CUANTIFICACIÓN DE COLIFORMES (NMP) Y FILTRACIÓN POR MEMBRANA

Microbiología Básica
Miguel García (0501108), Isabella Cardona (0501104).
Universidad Militar Nueva Granada

RESUMEN
Los análisis dentro del laboratorio permiten determinar la calidad de agua y su índice de
contaminación definiendo así la optimización de su consumo. Para ello se tomó como patrón de
análisis 400 ml de agua de un sistema de filtración que se presume está limpio, para esta muestra se
realizó un análisis de las técnicas NMP (número más probable) con CBVB y FM (filtración por
membrana) las cuales permitieron determinar los tipos de microorganismos presentes en la muestra de
agua. De acuerdo a los resultados de las técnicas utilizadas se mostró una prueba positiva para
coliformes totales en el método de NMP debido a la presencia de gas al interior de la campana de
Durham y a la turbidez presente en el medio y prueba positiva para coliformes totales en el medio
chromocult en el método de FM, en esta técnica también se encontró la presencia de otros
microorganismos como E.coli, Salmonellas y Shigellas entre otros en los diferentes medios utilizados.

Palabras clave:Medios selectivos, medios diferenciales, NMP, Calidad de agua.

ABSTRACT

The analyzes within the laboratory allow to determine the quality of water and its pollution index,
thus defining the optimization of its consumption. For this, 400 ml of water from a filtration system
that is presumed to be clean can be used as an analysis standard, for this sample an analysis of the
NMP techniques (most probable number) with CBVB and FM (membrane filtration) was carried out,
which allowed to determine the types of microorganisms present in the water sample. According to
the results of the techniques used, a positive test for total coliforms in the NMP method will be
selected due to the presence of gas inside the Durham campaign and the turbidity present in the
medium and positive test for total coliforms in the chromocult medium in the FM method, this
technique also found the presence of other microorganisms such as E. coli, Salmonellas and Shigellas
among others in the different media used.

Key words: Selective media, differential media, NMP, Water quality.

