto nuestra muestra con ácido sulfúrico de
alta concentración y calor, y una serie de catalizadores que vienen en
forma de pastillas (selenio o cobre con sulfato potásico o sódico). Se hace
una combustión húmeda de la muestra. Todo el nitrógeno orgánico total
del alimento se transforma en sulfato de amonio. Se desprende humo.
- Neutralización y destilación: la solución de digestión se diluye con agua
y se alcaliniza con NaOH. Todo esto se hace en un destilador. Se añade
sosa a la muestra hasta que cambia de color y luego se hace una destilación
por arrastre de vapor para recuperar el amoniaco liberado anteriormente.
Para recogerlo sobre ácido bórico (no en exceso) o clorhídrico (en exceso).
NH3 + HCl (en exceso) ClNH4 + HCl (en exceso)
El exceso de HCl es lo que se recoge sobre NaOH
ClNH4 + HCl + NaOH ClNH4 +ClNa + H2O
- Titulación:
El volumen de ese ácido es el que vamos a utilizar para calcular la cantidad
total.
El volumen de ácido corregido son los mL que hemos gastado de ácido.

Lo que se obtiene es nitrógeno orgánico total, por lo que si queremos el

contenido en proteína, hay que multiplicar por un factor de corrección que
depende de la naturaleza del alimento.
El factor de obtiene considerando el % de nitrógeno que tiene una
determinada proteína y que varía con su origen (de origen animal, lácteo,
vegetal…).
6,25 por ejemplo en salchichón, procede de la mayoría de las proteínas
presente en los alimentos tiene un 16% de nitrógeno. (100/16=6,25).
6,38 en queso.
Existen métodos alternativos para analizar. Por ejemplo:
- Reactivo de Nessler: Análisis de NH3 por colorimetría. Se hace reaccionar el
amoniaco con el reactivo de Nessler, que es una sal de K, Hg y I. Se forma un
complejo coloidal amarillo muy inestable que se mide colorimétricamente a
440 nm.
- Reacción de Berthelot: Se hace reaccionar al amoniaco con una mezcla
alcalina de fenol e hipoclorito, dando lugar a indofenol que se mide a 630 nm.
Color azul, se mantiene.
VENTAJAS MÉTODO KJELDAHL
Se puede aplicar a cualquier alimento (tanto sólido como líquido). Es muy simple
y económico y muy exacto.
INCONVENIENTES MÉTODO KJELDAHL
Lo peor es la digestión porque utiliza bastante tiempo (2-2horas y media)
Es menos preciso que otros métodos. Utiliza agentes corrosivos. Determina
nitrógeno total, si queremos el proteico necesitamos un factor. Tampoco
determina el nitrógeno inorgánico.

B) Otros

- Método de Dumas (combustión)

También determina nitrógeno orgánico total, pero no el inorgánico. Si queremos
proteico también tenemos que multiplicar por el factor. Es muy rápido, pero muy
caro. En la combustión (700-800ºC) de la muestra se libera el nitrógeno gas, que
se determina en un cromatógrafo de gases.
Se puede aplicar a todo tipo de alimentos sin preparación previa, salvo en bebidas
que requieren un secado previo.
- Método de Barstein
Determinación de una proteína pura.
Se trata la muestra con sulfato de cobre en medio alcalino, entonces precipita la
fracción proteica. Este precipitado se separa por filtración, y ya es cuando se
puede determinar el nitrógeno por el método Kjeldahl.

ii. Determinación directa de proteínas, péptidos y aminoácidos

Son métodos más específicos, que determinan directamente proteínas péptidos o
aminoácidos. Se basan en aprovechar determinadas propiedades de las proteínas o
el enlace peptídico que hay entre los aminoácidos. Las proteínas están formadas
por aminoácidos que presentan distintos grupos funcionales. Estos métodos
aprovechan algún grupo funcional de algún aminoácido o la presencia del enlace
peptídico. O ambas.
- Índice de formol: se determina la cantidad de NaOH gastada en neutralizar
los protones liberados cuando hacemos reaccionar con formol una proteína. El
formol es una solución de formaldehido con agua.
Cuando adiciono formol a una solución acuosa que contiene proteína el grupo
NH2 reacciona y forma un formaldehído.
Se usa mucho en la industria de los zumos de frutas y vegetales. (En el caso
del zumo de naranja el índice de formol debe ser superior a 17 mL de NaOH
por 100 mL). Si el índice de formol fuese inferior es porque se ha añadido más
agua de la permitida en la reconstitución de zumos. Es muy sencillo y rápido.

- Métodos colorimétricos:
Todos los métodos se trabajan igual. Hay que ir haciendo una recta de
calibrado, preparar a partir de una determinada concentración diferentes
diluciones. Una de las proteínas que más se utiliza es la seroalbúmina bovina.

