Análisis de alimentos

TERCER TRABAJO GRUPAL

Métodos para la determinación de Proteínas

Lectura: AA Cap 4 Nielsen Food Analysis chapter 9 Morawicki

Integrantes:
• Tineo Balcázar, Gabriela
• Paucar Ludeña, Adelí
• Huaman Meneses, Sthephany
• Maita Noel, Javier
• Tasayco Goicochea, Luis
Introducción
Se han desarrollado numerosos métodos para medir el contenido de
proteínas basándose en determinaciones de diversos factores y en
las características únicas de las proteínas y aminoácidos. Cada uno
de estos métodos difieren en su velocidad y sensibilidad, y
dependerá de la naturaleza del alimento para elegir el más
adecuado.
A continuación se presentará los metodos mas importantes.
●Método Kjeldahl: El cual se basa en la determinación del
nitrógeno
●Método Dumas: Al igual que el anterior, también se
fundamenta en la medición el nitrógeno.
●Método Espectroscopía infrarroja: Se basa en la
absorción de una longitud de onda de radiación infrarroja
específica para el enlace peptídico
●Método Biuret: Las interacciones de enlace cobre-
péptido contribuyen al análisis de este método.
●Método Lowry: Se basa en la alta o baja sensibilidad para
la baja o alta concentración de proteínas los cuales son
medidos a diferentes longitudes
●Método Unión de colorantes:Basado en la formación de
un complejo insoluble formado por la unión de las
proteínas y el tinte.
●Método Bicincónico:Se basa en la utilización el poder
reductor de las proteínas en una solución alcalina.
●Método Absorción ultravioleta de 280nm:
Se basa en la fuerte absorción de las proteínas en la región
ultravioleta debido a tirosina y triptófano.
Método Kjeldahl

El método de Kjeldahl se basa en el uso de un equipo que

digiere alimentos orgánicos con ácido sulfúrico en
presencia de catalizadores, convirtiendo el nitrógeno en
sulfato de amonio.
Esta digestión se neutraliza con álcali y se destila en una
solución de ácido bórico, posteriormente formará aniones
borato que se titulará con ácido estandarizado
convirtiéndose en nitrógeno de la muestra, lo que
representa el contenido de proteína cruda, lo que puede ser
proveniente de compuestos proteicos y no proteicos.

Los procedimientos son los siguientes:

- Preparación de muestra
- Digestión
- Neutralización y destilación
- Titulación
- Cálculos
Ventajas y desventajas
Ventajas
● El método Kjeldahl es aplicable a todo tipo de alimentos.
● Es barato si no se automatiza el método.
● Es un método preciso y oficial para determinar el
contenido de proteína cruda.
● Se modificó para que el método sea factible a cantidades
pequeñas de muestra.
Características
El método Kjeldahl se ha ido mejorando conforme el paso del
tiempo, con la adición de catalizadores metálicos como mercurio,
cobre y selenio, que se adiciona al ácido sulfúrico para una
digestión completa.
Existen también procedimientos alternativos que se hacen en lugar
de la destilación y titulación, lo que viene a ser la Nesslerización,
en donde el yoduro mercúrico está involucrado, el método es rápido
y sensible, pero su desventaja es que el color del yoduro
dimercúrico es inestable.
Desventajas
● Mide el nitrógeno orgánico total, no solo proteico.
● Es un procedimiento extenso que toma un tiempo
considerable.
● Tiene menor precisión que el método Biuret.
● Contiene reactivos corrosivos.
Aplicación
Este método es utilizado desde hace muchos años para la
determinación de nitrógeno en todo tipo de alimentos,
bebidas, carne, piensos, cereales y forrajes. Así mismo,
podría utilizarse para la determinación de nitrógeno de
aguas residuales, suelos y otras muestras. Método oficial
de la AOAC, USEPA, ISO.
Método Dumas
Ventajas Desventajas
Fundamento
Ocurre en un Costo alto.
Las muestras se queman a altas
tiempo muy Mide el
temperaturas (700-1000ºC) con un
reducido (3-7 nitrógeno total,
flujo de oxígeno puro. Todo el
minutos aprox.). no solo nitrógeno
carbono se convierte en CO2. Los
proteico
componentes que contienen
nitrógeno son: N2, y; óxidos, estos
se reducen a nitrógeno en una
columna de reducciòn de cobre a
aprox. 600ºC. El nitrògeno total Aplicación Características
(incluido nitrato y nitrito) liberado es
Adecuado para todo tipo de Modelo de combustión, destruye la
transportado por helio puro y
alimentos.Para carnes y materia orgánica.
cuantificado por cromatografía de
cereales, ya han n método Se utilizan muestra de 100- 500mg.
gases usando un detector de
establecido. Consta de cuatro etapas: combustiòn,
conductividad térmica. El nitrógeno
reducción, purificación y detecciòn de
se convierte en contenido de proteína
nitrógeno
usando el factor de conversión.
Espectroscopía infrarroja Fundamento

Mide la absorción de radiación por moléculas en alimentos.

