MEMORIA DE PRÁCTICAS ESTRUCTURA Y PATOLOGÍA MÉDICA

FECHA:
GRUPO:
NOMBRE ALUMNO/S:

1. APLICACIONES DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN

IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

Detalla el fundamento de la identificación microbiana mediante MALDITOF

¿Qué parte de la bacteria se utiliza para la identificación?
¿Cómo se produce la ionización y aceleración?
¿Qué indica el espectro obtenido?
Indica un ejemplo que hayas visto en prácticas
Busca e indica una aplicación diferente de esta tecnología u otras equivalentes

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 Diferencias frente a otros métodos de identificación:

Tiempo Dificultad Coste Utilidad

Placas
cromogénicas

Pruebas
bioquímicas

MALDITOF

Secuenciación

2. ANTIBIOGRAMA: AUTOMATIZACIÓN Y DIAGNÓSTICO RÁPIDO

¿En qué se basa la determinación clásica de la sensibilidad de las bacterias a

los antibióticos?

Indica los resultados de un ejemplo que has visto en prácticas

ANTIBIÓTICO CMI INTERPRETACIÓN

Busca e indica tecnologías diferentes que se podrían utilizar para agilizar la

identificación de resistencias a antibióticos ¿En qué casos puede ser relevante?
Tiempo Dificultad Coste Utilidad

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3. APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO FLUORESCENTE EN EL
CRIBADO DE GRANDES VOLÚMENES DE MUESTRAS

Fundamento del citómetro de flujo de fluorescencia

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¿Cómo se denomina el citómetro de flujo que has visto y para qué aplicación se
utiliza?

Indica la información que aporta cada canal y cada parámetro

Canal core (CR)

Canal surface (SF)

Luz dispersa frontal (FSC)

Luz dispersa lateral (SSC)

Luz fluorescente lateral (SFL)

Luz despolarizada lateral (DSS)

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¿Cómo se denominan los diagramas resultantes? Interpreta

5
Indica otras posibles aplicaciones de citometría de flujo

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4. CLASIFICADORES DE MUESTRAS, CADENAS, SISTEMAS
AUTOMATIZADOS DE ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA Y PCR

¿Qué función tiene un clasificador de muestras?

Indica el nombre del clasificador de muestras que has visto
Indica diferencias entre las cadenas que has visitado (transportadores de
muestras, localización de muestras, incorporación de tubos, velocidad,
priorización, conexión con destaponadores- retaponadores - centrífugas -
neveras – analizadores, control de volumen, control de etiqueta tubo)

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Explica el fundamento de la ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA

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Explica el fundamento de los ensayos enzimáticos, por ejemplo, la detección de
glucosa: ¿Cuál es el parámetro que se mide?

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Explica el fundamento de la PCR en tiempo real (imagen con sondas taqman
fluorescentes). Haz un diagrama de la fluorescencia detectada en caso de
positividad, indicando los parámetros del eje x e y.

Interpretación de PCR en tiempo real: ¿En qué caso la PCR en tiempo real está
detectando una mayor carga de ADN en la muestra estudiada?. Justifica tu
elección. Los ciclos de la PCR se indican en el eje X. La fluorescencia detectada
se indica en el eje Y

Indica una aplicación de PCR automatizada + autotoma

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 5. SECUENCIACIÓN NEXT GENERATION (NGS)
Para los ejercicios de NGS, necesitarás los datos de la carpeta Input.

5.1 Análisis de secuencias de resistencia a antibióticos

Las resistencias a antibióticos son un grave problema para la sanidad actual. El análisis
de resistencias puede hacerse con un antibiograma, pero en caso de bacterias
multirresistentes la mejor opción puede ser la secuenciación del genoma bacteriano
para buscar genes de resistencia directamente.

Hay muchas bases de datos para búsqueda de resistencia a antibióticos. En ellas se

puede meter datos de secuenciación y sacar genes de resistencia de cada muestra.
Probemos con la base de datos Resfinder: https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/.
Esta base de datos incluye genes de resistencia para casi 100 antibióticos distintos.

Esta base de datos es útil pues permite utilizar datos de output directamente del
secuenciador, sin procesar. Estos archivos vienen en formato fastq y hay que subir dos
por muestra (lecturas 3’-5’ (forward) y 5’-3’ (reverse)). En la carpeta Input hay 4
archivos fastq para dos muestras. Podemos subir cada una en paralelo en dos
pestañas distintas (el análisis completo tardará 5-10 minutos). Antes de subir las
secuencias, debemos elegir como tipo de input “Illumina - paired end reads”.

