INGENIERIA BIOMÉDICA Y TELECOMUNICACIONES. ASIGNATURA BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR.

UPNA

PRÁCTICA 4
1.INTRODUCCIÓN A LA BIOINFORMÁTICA .

2.INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LA PCR CUANTITATIVA A PARTIR DE CURVAS

ESTÁNDARES.

1. INTRODUCCIÓN: ¿Qué es la Bioinformática?

La bioinformática es la aplicación de la tecnología informática a la gestión de la información

biológica. 

¿Cuándo surge?

La necesidad de Bioinformática surgió de la explosión de información genómica disponible

públicamente, principalmente resultado del Proyecto Genoma Humano. Para abordar esto, el
Centro Nacional de Información de Biotecnología (NCBI, USA, www.ncbi.nlm.nih.gov/), fue
establecido en 1988 como un recurso nacional para información de biología molecular. El NCBI
crea bases de datos de acceso público, desarrolla herramientas de software para analizar datos
del genoma y difunde información biomédica, todo para una mejor comprensión de los
procesos moleculares que afectan la salud y las enfermedades humanas.  Algunas de las
muchas bases de datos de las que el NCBI es responsable incluyen la base de datos de
secuencias de ADN GenBank; la Base de Datos de Modelado Molecular (MMDB) que consta de
estructuras de proteínas tridimensionales, así como herramientas para su visualización y
análisis comparativo; y la base de datos en línea de Herencia Mendeliana en el Hombre
(OMIM).

El NCBI ha desarrollado una forma sencilla de analizar y acceder a toda esta

información. Entrez es un sistema de búsqueda y recuperación que integra las secuencias de
nucleótidos, secuencias de proteínas, estructuras macromoleculares, genomas completos y
literatura científica. El beneficio de este sistema es que todas estas bases de datos están
vinculadas entre sí, de modo que uno puede acceder fácilmente a una secuencia de proteínas,
obtener literatura sobre esa proteína, examinar los trastornos clínicos resultantes de defectos
en la proteína y analizar la ubicación cromosómica de la proteína.

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/index.html

¿Como está ordenada toda esa información?

Bases de datos nucleótidos - GenBank

proteínas - Uniprot

artículos científicos - PubMed

enfermedades - OMIM

genes - Entrez Gene

HERRAMIENTAS.

1. GENBANK:

Genbank es una base de datos pública y contiene una extensa colección de secuencias de
nucleótidos obtenidas a partir de más de 300.000 especies. Se puede acceder a la mayor parte
de ellas mediante la base de datos denominada Nucleotide.

ESTRUCTURA DE UN REGISTRO DE GenBank

Cada registro de GenBank incluye:

 una descripción concisa de la secuencia (líneas LOCUS y DEFINITION)

 unos códigos de acceso del propio registro (líneas ACCESION y VERSION)

 palabras clave y nombre científico y la taxonamía del organismo de donde

procede (líneas KEYWORDS, SOURCE Y ORGANISM)

 referencias bibliográficas con sus enlaces a MEDLINE (líneas REFERENCE, AUTHORS,

TITLE, JOURNAL, PUBMED, COMMENT)

 una tabla de características con anotaciones que describen las regiones de interés

biológico (regiones codificantes y su traducción a proteína, regiones no traducidas en 5'
y en 3', unidades de transcripción, repeticiones, mutaciones, etc.)

 la secuencia completa de nucleótido

Formatos más comunes presentes en las secuencias de las bases de datos públicas es el
Formato de texto FASTA que no suelen contener anotaciones.

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2. BLAST

Herramienta básica de búsqueda de alineación local. BLAST encuentra regiones de similitud

entre secuencias biológicas. El programa compara las secuencias de nucleótidos o proteínas
con las bases de datos de secuencias y calcula la significación estadística.
1. EJERCICIOS.

1) Accede a la secuencia X01714 y contesta a las siguientes preguntas:

 ¿A qué tipo de molécula corresponde? Un acido nucleico. Es una secuencia de DNA.