Ventajas Desventajas
Depende del grupo funcional, el alimento absorberá diferentes
Técnica universal. Debido a su frecuencias de radiación.Es posible predecir la concentración
Espectros sensibilidad, midiendo la energía que la muestra refleja o transmite. La molécula
infrarrojos ricos en unidades atómicas comienza a vibrar de una determinada manera gracias a la energía
información. sin enlaces no que se le suministra mediante luz infrarroja.
Técnica sencilla y absorberán
Características
rápida. radiaciòn IR.
Técnica sensible. Trabaja mejor en
Basada en la espectroscopia de absorción.
Relativamente muestra puras,
Para proteínas y péptidos se aplica el infrarrojo medio o cercano.
accesible respecto a debido a que todas
Técnica simple y confiable
costos. las bandas pueden
asignarse a una Aplicaciones
única estructura
molecular. Análisis e identificaciòn de pigmentos.
Control de calidad. Mide la concentración de diversos compuestos
alimenticios.
Método Biuret Fundamento

El reactivo de Biuret se mezcla con la solución proteica y eso

Ventajas Desventajas produce un color violeta-violáceo debido a los iones cúpricos del
reactivo se complejan con las proteínas del alimento en la solución.
• Es menos costoso • No es muy sensible La absorbancia del color producido se lee a 540nm, y esta misma
que el método en comparación intensidad del color es proporcional a la cantidad de proteína del
Kjeldahl. con la reacción de alimento.
• Se puede completar Lowry.
en menos de • Las Características
30minutos.
concentraciones de
• No detecta
amonio altas El reactivo de Biuret contiene sulfato de cobre, NaOH y tartrato de
nitrógeno de un
interfieren con la sodio y potasio.
péptido o fuentes
no proteicas. reacción. Después que se mezcle debe pasar por un reposo de 15 o 30min.
• Muy pocas • La opalescencia Luego se pasa a la centrifugación, y de ahí a la lectura de la
sustancias podría ocurrir en la absorbancia.
diferentes a las solución final si
proteínas altos niveles de Aplicaciones
intervienen en la lípido o
reacción. carbohidratos están Se usa normalmente para determinar proteínas en cereales, carne y
presente. proteína de soya y como prueba cualitativa para la alimentación
animal. También se usa para determinar proteínas aisladas.
Método Lowry Fundamento

Es una combinación de la reacción de Biuret con la reacción de fenol

Ventajas Desventajas Folin-Ciocalteau (ácido fosfotúngstico y ácido fosfomolíbdico),
formando un color azulado que se lee a 750nm (baja concentración
• Es más sensible que • El color varía con de proteínas y alta sensibilidad) o a 500nm (alta concentración de
el método de Biuret. diferentes proteína y baja sensibilidad).
• Es el método menos proteínas a una
afectado por la mayor medida Características
turbidez de la que el método de
muestra. Biuret. La reacción se identifica con la tirosina y el triptófano que contienen
• Más específico que • El color no es las proteínas.
la mayoría de los estrictamente Se agrega la solución de Biuret y dejando que repose a medio
otros métodos proporcional a las ambiente por 10min.
• Relativamente es proteínas Al momento de agregar el reactivo Folin se procede a calentar la
simple, demora de 1 concentradas. muestra a 50°C por 10min.
a 1.5hrs. • La reacción se
interfiere con la Aplicaciones
variación de
sacarosa, lípidos, Debido a su alta sensibilidad, el método se aplica más en bioquímica
tampones de de proteínas, por lo que su estudio en alimentos no se hace sin antes
fosfato. extraer la proteína de la misma mezcla de alimentos.
Método de unión de colorantes

Método de unión de colorante aniónico: La muestra se
mezcla con una cantidad en exceso de colorante aniónico en
una solución tamponada, las proteínas se unen al tinte para
formar un complejo insoluble. El colorante soluble no unido
se mide después del equilibrio de la reacción y la eliminación
del complejo insoluble por centrifugación o filtración.
Método de unión de tinte Bradford: Basado en la naturaleza
anfótera de las proteínas. Cuando la solución que contiene
proteínas se acidifican a un pH menor que el punto isoeléctrico
de las proteínas, el colorante agregado se une
electrostáticamente.