potable de los bebederos del campus UMNG y

INTRODUCCIÓN
El análisis de aguas y de muestras de
alimentos es necesario y de vital importancia
para la industria y para el bienestar de las
comunidades, debido a que con esta se
determinan y cuantifican grupos de coliformes
que pueden alterar la calidad del producto, ya
que estos microorganismos son indicadores de
las condiciones de sanidad en las que se
encuentra una muestra, ya sea de agua o de
alimentos. En este informe, se intenta aprender
a realizar pruebas microbiológicas al agua
un jamón comercial, y determinar la calidad y
el manejo de estas. Esto se logra a partir de la
técnica del número más probable y la técnica
de filtración con membrana para el análisis
microbiológico de la muestra de agua. Para la
búsqueda de microorganismos coliformes
totales, coliformes fecales y E. coli
Análisis de aguas
En la industria son conocidos los análisis de
rutina de calidad de agua debido a su
importancia para controlar los procesos de
tratamiento de agua. El análisis
microbiológico de tratamiento de aguas es un
conjunto de técnicas utilizadas con el objetivo
de determinar los microorganismos patógenos
presentes en una muestra de agua, averiguando
si la muestra tiene o no contaminación de
origen fecal. (Páez, 2008)
Las técnicas utilizadas para detectar bacterias
indicadoras del grupo coliforme son
encaminadas para el control de calidad de
acueductos e industrias donde se requiere
procesar un gran número de muestras.
(Gómez, et al, 2013).
Los grupos de bacterias de coliformes siendo
aquellas aerobias o anaerobias facultativas,
bacilos Gram negativas, fermentadoras de
lactosa, no esporulados, productoras de ácido
y gas. Comprenden géneros de la familia
Enterobacteriaceae, caracterizados por estar
altamente difundidos en la naturaleza como
suelo y agua, son de gran importancia debido a
ser un grupo indicador de calidad sanitaria de
agua por usos domésticos como el consumo
humano (Navarro, 2007).
Las coliformes fecales se encuentran en el
intestino de organismos animales de sangre
caliente. Son termotolerantes, pues soportan
temperaturas hasta de 45º, entre los
microorganisms de este orden se destaca
Escherichia coli siendo el más reconocido
representante de contaminación de alimentos
por origen fecal, esta bacteria de tipo Gram
Negativo, fermentadora de lactosa, indol
positivo, su importancia se debe a que es un
principal indicador de higiene en los
alimentos. (Navarro, 2007)
Los microorganismos coliformes fecales que
se pueden hallar en muestras de agua son:
Escherichia coli, Salmonella spp, Shigella
spp, Pseudomonas spp y enterococos.
Técnicas empleadas para evaluación de aguas.
NMP (Número más probable)
La determinación estimada de cuantos
microorganismos coliformes totales hay
presentes en un volumen de muestra dado, se
trata esencialmente en la propiedad de este
grupo de microorganismos de fermentar la
lactosa con producción de ácido y gas al
incubarlos a 35ºC durante 48 h, utilizando un
medio de cultivo selectivo y diferencial
óptimo que tenga sales biliares como agar
CBVB. Esta técnica consta de dos fases una
presuntiva y otra fase confirmativa, ya que, al
ser una presunción, un tubo positivo durante la
prueba presuntiva no indica necesariamente la
presencia del grupo bacteriano de coliformes,
por esto debe confirmarse posteriormente, que
son:
- Fase Presuntiva: el medio de cultivo que se
utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual
permite la recuperación de microorganismos
que se encuentren presentes en la muestra y
que sean capaces de utilizar a la lactosa como
fuente de carbono. (Becerra-Tapia, et al, 2000)
- Fase confirmativa: se emplea como medio
de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante
el cual es selectivo y solo permite el desarrollo
de aquellos microorganismos capaces de
tolerar tanto las sales biliares como el verde
brillante. (Becerra-Tapia, et al, 2000)
Técnica de filtración por membrana
Método utilizado para análisis de aguas,
siendo altamente reproducible, basándose en
hacer pasar muestra de agua por un filtro de
tamaño de poro de celulosa mediante vacío,
para que quede la muestra retenida en él, las
bacterias de tipo coliforme y las mesofílicas, el
filtro es colocado en un medio de cultivo
específico para lo que se desea determinar en
la muestra (coliformes totales, coliformes
fecales y microorganismos mesofilicos).
(Páez, 2008).
Se debe utilizar un filtro de membrana libre de
químicos susceptibles de inhibir el crecimiento
y desarrollo bacteriano. Se comprende medio
de cultivo selectivo para coliformes de Endo y incubaron a 37° C por 48 horas. Finalmente
MF. (Becerra-Tapia, et al, 2000). se realizó una filtración de (tantos ml) por
membranas de 0,45 µm de tamaño de poro,
con ayuda de una bomba de vacío.
MATERIALES Y MÉTODOS
Posteriormente, cada membrana se dispuso en
la superficie de diferentes agares tales como
Para realizar la prueba de calidad de agua y McConkey, Chromocult, Endo y SPC; de los
detección de coliformes totales y fecales, se cuales, los dos primeros se incubaron a 37° C
llevó a cabo primeramente una prueba y los otros dos, se incubaron a 44°C
presuntiva, en la que se realizaron tres respectivamente por 48 horas.
diluciones de la muestra (10-1 10-2 10-3) y se
puso 1 mL por triplicado en tubos que
contenían caldo bilis verde brillante con
campana de Durham, dichos tubos se
incubaron a 37°C y se revisaron los resultados
ocho días después. Posteriormente, con los
resultados de las pruebas presuntivas, se
procedió a realizar las pruebas confirmativas
utilizando medios de cultivos con agar
McConkey y Chromocult en los cuales se hizo
una siembra en superficie de 1 mL de los tubos Imagen 1. montaje de la técnica de filtración
de caldo bilis verde brillante que fueron por membrana.
positivos (tubo 10-1 C), en los cuales se
observaron turbidez. Dichos medios se RESULTADOS Y DISCUSIÓN

