Enzimas de restricción y modificación

Algunas herramientas utilizadas en

Ingeniería Genética

En im
Enzimas Vectores de clonamiento
y/o expresión
• Enzimas de restricción
• En procariontes:
• DNA polimerasas – Plasmidios
Pl d bacterianos
b
• RNA polimerasas – Bacteriófagos
• Nucleasas – Cosmidios
– BACs
BAC
• DNA ligasas
• En eucariontes
• Polinucleótido quinasa – levaduras
• F f t
Fosfatasas • derivados del plasmidio 2,
• Transcriptasas reversas • YACs
– eucariontes superiores
• virus
i
• Retrovirus
• virus-plasmidio
• plasmidios
l smidi s
 Sistemas de modificación
Restricción:: mecanismo de defensa de
Restricción
las bacterias contra DNA invasor
Par
endonucleasa + metilasa

de la misma especificidad
(reconocen la misma
s
secuencia)
n i )

1) ER debe cortar la secuencia que contiene el sitio de

restricción y no en secuencias que
q no lo contienen.
2) ER no deben romper el DNA del huésped
Sistema de modificación-
modificación-restricción
EcoRI
Eco RI (en E. coli)
coli)
 Hidrólisis del enlace fosfodiéster
Hidró
por enzimas de restricció
restricción

5’ 5’
5

3’ 5
3’
Tipos de endonucleasas

 Endonucleasa Tipo I – corta lejos de la

sucuencia que reconoce,
reconoce ya sea río arriba o
río abajo.
 Endonucleasa Tipo II – cortan dentro de la
secuencia que reconocen.
 Endonucleasa Tipo
p III – cortan de 5-8
bases antes o después de la secuencia que
reconocen.
 Tres sistemas de sistemas de modificación restricción
TIPO II TIPO I TIPO III

endonucleasa y Enzima Bifuncional Enzima Bifuncional de

metilasa
til son d 3 subunidades,
de b id d 2 subunidades
b id d MS
proteínas separadas R, M y S (2:2:1) y R

sitio de recon.
recon Sitio de Recon.
Recon Sitio de Recon.
Recon
Palíndrome corto de bipartito, secuencia
4-8 pb, la misma asimétrico asimétrico = 5-7
sec para R y M secuencia = 5
5-77 pb pb
Rompe en el sitio de Rompe DNA a ~100- Rompe 24-26 pb río
reconoc. Produce 1000 bases de abajo del sitio de
extremos romos o distancia del sitio reconoc Corte
reconoc.
cohesivos, dentro de reconoc, al escalonado 2-4
del sitio de recon. azar. bases apart.
R y M pueden
d R y M ocurren
R y M actúan por
competir o ser simultáneamente y
separado
exclusivos pueden competir.
No se requiere ATP Se requiere ATP para Se requiere ATP para
para la restricción la restricción la restricción
 Enzimas de restricción

 Son endonucleasas específicas capaces de reconocer

secuencias palindrómicas de ADN y cortar los enlaces
fosfodiéster en un punto específico.
 Palindrómicas quiere decir que leen igual en las dos hebras

5’ G T T A A C 3
5 3’
3’ C A A T T G 5’
Ejemplo: (específico para las de Tipo II)

1) Ambas cadenas metiladas no hay ni metilación ni restricción

CH3 CH3
5´---- GAATTC ---- 3´ M.EcoRI
5´---- GAATTC ---- 3´
3´---- CTTAAG ---- 5´ 3´---- CTTAAG ---- 5´
R.EcoRI
CH3 CH3

2) Sólo una cadena metilada hay metilación y no restricción

CH3
5´---- GAATTC ---- 3´ M.EcoRI
5´---- GAATTC ---- 3´
3´---- CTTAAG ---- 5´ 3´---- CTTAAG ---- 5´
R.EcoRI
CH3 CH3

3) Ninguna cadena metilada no hay metilación, sí restricción

5 ---- GAATTC ---- 3

5´ 3´ M.EcoRI 5 ---- G
5´ AATTC ---- 3
3´
3´---- CTTAAG ---- 5´ 3´---- CTTAA G ---- 5´
R.EcoRI

El sistema R-M funciona como un sistema “inmune”

• Mecanismo para resistir el ataque viral
• Permite a la bacteria distinguir entre DNA propio y DNA foráneo:
 las ER digieren al DNA foráneo no metilado
 y protegen DNA propio por metilación 9
Enzimas de restricción

 Son suceptibles a cambios en temperatura, pH,

etc.
etc
 Se obtienen de células bacterianas.
 Sus
S nombresb d i
derivan d l género
del é y de
d la
l
especie de la bacteria de dónde se aislaron por
primera vez.
vez
 La primera letra representa el género de la
bacteria las próximas dos indican la especie,
bacteria, especie la
cuarta letra indica la cepa y el número al final
indica el número de enzima que se ha aislado de
esa cepa.
Enzimas de restricción

