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ENZIMAS DE RESTRICCION En 1978 Daniel Nathans, Hamilton Smith, y al cientfico suizo Werner Arber. Fueron galardonados con el premio Nobel de Medicina por su trabajo en enzimas de restriccin que marcaron un notable avance en el campo de gentica. La degradacin del DNA extrao que ha ingresado a una clula husped fue descubierta por infecciones por fagos. Este fenmeno, denominado restriccin, es el resultado de la accion de endonucleasas especficas (enzimas de restriccin) que degradan el DNA extrao. Estas enzimas son codificadas por la bacteria a nivel cromosmico o plasmidico. Las enzimas de restriccin se llaman tambin nucleasas de restriccin, endonucleasas de restriccin y en algunas ocasiones enzimas restrictivas o restrictasas. Son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material gentico a partir de una secuencia que reconocen. Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias especificas

Son extradas de organismos procariticos (bacterias), donde actan como

un mecanismo de defensa, para degradar material gentico extrao que entre en la clula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extrao y el DNA propio. afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial. Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo

Se nombran con tres letras tomadas del genero y especie de la bacteria de la que se aislaron originalmente, seguida a veces por una letra mas, que identifica el serotipo (variante antignica de la bacteria)y finalmente por numero romano que las identifica en el caso de que en una misma variante se hayan encontrado varias enzimas con distintas especificidad: Ejemplo: Eco RI E = gnero Escherichia co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Las diversas enzimas de restriccin se agrupan normalmente en tres familias de acuerdo con sus propiedades:

Tipo I y Tipo III: a. b. Tienen actividad de restriccin (cortan) y modificacin (metilan). Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despes de la

Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea ro arriba o ro abajo. secuencia que reconocen. c. Necesitan ATP para moverse a travs de la molcula de DNA,

desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte. 2. Tipo II: a. b. Slo tienen actividad de restriccin. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia

que reconocen.

c. d.

Slo requieren Mg++ como cofactor. No necesitan ATP.

COMO HACE LA BACTERIA PARA QUE SUS PROPIAS ENZIMAS NO ATAQUEN SU DNA? (PAPEL BIOLOGICO DEL SISTEMA METILACION-RESTRICCION O RESTRICCION-MODIFICACION) La existencia natural de las nucleasas de restriccin en muchas bacterias ofrece un mecanismo de defensa contra la entrada de material gentico de otro organismo, concretamente de virus bacterifagos: se trata de los sistemas de restriccin-modificacin o metilacin-restriccin. Para cada enzima de restriccin, una metilasa reconoce la misma secuencia que constituye el sitio de restriccin y une covalentemente grupos metilos a determinadas bases del DNA en dicha secuencia. En el caso de enzimas tipo II, la metilasa es una protena independiente, mientras que las del tipo I y III poseen las actividades nucleasa y metilasa en su molcula oligomerica, como subunidades que actan coordinadamente. El DNA propio de la bacteria es metilado de una forma especfica caracterstica de cada especie bacteriana. La metilacin de las bases impide la unin de la enzima de restriccin, con lo que el DNA propio no es hidrolizado. Por el contrario, al entrar a la clula DNA de otro organismo, no metilado o con un patrn de metilacin deferente, este DNA puede ser degradado por la enzima de restriccin.

ACCION DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO II Son estas las reestrictasa estructuralmente mas simples y mejor estudiadas por su utilidad en ingeniera gentica, a modo de tijera para el corte del DNA. El sitio de restriccin es a la vez lugar de reconocimiento y de hidrlisis. Se hidrolizan de forma muy especifica enlaces fosfodiester del DNA, uno en cada hebra generndose dos fragmentos de restriccin. El enlace hidrolizado es siempre el 3P (son endonucleasas de tipo a) por lo que el fosfato queda unido a 5, dejando en ambos fragmentos extremos 3-OH y 5-P. la reaccin no necesita ATP, lo que la diferencia de la catalizada por las enzimas tipo I y III.

TIPOS DE CORTES DE LAS ENDONUCLEASAS Las enzimas de restriccin al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes: Cohesivos o pegajosos: Cuando la enzima de restriccin actua dejando dos extremos 5que son complementarios entre s:

EcoRI GAATTC CTTAAG

BamHI GGATCC CCTAGG

HindIII AAGCTT AACGAA

Estos extremos son creados por las endonucleasas tipo II, sin embargo no todas las enzimas de restriccin tipo II dejan as los extremos.

2.

Romos:

SspI

SmaI

AATATT CCCGGG TTATAA GGGCCC

Diferencias entre los tipos de cortes de endonucleasas:

ENZIMASDE RESTRICCION TIPO II EMPLEADAS EN INGENIERIA GENETICA:

APLICACIONES DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIN: 1. 2. Blot. 3. Generacin de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en Hacer mapa de restriccin de un plsmido o bacterifago. Fragmentar DNA genmico para separacin de electroforesis y Southern

Southerny Northern blotting. 4. Generacin de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados,

creacin de DNA recombinante.

FACTORES

QUE

PUEDEN

AFECTAR

LA

ACTIVIDAD

DE

LAS

ENDONUCLEASAS Existen varios factores que son crticos al trabajar con enzimas de restriccin y que pueden afectar la actividad de las mismas: 1. Pureza del DNA la reaccin de enzimas es muy dependiente de la pureza,

contaminantes como protenas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa. 2. Temperatura y pH las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en

lo que respecta a su estabilidad y actividad. 3. 4. 5. 6. 7. DNAsas Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg++ . Contaminantes con carga (-). DNA contaminado con otro DNA. Grados de metilacin algunas endonucleasas son inhibidas por metilacin. Tipo de molcula de DNA si el DNA no tiene la secuencia que es

reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el material gentico (ej. si el DNA est superenrrollado el lugar de restriccin no va a estar accesible para la enzima). 8. Buffer adecuado este provee el ambiente que necesita la enzima para

trabajar en condiciones ptimas.

BIBLIOGRAFIA

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Basualdo Juan ngel. Microbiologa Biomdica. Editorial Atlante. Buenos Aires. 1996. Pag.106-107.

Lewis Benjamn. Genes. 2 Edicin. Editorial. Editorial REVERTE. Barcelona Espaa. 1996. 492-494.