lEfecto de la concentración de sustrato, la temperatura y el pH sobre la velocidad de la reacción

enzimática
Laura S. Rodriguez Suarez, Sofia A. Ortiz Martin, Juliana Clavijo Peña y Ayelen Gómez Ramírez.

Resumen:
Esta práctica consistió en el estudio de la influencia de ciertos factores como lo son el PH, la
temperatura y la concentración de sustrato en la actividad de la amilasa, siendo esta la enzima que
cataliza el proceso de hidrólisis del almidón. Para esto, se utilizó el almidón contenido en la saliva, a
esta se le aplicaron tratamientos con los factores anteriormente mencionados; sin embargo los
resultados no fueron los esperados ya que al diluir la saliva con agua no se realizó una correcta
agitación e integración de las dos sustancias. Sin embargo se logró obtener la cantidad de almidón
procesado en cada experimento y realizar un análisis de los resultados obtenidos en cada factor
evaluado.

Objetivo:
● Evaluar la cantidad de almidón remanente de la reacción para observar el efecto que
tienen ciertos factores como lo son temperatura,, concentración y pH en la actividad
de la enzima amilasa.

Introducción:
Las enzimas son conjuntos de aminoácidos (proteínas) especializadas en catalizar reacciones en
diferentes procesos y reacciones en organismos vivos (1), sin embargo estas son muy sensibles a los
cambios en varios factores como lo es el PH, la temperatura o concentración del sustrato (son las
moléculas sobre las cuales actúa la enzima para convertirlos en productos). Al someter las enzimas a
altas temperaturas o a diferente PH se puede aumentar la velocidad de reacción enzima-sustrato, no
obstante al pasar de cierta temperatura y cierto nivel de PH, estas moléculas se pueden desnaturalizar
(ruptura de algunos enlaces de la molécula). Por otra parte, un aumento en la concentración del
sustrato puede aumentar la actividad de la enzima, pero al aumentar mucho el sustrato, la solución se
puede saturar y ya no habrá efecto alguno en la reacción.
Estos catalizadores funcionan uniéndose al sitio activo del reactivo formando el complejo
enzima-sustrato, facilitando la ruptura de enlaces y demás procesos químicos y disminuyendo la
energía requerida para la reacción.
La amilasa es una de estas enzimas catalizadoras, la cual contribuye a la hidrólisis; este proceso
ocurre únicamente favoreciendo la ruptura de los enlaces 𝛂 1-4 y no con los enlaces 𝛂 1-6 del
almidón, finalmente este proceso tiene como resultado la formación de glucosa. Esta enzima se
produce en gran cantidad en las glándulas salivales (de allí la muestra utilizada para este laboratorio);
por su capacidad de romper las moléculas de almidón ayuda a la digestión de los carbohidratos (2).
Finalmente, en este laboratorio se va a observar la actividad enzimática de la amilasa bajo la presencia
de los factores mencionados anteriormente.

Metodología

Experimento de variación de la temperatura. Ver Anexo 1

Experimento con variación de pH. Ver Anexo 2
Experimento de variación de la concentración del sustrato. Ver Anexo 3

Materiales:
● Tubos falcon
● Almidón
● Buffer fosfato
● Amilasa
● Lugol
● Nevera con hielo
● Saliva
● Tubos de ensayo
● Baño termostático
● Espectrofotómetro

Resultados:
Ecuación 1: ecuación de la curva de calibración

𝑦 = 14. 658𝑥 − 0. 0335

y=absorbancia

Esta ecuación se utilizó para hallar el almidón sobrante (x) a partir de la curva de calibración,
despejando x de la ecuación de la recta, esto para hallar el almidón procesado en la reacción.

Ecuación 2: Almidón procesado

𝐶𝑓 = 𝐶𝑖 − 𝑥
Esta ecuación da lugar al almidón sobrante en la reacción a partir del almidón procesado y la cantidad
inicial de almidón.

● Resultados de temperatura:

Tabla 1: Datos de espectofotometría temperatura.

Tabla 2: Convenciones

Tabla 3: Datos experiementales con respecto a la temperatura.

Tabla 4: Resultados de la variación de almidón a partir de la curva de calibración con respecto a la

temperatura .