 Ejemplo:
E R
EcoRI
Primera enzima aislada
g
de ese organismo
Escherichia coli
(género) (especie) cepa R
 Otros ejemplos:
 BamHI – la primera que se aisló de la cepa H de
Bacillus amyloliquefaciens
 SmaI – la primera que se aisló de Serratia
marcesens
 HindIII – la tercera que se aisló de la cepa d de
Haemophilus influenzae
 Ti
Tipos d
de corte
t
 Generan extremos
G t
cohesivos

 EcoRI
 Bam HI
 HindIII

 Generan extremos
“Blunt”
Blunt o romos

 S I
SmaI
 Tipos de extremos generados por las
enzimas de restricción

Extremos cohesivos

Extremos 3’ protuberantes Extremos 5’ protuberantes

(o 5´ recesivos) (o 3´ recesivos)

Extremos romos
 Cómo generar nuevas secuencias de corte

1- Corte, filling in/trimming back, religación:

Filling in (5’ protruyente)

EcoRI
5´---- GAATTC ---- 3´ 5´---- G AATTC ---- 3´
3´---- CTTAAG ---- 5´ 3´---- CTTAA G ---- 5´

fill in (con DNApol +

dNTPs)
ligasa
5´---- GAATTAATTC ---- 3´ 5´---- GAATT AATTC ---- 3´
3´---- CTTAATTAAG ---- 5´ 3´---- CTTAA TTAAG ---- 5´

XmnI (GAANN/NNTTC)

Trimming back (3’protruyente)

PstI
5´---- CTGCAG ---- 3´ 5´----CTGCA G ---- 3´
3´----
3 ---- GACGTC ---- 5
5´ 3´----G
3 G ACGTC ---- 5
5´

3´-5´exonucleasa

5´----C G ---- 3´
3´----G C ---- 5´

Ligados entre sí o a otros

fragmentos con extremos romos 14
Isoesquizómeros:
Son distintas ER que reconocen la misma secuencia,
secuencia generalmente con distintas especificidades
especificidades. Pueden generar:
los mismos extremos: Acc65I y KpnI

5´----GGTACC ---- 3´ 5´----G GTACC ---- 3´

3´----CCATGG ---- 5´ 3´----CCATG
3´ CCATG G ---- 5´

distintos extremos:

SmaI
5´----CCCGGG ---- 3´ 5´----CCC GGG ---- 3´
3´----GGGCCC ---- 5´ 3´----GGG CCC ---- 5´

XmaI
5´----CCCGGG ---- 3´ 5´----C CCGGG ---- 3´
3´----GGGCCC ---- 5´ 3´----GGGCC C ---- 5´

ER que reconocen distintas secuencias, pero dejan los mismos extremos:

BamHI
5´----GGATCC ---- 3´ 5´----G GATCC ---- 3´
3´----CCTAGG ---- 5´ 3´----CCTAG G ---- 5´

BglII
5´----AGATCT ---- 3´ 5´----A GATCT ---- 3´
3´----TCTAGA ---- 5´ 3´----TCTAG A ---- 5´
Otras características de las ER tipo II
• Existen algunas ER que aceptan substituciones en una o más posiciones
en su secuencia de reconocimiento. Sitios de reconocimiento son
degenerados.
Ej HincII GTPyPuAC
MaeIII GTNAC
Py= Pirimidinas (T, C); Pu= purinas (A,G); N= cualquier base

• Diferentes ER pueden reconocer la misma secuencia

– Isosquisómeros
I i ó

Sma I (Serratia marcescens SB)

CCC^GGG

Xma I (Xanthomonas malvacaerum)

C CCGGG
C^CCGGG

PspAI (Pseudomonas species)

C^CCGGG
 Frecuencias de corte por ER
(en
( un DNA 50 % GC)
GC)

• La mayoría de las ER reconocen secuencias de

entre 4 y 6 pb.
pb

La p
probabilidad que
q se encuentre una secuencia de
4 nc en el DNA es ([1/4]4) = 1 en 256 pb.
Una secuencia de 6 nc = ([1/4]6) = 1 en 4.096 pb.

• Otras ER reconocen secuencias más largas (hasta

8ppb.)) Un sitio de reconocimiento de 8 pb
p ocurrirá
con una frecuencia de aproximadamente 1 en
65.536 bases ([1/4]8)
 Usos de las enzimas de
restricción
 Permiten desarrollar técnicas de clonado.