Ventajas Desventajas Ventajas Desventajas

● Rápido, económico y
relacional
● Totalmente preciso
● Sin reactivos
corrosivos.
● No mide el nitrógeno no
proteico.
● Más preciso que el
método Kjeldahl.
●No es sensible.
● Se requiere una curva de
calibración para un producto
alimenticio dado.
●No es adecuado para
proteínas hidrolizadas.
●Algunos componentes no
proteicos se unen al tinte.
●Rápido
● Reproducible
● Sensible, más sensible
que el Método Lowry.
●Sin interferencia del
sulfato de amonio,
● Mide proteínas o péptidos
con moléculas masa
aproximadamente igual o
mayor a 4000Da
●Interferido por no iónicos
y iónicos detergentes.
● El complejo proteína-
colorante puede unirse al
cuarzo.
●El color varía con los
diferentes tipos de
proteínas.
Método del ácido bicinconínico (BCA)

Fundamento Aplicaciones

Las proteínas y péptidos reducen En el aislamiento y purificación de las proteínas.

los iones cúpricos a iones
cuprosos en medio básico
(similar a Biuret). El ion - Rango de sensibilidad (0.5-10 μm)
cuproso reacciona con el BCA y mayor que el método de Lowry.
forma un complejo púrpura. - El reactivo es más estable que el
Ventajas
reactivo de Lowry.
Procedimiento - El detergente no iónico y las sales
tampón no interfieren con la reacción.
1. Mezclar la solución de proteína con el
reactivo BCA. - El color no es estable.
2. Incubar a una temperatura dependiendo - Cualquier reactivo que reduzca el cobre
del resultado deseado. Mayor temperatura dirigirá el cambio de color.
Desventajas
-> mayor color. - Los azúcares reductores interfieren en
3. Lea la solución a 562 nm contra un blanco mayor medida que en el método de
4. Construya una curva estándar. Lowry.
Método de absorción ultravioleta de 280 nm

Fundamento Aplicaciones

Las proteínas muestran una fuerte absorción en la Para determinar el

región ultravioleta 280 nm debido a tirosina y contenido de
triptófano. Para ello se emplea la ley de Lambert-Beer. proteínas en leches
y productos
cárnicos.

Procedimiento
Ventajas Desventajas
1. Las proteínas se solubilizan en tampón o álcali.
2. Absorbancia 280 nm se lee contra un blanco. - Rápido y más sensible - Los ácidos nucleicos
3. La concentración se calcula por la ley de que el método de Biuret. absorben a 280 nm.
Lambert-Beer: A=abc - No interfiere el sulfato de - La turbidez en la solución
- A: absorbancia - b: Longitud de la celda amonio u otras sales del dará un falso resultado.
- a: absorción - c: Concentración. tampón. - Se requiere un sistema
- Método no destructivo. puro.
Comparación de métodos Sensibilidad y velocidad

Preparación de la muestra Sensibilidad: Los métodos de Kjeldahl, Dumas y Biuret

son menos sensibles que los métodos Lowry Bradford,
Los métodos de Kjeldahl, Dumas y espectroscopia BCA o UV.
infrarroja no requieren mucha preparación. Más aun, Velocidad: La espectroscopia infrarroja luego de ser
algunos métodos infrarrojos mas nuevos pueden realizar calibrada es la más rápida de los demás métodos.
mediciones a granos enteros sin moler o pasar por una También cabe mencionar que los métodos de
preparación de muestra. Los otros métodos descritos determinación colorimétrica como Lowry, Biuret y
requieren partículas finas. demás son más rápidos que Dumas, y este último más
rápido que Kjeldahl.
Fundamento
Aplicaciones
Los métodos de Dumas y Kjeldahl miden directamente el
contenido de nitrógeno, no obstante, Kjeldahl solo mide
El método Dumas recientemente ha reeplazado al
nitrógeno orgánico más amoníaco, en cambio Dumas
método Kjeldahl para el etiquetado nutricional debido
mide nitrógeno total más la fracción inorgánica. Otros
que a su determinación es más rápida. Sin embargo,
métodos de análisis como Biuret que mide en base a los
Kjeldahl sigue siendo el mejor para la determinación
enlaces peptídicos, o Lowry que mide la combinación
en alimentos con altos contenidos de grasas debido a
más el triptófano y la tirosina. El método infrarrojo estima
que la grasa podría generar un incendio con la
el contenido de proteínas en base a la longitud de onda de
combustión aplicada en el método de Dumas.
radiación infrarroja para el enlace peptídico de un
alimento.