Temperatura(°C) Almidón Absorbancia (y) Almidón

remanente(x) procesado (cf) (
(mg) mg)

Tubo 1 4 0.05236 0.734 0.94764

Tubo 2 37 0.07507 1.067 0.92493

Tubo 3 70 0.06682 0.946 0.93318

En esta tabla se sintetizaron los datos de la cantidad de almidón sobrante (ecuación 1) para poder
hallar la cantidad de almidón procesado (ecuación 2).

tabla 5: Datos de la

Gráfica 1
 ● Resultados de PH:

Tabla 5 : Datos de la variación de la cantidad de almidón con respecto al pH .

tabla 6

Tabla 7 : Resultados de la variación de almidón a partir de la curva de calibración con respecto al pH .

pH Almidón Absorbancia (y) Almidón

remanente (x) procesado (Cf)
(mg) (mg)

Tubo 1 2 0.1188 1.708 0.8812

Tubo 2 6.7 0.0378 0.522 0.9622

Tubo 3 10 0.0696 0.987 0.9304

En esta tabla se sintetizaron los datos de la cantidad de almidón sobrante (ecuación 1) para poder
hallar la cantidad de almidón procesado (ecuación 2).
Gráfica 2

● Resultados de concentración:

Tabla 8: Datos de variación de la cantidad de almidón con respecto al cambio en la concentración de

sustrato.

Tabla 9: Resultados de la variación de almidón a partir de la curva de calibración con respecto a la

concentración.
tabla 10

Almidón remanente Absorbancia (y) Almidón procesado

(x) (cf)

Tubo 1 0,0259 0,347 0,0741

Tubo 2 0,0363 0,500 0,2137

Tubo 3 0,0268 0,360 0,4732

Tubo 4 0,0224 0,296 0,9776

Tubo 5 0,0402 0,557 1,20

Tubo 6 0.04233 0,587 1,45

Tubo 7 0.0334 0,457 1,96

Tubo 8 0,0396 0,548 2,46

En esta tabla se sintetizaron los datos de la cantidad de almidón sobrante (ecuación 1) para poder
hallar la cantidad de almidón procesado (ecuación 2).