 ¿Cuántos nucleótidos contiene? 1609 pares de bases

 ¿En qué fecha se modificó el registro por última vez? 23 de octubre de 2008
 ¿Cómo se denomina el gen?
Esta secuencia codifica para el gen dUTPasa.
 ¿De qué organismo procede?
De una bacteria, mas específicamente de la Scherichia Coli. Es un organismo compuesto
por células procariotas.

2) En el colegio de mi hijo ponen pescado dos veces por semana. En el menú pone que es
bacalao, pero he oído que en muchos sitios lo que de verdad ponen es panga, un pescado
cuyo consumo puede resultar nocivo. Para salir de dudas, tomé una muestra del pescado,
extraje el ADN de sus mitocondrias y por PCR obtuve un fragmento de aproximadamente 200
pb que mandé secuenciar. La secuencia del fragmento en cuestión es:

ATTGCCCTCTACGTAACATGATCAATTTTAGAATTTGCTTCATGATATATACACTCCGACCCATATCTAAA
CCGATTCTTCAAATATCTTCTACTATTTCTAGTAGCTATAATTATTCTAGTAACCGCCAACAACCTATTTCA
ACTATTTATCGGCTGAGAAGGAGTCGGCATTATATCATTCCTACTAATTGGGT

 ¿Qué es lo que está comiendo mi hijo?

Esta comiendo panga.

3) PRIMER-BLAST se usa a menudo para comprobar si los CEBADORES O PRIMERS que se van
a utilizar en una PCR amplificarán el fragmento de ADN genómico deseado. A partir de la
secuencia de primers utilizados en la práctica 3:

 ¿A qué organismo pertenecen? ¿Qué tamaño (en pares de bases) tendrá el producto de
PCR resultante?

Pertenecen al organismo Lactiplantibacillus plantarum , con la cepa concreta de DSM

20174. La longitud del producto de PCR será de 148.

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Primer Forward: GCTGGCAATGCCATCGTGCT Primer Reverse: TCTCAACGGTTGCTGTATCG

4) A partir de la cepa concreta DSM 20174 del anterior organismo consigue el número
completo de pares de bases de su genoma.

El numero completo de bases de su genoma es 3242936 en el DNA circular.

2. INTRODUCCIÓN: Real time PCR (RT-PCR) o PCR cuantitativa

REALIZACIÓN DE LA PCR CUANTITATIVA: CURVA ESTÁNDAR Y ADN DESCONOCIDO

Por norma general, cuando realizamos PCR a tiempo real o cuantitativa si hay producto de PCR,
el resultado que nos proporcionará el software es el ciclo de la PCR (Ct) o ciclo umbral en el
cual empieza a detectarse señal fluorescente emitida por el SYBR green que supera el nivel
umbral o threshold establecido.

Sin embargo, es imprescindible, si queremos conocer el número exacto de moléculas de ADN

contenidas en una muestra desconocida, la creación de una curva estándar. Esta curva
standard se generará a partir de una muestra de ADN control con una concentración conocida.
A partir de ella se llevarán a cabo diluciones seriadas. Se realizarán PCRs cuantitativas para el
ADN control y a sus diluciones seriadas, además de las muestras de ADN desconocido.

CÁLCULOS

1. Será necesario convertir la cantidad o concentración de ADN control, en número de copias

de ADN/ml a partir de la fórmula que se muestra a continuación.

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2. Finalmente, el programa (o la persona manualmente) generará una curva estándar obtenida
a partir de enfrentar los valores de Ct para cada una de las PCRs (ADN control más sus
diluciones) y su correspondiente logaritmo del número de copias de ADN/ml. Esta curva de
calibración permite interpolar directamente los valores de Ct de las muestras desconocida y
obtener su concentración (como número de copias/ml), mediante la fórmula de regresión
linear (y= mx+b), según se muestra en la siguiente imagen.

EJERCICIOS. CÁLCULO DEL NÚMERO DE COPIAS DEL ADN GENÓMICO EXTRAÍDO EN LA PRÁCTICA
2 A PARTIR DE RT-PCR Y CURVAS ESTÁNDARES.