 Permiten realizar mapas de restricción y

determinar si existe homología entre
moléculas de DNA.
Aplicaciones de
enzimas de restricción
en la formación de
moléculas de DNA
recombinantes
Electroforesis

 Es el movimiento de
partículas de carga
en un campo
eléctrico a través
de un medio
semisólido.

 Los medios más

utilizados son
agarosa y
p
poliacrilamida.
El t f
Electroforesis
i
 El ADN tiene carga
negativa, por lo que
l s partículas
las p tí l s migran
mi n
del electrodo
negativo
g ((cátodo)) al
electrodo positivo
(ánodo).

 Esta migración es
inversamente
proporcional al
tamaño molecular de
l s muestras.
las mu str s
Electroforesis

 Materiales necesarios
para llevar a cabo una
electroforesis:
l t f i
 Gel de agarosa –
generalmente
eneralmente se utiliza
de 1% - 2% de agarosa.
 Cuba de
electrophoresis:
contiene los electrodos
 Fuente de poder:
genera el campo
eléctrico
 Electroforesis
 Solución amortiguadora de
electroforesis - usualmente
TBE 1X; facilita la migración de
ADN y mantiene una estabilidad
 Colorante como el bromuro de
etidio – compuesto carcinógeno
que se entrecruza
t entre
t l
las
moléculas de DNA y cuando se
irradia con luz ultravioleta
emite fluorescencia.
 Usos en el laboratorio

Generar fragmentos de DNA de tamaño definido para:

• generar moléculas recombinantes: clonado

NcoI HindIII
NcoI HindIII
Digestión con
ER
Fragmento
amplificado
Yep51
p
p +

Ligaci
ón

•Screening
Screening de transformantes por ER

Digestión
con
HindIII

Calle1: markers (23.13, 9.42, 6.55,

4.36, 2.32, 2.07 y 0.56 kpb)
Calle2: vector digerido sin inserto 24
Calle3: vector con inserto digerido
(digestión completa)
M
Mapa d
de
restricción del
f
fago llambda
bd
 MAPAS DE RESTRICCIÓN

 Aplicación de los mapas de restricción: polimorfismos de longitud de los 
fragmentos de restricción (RFLP), valiosos para el diagnóstico de 
enfermedades hereditarias.
MAPAS DE RESTRICCIÓN

 Digestión del plásmido pAgK84 con:
• BamHI (A)
• PstI (B)
• BglII (C)

NRH
• HaeIII (D)
• HincII (E)
( )
• SacI (F)
• XbaI (G)
XbaI (G)
• HpaI (H)

A li • ió
Carril
Carril I: fragmentos de DNA de tamaño 
d I:l fragmentos
d de DNA de tamaño
 Aplicación de los mapas de restricción: 
i ió
conocido
polimorfismos de longitud de los fragmentos 
de restricción (RFLP), valiosos para el 
diagnóstico de enfermedades hereditarias.
 MAPAS DE RESTRICCIÓN

 Aplicación de los mapas de restricción: polimorfismos de longitud de los 
fragmentos de restricción (RFLP), valiosos para el diagnóstico de 
enfermedades hereditarias.
 Vectores de clonación

 Los vectores de clonación son moléculas pequeñas de DNA que se replican 
de manera autónoma

 Tipos de vectores
• Plásmidos
 moléculas de DNA circular que se encuentran en bacterias o 
lé l d DNA i l b i
levaduras
 se pueden clonar fragmentos de DNA de no más de 10 kpb 
• Bacteriófagos
 fagos que infectan bacterias
 se pueden clonar fragmentos de DNA de hasta 16 kpb
d l f d DNA d h 16 k b

• Cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y de levaduras (YAC)
 se pueden clonar fragmentos de DNA de hasta varios cientos de 
d l f t d DNA d h t i i t d
kpb
 Vectores de clonación

 PLÁSMIDOS
Á

Componentes básicos de un vector de clonación plasmídico

ori (origen de replicación)
HindIII
PstI
SalI
BamHI
SmaI
SacI
EcoRI ampr (marcador de selección)

Policonector 
(“polylinker”) Región donde 
R ió d d
se puede 
insertar el 
DNA extraño
 Vectores de clonación
 PLÁSMIDOS
Estructura y componentes del plásmido pUC18 (plásmido de clonación universal)

 Policonector: 
contiene 13 sitios de 
restricción únicos

 3 genes: permiten la selección de clones 
recombinantes
ampR: resistencia a la ampicilina
LacZ: ‐galactosidasa
l l d d l ió d
Enzimas utilizadas en Ingeniería
g Genética
 DNA pol I de E. coli