Gráfica 3
Discusión:
Teniendo en cuenta la actividad enzimática de la amilasa, su función y como se ve afectada por
factores físicos y químicos en este laboratorio se demostró la hidrólisis del almidón a partir de
variaciones en concentración de sustrato, pH y temperatura para evaluar la velocidad de la reacción.
Se conoce inicialmente que la actividad enzimática de la amilasa puede afectarse respecto a cualquier
factor físico o químico pues estos intervienen directamente con su estructura tridimensional (3) esto
influye directamente en la adhesión que esta tiene con el sustrato. En primer lugar se evaluó el efecto
de la variación de la temperatura sobre la amilasa En los tubos 1, 2, 3 y 4 se esperaba obtener colores
amarillo intermedio, amarillo azulado, azul intenso y azul intenso respectivamente, esto indicaba
principalmente que a 4°C (tubo 1) la reaccion iba a ser mucho más lenta debido a que su energia de
activación era demasiada, sin embargo a temperatura fisiologica 37°C (tubo 2) el color indicaba que la
amilasa presente en la saliva muestra estaba rompiendo correctamente el almidon pues el lugol
mostraria que el yodo se estaria introduciendo en algunas moleculas de almidon sin embargo no eran
las necesarias para mostrar una coloración azul lo suficientemente intensa, como si se esperaba fuera
el caso de los tubos 3 y 4 a temperaturas de 70°C y 37°C pues al haber una temperatura tan alta la
enzima pierde su estructura original convirtiendola en una primaria.(4) lo que por consiguiente afecta
directamente su funcion y la actividad de la enzima; el tubo 4 por otra parte era el control que no
contenia amilasa (saliva) pues esperabamos obtener un color que mostrara especificamente que nada
habia roto las moleculas de almidon.
Experimentalmente los tubos 1 y 2 tuvieron una tonalidad más azul de la que esperábamos pues se
piensa, hubo errores en el procedimiento, inicialmente se cree que a la hora de agregar agua a la saliva
depositada en el tubo falcón no se hizo la correcta agitación para que estuviese bien diluida, por esta
razón al empezar a tomar muestras y depositarlas en los tubos de ensayo, lo que realmente se estaba
agregando fue agua con muy poca cantidad de saliva que contiene la enzima amilasa. Esto se vio
representado en la gráfica #1, la cual muestra la proporcionalidad entre la absorbancia y la cantidad de
almidón remanente (x) que se halló a partir del despeje de la x con base en la curva de calibración
pues el espectrofotómetro arrojó valores un poco altos de absorbancia lo que nos deja ver la alta
concentración de almidón en la solución.
Posteriormente en los ensayos de variación del pH, a los tubos de ensayo 1, 2, 3 y 4 se les agregó una
solución Buffer con un pH = 2.0, pH = 6.7, pH = 10.0, pH = 6.7, en la literatura científica se encuentra
de el pH óptimo de la enzima es de 6.0 y se mantiene estable entre pH = 5.0 y pH = 7.0 (5), sin
embargo se esperaba que en las condiciones en las que reacciono la amilasa del tubo 1 su actividad
disminuyera significativamente, y por lo cual su coloracion se esperaba fuese azul intenso pues la
amilosa estaba tardando en romper todas las moleculas de almidon y por esto el yodo del lugol podria
estarse introduciendo en las espiras del almidon , en comparacion con el tubo 2 que estaba dentro del
rango donde la enzima tenia una actividad optima y se esperaba este tuviese un color amarillo claro,
pues la amilasa en estas condiciones se esperaba hubiese roto todas las moleculas de almidon,
entonces allí no habria ninguna estructura en la que el yodo del lugol pudiece introducirse que fue
totalmente lo contrario que ocurrio con el tubo 3 pues tenia unas condiciones de pH muy basico lo que
al igual que en el tubo 1 hacia que actividad disminuyera significativamente y esto se veia
directamente reflejado en su coloracion, sin embargo la amilasa en este medio basico se esperaba
actuara más que en el tubo 1 y por ende se mostrará amarillo azulado. En contraparte se tiene el tubo 4
como el control que tampoco tenía amilasa por ende se esperaba mostrará una coloración azul intensa
que hacía referencia que nada había roto las moléculas de almidón.
En contraste con lo que se esperaba obtener de este ensayo con pH los tubos 1, 2 y 4 obtuvieron la
coloración que teóricamente era correcta, según la gráfica #2 los valores de absorbancia son
coherentes con las cantidades de almidón remanente pues, el tubo 1 no se esperaba actividad
enzimática por ende tampoco degradación del almidón lo que nos generaría un alto valor de
absorbancia y por consiguiente una mayor luz transmitida (color), mientras que en el tubo 2, si bien
fue un valor de absorbancia y una coloración cercana a la que se esperaba tuvo un rango de error pues
teóricamente la absorbancia debe ser menor debido a que se encontraba en condiciones normales de
pH, esto indica nuevamente un error en relaciòn con la saliva (amilasa); se hace responsable
nuevamente a una mala dilución de la saliva en agua lo que también generó resultados desfavorables
en el tubo 3 pues su absorbancia fue muy grande lo que deja ver la gran concentración del sustrato
(almidón) y por ende la alta cantidad de luz transmitida; y por último el tubo 4 que fue el control y
dejaba ver la concentración de moléculas de almidón y gracias a esta la coloraciòn de la solución, este
sin embargo no se graficó debido a que se conocía el resultado a obtener.
Por último para evaluar la actividad catalítica de la enzima en el almidón se realizaron ensayos
respecto a la concentración del sustrato que en este caso sería el almidón administrado a cada uno de
los tubos, en este se realizó un control (tubo 0) donde se esperaba que el color fuese azul oscuro pues
no tenía amilasa que degradara las moléculas de almidón, respecto a los siguientes 8 tubos, la cantidad
de almidón fue aumentando mientras que la cantidad de Amilasa se mantuvo igual en los 8 ensayos,
en estos se esperaba que el color fuese cambiando de amarillo claro a amarillo oscuro a medida que se
iba aumentando la cantidad de almidón pues a medida de que se aumentaba la cantidad de sustrato
este ya no tenía enzimas disponibles para poder unirse pues había menos concentración de enzima por
ende el complejo enzima-sustrato estaría saturado entonces la velocidad de reacción alcanzaría su
máximo(6), lo que causaría en consecuencia que su color oscureciera gracias a que el yodo se
introduce en las moléculas de almidón que no se unieron a la enzima y quedaron libres.
En la práctica visiblemente la coloración de los tubos del 1 - 8 era correcta pues de manera continua
se veía un aumento en la intensidad del amarillo sin embargo el espectofotometro permitio ver que no
era tan progresivo como parecia, pues algunos tubos como el 3, 4 y 7 tienen su valor de absorbancia
bajos (Anexo 4) de una manera en la que no se ve continuidad, esto lo atribuimos a que en los
primeros ensayos se empleó el agua que contenia una poca cantidad de saliva por una mala practica en
su dilución, posteriormente para los ensayos de concentración la que se empleó fue aquella que quedó
en el fondo del tubo falcon, es decir la saliva precipitada y concentrada, por lo que en esta se hallaba
más cantidad de amilasa que permitió ver el efecto de la hidrolisis de la amilasa correctamente.