 Método de Biuret
Sulfato de cobre, hidróxido de sodio y tartrato sodio-potasio.
Al tratar la muestra con el reactivo de Biuret, estos iones cúpricos del reactivo
reaccionan con los enlaces peptídicos y se reducen a iones cuprosos. Esta reacción
se da en medio alcalino, porque el pH alcalino nos asegura que la cadena
polipeptídica esté desdoblada y los enlaces peptídicos sean fácilmente accesibles
para reaccionar con los iones cúpricos.
Cu2+ Cu+
Se mide la coloración púrpura-violeta que se forma por esa reacción a 540 nm.
Se aplica para determinar proteínas en carne, cereales, soja, lácteos...pero como la
leche por sí misma (la lactosa) puede reducir el cobre, se añade otro compuesto
que elimine esa acción reductora.
VENTAJAS
- Sencillo y rápido
- Menor desviación de color que el método de Lowry
- Específico
INCONVENIENTES
- Poco sensitivo
- Alta concentración de sal amónica puede interferir
- No es absoluto

 Método de Lowry
Combina la reacción de Biuret con el reactivo de Folin-Ciocalteau.
VENTAJAS
- Sensitivo
- Simple de tiempo
- Específico
INCONVENIENTES
- Puede haber variaciones de color con otras proteínas
- El color no indica proporción de proteínas
- Alta concentración de compuestos reductores interfiere

 Método de Bradford
Tinción de las proteínas con azul de Comassie. Se mide la absorbancia a 595 nm.
VENTAJAS
- Muy rápido
- Reproducible
- Más sensitivo que el método de Lowry
- No interfieren otros compuestos
- Pueden determinarse proteínas y péptidos de más de 4 KDa
INCONVENIENTES
- Puede haber variaciones de color con otras proteínas
- Condición: pH ácido
- Selección cuidadosa de la proteína estándar: seroalbúmina bovina
- No se pueden usar cubetas de cuarzo.

 Colorantes aniónicos de ácidos sulfonados

Se hace reaccionar la muestra con una cantidad de colorante en exceso. Parte del
colorante reacciona con la proteína formando un complejo insoluble y colorante
soluble, separando este último por filtración o centrifugación. Se usan colorantes
aniónicos como His, Arg, Lis.
La absorbancia es indirectamente proporcional a la concentración de proteína.
VENTAJAS
- Rápido y exacto
- No utiliza corrosivos
- No mide Nitrógeno no proteico y es más preciso que el Kjeldahl
INCONVENIENTES
- Su sensibilidad es baja
- Diferente contenido en aminoácidos básicos puede dar problemas
- Otros compuestos iónicos se pueden enlazar con las proteínas
No es uno de los que más se usa
 Reacción con ninhidrina
Reaccionan los aminoácidos, iones amonio y grupos aminos primario del
alimento con la ninhidrina. Es una reacción que tiene que darse a pH 5,5 y en
ebullición. Esta reacción, bajo esas condiciones, da lugar a un complejo púrpura
que se mide a 570 nm.
Se determina el contenido en proteínas de los alimentos y la hidrólisis de enlaces
peptídicos durante el procesado de los alimentos o para determinar
cuantitativamente aminoácidos.
VENTAJAS
- Rápido
INCONVENIENTES
- Más inconvenientes que ventajas
- Poco preciso, puede haber una sobreestimación de proteínas
- Hay que preparar una curva estándar para cada estimación

iii. Otros: Métodos espectroscópicos

Simple, reproducible y rápido. Se irradia la muestra con una luz infrarroja con una
longitud de onda específica.
CASOS PRÁCTICOS

PRINCIPIO SENSITIVIDAD RAPIDEZ

KJELDAHL Determinación de Lento
nitrógeno orgánico total
y del nitrógeno proteico
(multiplicamos por el
factor de conversión que
se calcula considerando
el porcentaje en
nitrógeno de las Baja porque son
proteínas en función de métodos muy
su origen). 3 fases generales
(digestión,
neutralización y
destilación)
DUMAS Determinación del Muy rápido
nitrógeno orgánico total
y del nitrógeno proteico
(multiplicar por el
factor) por combustión
de la muestra
LOWRY Combinación del Alta (es más Rápido
reactivo de Biuret con el específico,
de Folin entonces su
(colorimétrico) sensitividad es
mayor que la de
Biuret)
BIURET Medida de la intensidad Alta Rápido
del color púrpura-violeta
mediante la interacción
de los iones cúpricos con
los enlaces peptídicos en
medio alcalino
(colorimétrico)
COLORANTES Presencia de grupos Baja, pero más Media
ANIÓNICOS catiónicos en las alta que el de
proteínas. Medida de la Kjeldahl
cantidad de proteína de
un alimento mediante un
exceso de colorante
(colorimétrico)
BRADFORD Colorimétrico. Se hace Alta Muy rápido
una tinción con azul de
… a pH ácido
INFRAROJOS Seleccionar bandas Alta (una vez Alta (una vez
características del enlace calibrados) calibrados)
peptídico.