Fragmento Klenow

Klenow H and Henningsen I "Selective Elimination

off the
th Exonuclease
E l Activity
A ti it off the
th Deoxyribonucleic
D ib l i
Acid Polymerase from Escherichia coli B by Limited
Proteolysis" Proc Natl Acad Sci vol. 65 pp. 168
(1970).
 Usos de DNA polimerasa I de E.
E coli

• Síntesis
í de DNA de doble
l hebra
h desde
moldes de DNA de hebra simple
p
• “Rellenado” de extremos 3´recesivos de
fragmentos de DNA
• Digestión
g de extremos 3´
protuberantes
• Preparación de sondas de DNA
radiactivas
 Usos del fragmento Klenow de la DNA
pol I de E. coli
A Relleno de extremos
A. B Degradacion de extremos
B.
3’ recesivos para generar 3’ protuberantes,
protuberantes, para generar
extremos romos extremos romos

5’-3’ DNA polimerasa en

presencia de dNTP y F.
Klenow 3’-5’
exonucleasa
de la DNA pol
AATT-OH
Klenow
Marcación de DNA p
por iniciación al
azar (random priming)

Nucleótidos radiactivos

Hexámeros 1 y 2: partidores
p
M: hebra templado (hebra simple)
P: p
polimerasa
lim r s
N: hebra recien sintetizada
Marcación p
por traslado del nick
(Nick translation)
DNA polimerasa Taq

• Uso en PCR
• Original de bacteria termófilaThermus aquaticus
• Termo-resistente, activa a altas temperaturas
• Carece de actividad 3’-5’ exonucleasa (mayor
frecuencia de errores en la polimerización: 1 en 1000
a 1 en 10.000 pb)

• Otras termoestables
bl con actividad
d d 3’-5’
’ ’ exo se usan
para amplificación de secuencias que se requiere
preservar de mutaciones (Pfu,
p ( , Vent DNA pol,
p , Tli,, etc))
 Síntesis de
cDNA por
T
Transcriptasa
i t
inversa
 T7 o T4 RNA polimerasas

• O
Origen
i viral:
i l de
d f
fagos T7 o T4
• Síntesis de RNA usando DNA como templado.
R
Requiere
i un promotor
t compatible.
tibl
• Uso en la transcripción in vitro de genes de
i t é
interés.
• En construcción de sistemas de expresión
recombinante.
bi t
Usos de T7 RNA polimerasa
 Nucleasas
• Desoxirribonucleasas (DNasas), sustrato es DNA
• Ribonucleasas (RNasas), sustrato en RNA
• Endonucleasas y exonucleasas

•Mas usadas son:

•DNasa
DN s I (endonucleasa)
( d l s )
•Eliminar DNA de preparaciones de RNA o de
proteínas.
proteínas
•Estudio de interacción DNA-proteína por
DNasa footprinting.
footprinting
•RNasa A (endo-ribonucleasa)
•Eliminar
Eliminar RNA de preparaciones de DNA.
DNA
•Las dos son originales de páncreas de bovino.
Exonucleasa III

ExoIII ExoIII
•Remoción de
nucleotidos, uno a
uno, desde el ext.
3’ OH.
•ExoIII ataca el 3'
OH en DNA d doble
bl
hebra con extremo
romo o extremo 5’ 5
Ejemplo de
protuberante.
aplicación de
E III en la
ExoIII l
generación de
mutaciones por
delección en un
promotor.
 DNA ligasas

•catalizan la formación de un enlace fosfodiéster entre un

extremo 3’
3 OH y un 5’5 PO4
•T4 DNA ligasa. Aplicacion en la formación de moléculas de
DNA recombinante.
•Liga fragmentos cohesivos (complementarios) y romos, aunque
éstos últimos son menos favorecidos.
•Extremo fosfato en C 5’ es fundamental.
•ATP como cofactor
Fosfatasa alcalina de intestino de
ternera (CIP)

•Aplicación:
Aplicación: desfosforilación de extremos 5´P
5 P para
evitar autoligación, en clonamiento de DNA.
 T4 Polinucleótido quinasa (PNK)

Aplicaciones
1. Marcación de ácidos nucleicos (RNA y DNA) en el extremo 5´
por fosforilación con 32P-ATP
p
2. Fosforilación de oligonucleótidos sintéticos en el extremo 5’
 Transformación y selección

Vector recombinante

Cromosoma Transformación de bacterias
de E. Coli
 Las bacterias se crecen sobre 
Las bacterias se crecen sobre
placas que contienen agar  y 
ampicilina (antibiótico).
Replicación del plásmido
Replicación del plásmido
 Sobreviven las células 
transformadas, por poseer 
M l i li ió
Multiplicación celular
l l el gen AmpR, el resto 
el gen Amp el resto
mueren.