La profesora ha utilizado una muestra de ADN control de L.plantarum DSM 20174 para hacer la
curva de calibración, su concentración se correspondía con una cantidad de 50 ng/µl.

1) Calcula según la fórmula anterior el número de copias de ADN/ml que hay en dicha
muestra control (necesitarás conocer la longitud del ADN de L.plantarum DSM 20174 en pares
de bases).

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 A partir de la fórmula, sabemos el número aproximado de copias por ml:1,41 7 es el número
de copias

2) Si la profesora ha diluido la muestra ADN control 1/10, y luego ha repetido la operación

siete veces consecutivamente, escribe que diluciones ha aplicado.

Primera dilución  ADN control, donde tenemos 107 copias por ml

Segunda dilución  Dilucion 10-1, donde tendremos 106 copias por ml

Tercera dilución  Dilucion 10-2, donde tendremos 105 copias por ml

Cuarta diluciones  Dilucion 10-3 donde tendremos 104 copias por ml

Quinta dilución  Dilucion 10-4 donde tendremos 103 copias por ml

Sexta dilución  Dilucion 10-5, donde tendremos 102 copias por ml

Septima dilución  Dilucion 10-6, donde tendremos 107 copias por ml

3) Si conocemos el número de copias de ADN/ml del ADN control, escribe a que número de
copias se corresponderá cada una de las diluciones.

Primera dilución  ADN control, donde tenemos 107 copias por ml

Segunda dilución  Dilucion 10-1, donde tendremos 106 copias por ml

Tercera dilución  Dilucion 10-2, donde tendremos 105 copias por ml

Cuarta diluciones  Dilucion 10-3 donde tendremos 104 copias por ml

Quinta dilución  Dilucion 10-4 donde tendremos 103 copias por ml

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Sexta dilución  Dilucion 10-5, donde tendremos 102 copias por ml

Septima dilución  Dilucion 10-6, donde tendremos 107 copias por ml

4) Escribe ahora, el logaritmo de base 10 para cada uno de los números de copias de ADN/ ml
que has obtenido en el apartado 3 (ADN control y diluciones).

Primera dilución  ADN control, donde tenemos 107 copias por ml; log 7

Segunda dilución  Dilucion 10-1, donde tendremos 106 copias por ml; log 6

Tercera dilución  Dilucion 10-2, donde tendremos 105 copias por ml; log 5

Cuarta dilucion Dilucion 10-3 donde tendremos 104 copias por ml; log 4

Quinta dilución  Dilucion 10-4 donde tendremos 103 copias por ml, log 3

Sexta dilución  Dilucion 10-5, donde tendremos 102 copias por ml, log 2

Septima dilución  Dilucion 10-6, donde tendremos 101< copias por ml, log 1

5) En este momento la profesora te dará los valores de Ct obtenidos para las muestras
anteriores (ADN control y diluciones) que se han obtenido en la PCR. Representa
gráficamente en una hoja Excel el valor de Ct obtenidos frente al logaritmo en base 10 del
número de copias/ml de cada muestra (ADN control y diluciones). Ajusta los puntos de la
curva a una recta mediante regresión lineal. Pega el resultado de la ecuación de la recta aquí
debajo.

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6)  A partir de la ecuación de la recta obtenida calcula la eficiencia de la PCR si tenemos en
cuenta que eficiencia=E=10^(-1/pendiente). Calcula también el % de eficiencia a partir de la
siguiente fórmula %E=(E-1)*100.

E= =10^(-1/-3.7614) = 1,84

%E=(E-1)*100= 84.44

La eficiencia de la PCR ha sido buena, ya que el porcentaje está por encima del 80%

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7) Por último, la profesora te dará el Ct que se ha obtenido para la PCR que realizaste en la
práctica 3 a partir del ADN que tú y tu pareja extrajisteis. Calcula a partir de la recta anterior,
a que número de copias/ml se corresponde.

DNA 4: CT 12.73 + 12.75

La media es 14.74

Sustituyendo el valor en la ecuación: 12.74= -3.7614x + 31.373  x= 4.95

El numero de copias/ml será: 104.95