Conclusiones

Al realizar el análisis de los datos y resultados, se pudo observar que la actividad de la amilasa no fue
100% efectiva en ninguna de las variaciones, esto debido que en los resultados no se vieron los
cambios esperados en la coloración en los experimentos de pH y concentración, ni de forma
cualitativa (observación). En el caso de la temperatura algunos de los tubos tuvieron una coloración
más oscura de la debida, esto significa baja actividad enzimática. Se analizó el error cometido en la
práctica siendo este la falta de agitación al diluir la saliva con el agua, para poder evitar este tipo de
errores, se requiere más atención a la hora de realizar el experimento y más exactitud en cada una de
las mediciones que se empleen en el laboratorio, para así obtener resultados que se asemejen más a la
literatura y a los cambios cualitativos esperados en la práctica de laboratorio.
Sin embargo, se pudo evidenciar el efecto que generan algunos factores sobre la reacción
amilosa-almidón. En primer lugar, se analizó una parte del proceso de hidrólisis a partir de la amilosa,
esto se midió con ayuda de la ecuación Cf=Ci-x, siendo Cf la cantidad de almidón procesado en dicha
reacción. Por otro lado, se observa que la temperatura en ciertos puntos influyen en el aumento de la
velocidad de reacción; con respecto a los resultados del PH, se puede decir que la actividad
enzimática de la amilasa es más óptima en pH básicos que en los pH ácidos.
Finalmente, se logró medir la actividad de la enzima y se observó que la amilasa no fue suficiente
para reaccionar degradando el almidón, en consecuencia hubo una saturación de sustrato (almidón)
que al final se determinó y a este se le denominó almidón remanente.

Bibliografía:
1. Las enzimas y el sitio activo. Khan Academy. [citado el 9 de marzo de 2023]. Disponible
en:
https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/cellular-energetics/enzyme-structure-and-ca
talysis/a/enzymes-and-the-active-site
2. Polanco y Luis Manuel Montaño Zetina PP. SALIVA Y ENZIMA ALFA AMILASA:
ESENCIALES PARA LA DIGESTIÓN [Internet]. Umich.mx. [citado el 9 de marzo de
2023]. Disponible en:
https://www.sabermas.umich.mx/archivo/articulos/235-numero-27/421-saliva-y-enzima-alfa
-amilasa-esenciales-para-la-digestion.html
3. Centro Universitario de Occidente, editor. LABORATORIO DE HIDROLISIS
ENZIMATICA DEL ALMIDON [Internet]. [citado el 3 de marzo de 2023]. Disponible en:
http://medicina.cunoc.edu.gt/articulos/2bedcdd91cfe6a72cf523bae962acefb43cab2e2.pdf
4. ‌Aula Virtual de Biología [Internet]. www.um.es. Disponible en:
https://www.um.es/molecula/prot06.htm#:~:text=La%20desnaturalizaci%C3%B3n%20de%
20una%20proteina
5. Espinel E, López E. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE alfa-AMILASA DE
PENICILLIUM COMMUNE PRODUCIDA MEDIANTE FERMENTACIÓN EN FASE
SÓLIDA. Revista Colombiana de Química [Internet]. 2009 May 1;38(2):191–208.
Disponible en: https://revistas.unal.edu.co/index.php/rcolquim/article/view/13396/36546
6. ‌De la reacción LA de UEDQTRÉC la RQC un S en PEAD en GM de las C, Temperatura QI,
de la enzima y concentración del sustrato. C. Factores que afectan la actividad enzimática
[Internet]. Edu.uy. [citado el 9 de marzo de 2023]. Disponible en:
https://uruguayeduca.anep.edu.uy/sites/default/files/inline-files/Factores%20que%20afectan
%20la%20actividad%20enzim%C3%A1tica.pdf

Anexos

Anexo 1.
Anexo 2.
Anexo 3.

Anexo 4.