Los resultados nos darán una lista de antibióticos, entre resistente y sensible.
¿A cuantos antibióticos resisten estas muestras? ¿Son más de los que
esperabas?

Ambos pacientes estaban siendo sometidos a un tratamiento con Gentamicina.

¿Es eficaz en ambos pacientes? ¿Debería cambiarse el tratamiento a alguno de
ellos? Sugiere antibióticos alternativos.

Se nos indica que el gen de resistencia se llama aac(3)-IIa. ¿Qué significa eso?
¿Cómo produce este gen la resistencia al antibiótico?

5.2 Análisis de secuencias de SARS-CoV-2

La vigilancia de nuevas variantes y mutaciones de SARS-COV-2 requiere del

seguimiento del genoma del SARS-CoV-2 de pacientes infectados en el área de Vigo.
Nextclade (https://clades.nextstrain.org/) es una herramienta que permite la
visualización de mutaciones. Solo requiere elegir la referencia y elegir un archivo con
las secuencias (chuvi2023.fasta). Elegimos la referencia SARS-CoV-2, que es la

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secuencia de Wuhan 2019. Vamos a comparar nuestras muestras con cómo era el
virus original, y cuántas mutaciones se han acumulado.

Un menú nos permite navegar entre el genoma completo (“nucleotide sequence”) o

cada uno de los genes. Cada línea representa una mutación, y tiene un código para
identificarla. Por ejemplo, E: T9I es la mutación del aminoácido T al aminoácido I en la
posición 9 del gen E.
¿Qué gen del SARS-CoV-2 tiene más mutaciones en las muestras que has
introducido?
¿Sabes si este gen tiene alguna función particular?

Centrémonos ahora en el gen de la proteína Spike (gen S). En esa zona se encuentran
los aminoácidos del dominio de unión al receptor (RBD), la zona donde se une el virus
a la célula. Esta zona la ocupan los aminoácidos 318-510. ¿Es la densidad de
mutaciones más alta en este área?

Siguiendo en este gen, dos muestras tienen muchas menos mutaciones que las
demás. Usando la información disponible en Nextclade y los recursos online que
necesites (p.ej. Google/ChatGPT, etc.). ¿Podrías identificar qué variantes son? (Alfa,
Beta, Gamma, Delta, etc.) Aproximadamente, ¿de qué época podrían ser estas
muestras?

La mayoría de muestras en este archivo son Omicron, y han sido recogidas en este
año 2023. Visualizar mutaciones de Omicron es complicado porque se han acumulado
demasiadas a lo largo de estos años. Para facilitar la visualización, en vez de comparar
con la variante Wuhan-2019, vamos a salir de Nextclade y cambiar la referencia a
“SARS-CoV-2 relative to BA.2”. Nuestra nueva referencia es una de las Omicron
originales, BA.2.

Ahora dos muestras aparecen designadas como “Outgroup”. ¿Por qué crees que es
esto?

Tres de las muestras pertenecen al linaje XBB.1.5. Este linaje es uno de los que más
ha crecido en los últimos meses, suponiendo el 11% de los casos europeos este año.
La diferencia del clado XBB con otros mayoritarios anteriores es que este es un clado
recombinante, es decir, surgió de la mezcla de dos linajes que infectaron al mismo
paciente. En Spike, los primeros 450 aminoácidos provienen de un linaje que también
aparece entre las muestras de las que dispones. ¿Podrías encontrar cuál es este linaje
original? (Aquél con el patrón mutacional similar a XBB en el principio de Spike).

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NOTA: si no lo puedes encontrar a simple vista puedes buscar la respuesta en
cualquier lugar online.

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6. PROCESO DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN URINARIA
Indica en un diagrama el proceso diagnóstico completo de la infección urinaria

¿Cuál es la técnica de referencia? ¿Con qué velocidad se puede identificar una

muestra negativa mediante citometría de flujo?

Ventajas Limitaciones

Técnica de referencia

Citometría de flujo

7. AUTOMATIZACIÓN DE LA MICROSCOPÍA DEL SEDIMENTO URINARIO

Indica brevemente tu visualización de una muestra

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