MUESTRA VOLUMEN TÉCNICA COLIFORMES COLIFORMES

EVALUADA EVALUADO TOTALES FECALES

10-1 100 mL NMP Positivo Positivo

10-2 100 mL NMP Positivo Positivo

10-3 100 mL NMP Positivo Positivo

Tabla 1: Informe de los recuentos obtenidos de acuerdo a la técnica empleada.

NÚMERO DE TUBOS LÍMITES DE CONFIANZA DEL 95%

POSITIVOS

10-1 10-2 10-3 NMP por 100 BAJO ALTO

ml o g

3 3 1
460 71 2400

Tabla 2. Se encuentran los resultados obtenidos para la prueba de coliformes CBVB en la muestra
(jamón crudo).
MUESTRA EVALUADA TÉCNICA AGAR PIGMENTO BACTERIA

10-1 NMP EMB azul-violeta E.Coli

brillante

NMP Chromocult Rojo opaco Salmonella

TABLA 3. Resultados de la muestra 10-1 J.

Filtración por membrana

MUESTRA LÍMITE DE VOLUMEN TÉCNICA AGAR UFC RESULTADO

EVALUADA CONFIANZA EVALUADO
DEL 95%

10-1 4 100 mL Filtración McConkey Rojas

por 13 posiblemente
membrana Coliformes

100 mL Filtración Chromocult N.A Contaminado

por
membrana

100 mL Filtración EMB 3 Rosadas

por E.Coli fecales
membrana posiblemente
Candida albicans
(Britania,2015)

100 mL Filtración Endo Incontable Rosado,negro

por Posiblemente
membrana Shigella
E. Coli

100 mL Filtración SPC 15 Amarillo, grises

por posiblemente
membrana Levaduras
Hongos

TABLA 4. Resultados de los recuentos obtenidos de acuerdo a la técnica de número más probable.
 Técnicas utilizadas Coliformes Totales
Filtración por membrana 0 UFC/100 cm3
Enzima Sustrato < de 1 microorganismo en 100 cm 3
Sustrato Definido 0 microorganismos en 100 cm 3
Presencia - Ausencia Ausencia en 100 cm3
TABLA 5. Cuadro de características microbiológicas de agua potable, establecido por la resolución
2115 del 2007. Obtenido de: Ministerio de la protección social de ambiente vivienda y desarrollo
territorial.
La contaminación del agua está dada por
materia fecal, es de importancia sanitaria
debido a que las heces tiene microorganismos
enteropatógenos como E. coli, Salmonella,
Shigella y Vibrio, también protozoarios como
Entamoeba histolytica; y hay virus como
enterovirus o el de la hepatitis A (García,. et
al, 2005). De acuerdo a lo anterior y a los
resultados obtenidos de NMP y de filtración
por membrana se evidencio que el agua usada
como muestra está levemente contaminado,
por lo que, si se usa este tipo de agua para
consumo humano o animal, debe purificarse y
eliminar cualquier organismo patógeno que
cause daño a la salud de los seres vivos. En
cuanto a la técnica de NMP en el medio de
cultivo CBVB solo se hizo evidencia de
muestra positiva en los tubo (J
10 , 10 ,10 ¿ debido a la presencia de gas
−1 −2 −3
dentro de la campana de Durham y la turbidez
presente en el medio, de acuerdo a esto se
realizó también una prueba confirmativa en
agares Chromocult y McConkey en donde se
obtuvo E.Coli y Salmonellas. dando como
resultado prueba positiva para coliformes
totales. En relación a la tabla N°2 que muestra
la interpretacion del código de unidades de
coliformes por ml de muestra muestra un total
4 unidades formadoras de colonias por ml de
sustancia que, si lo respaldamos con la
literatura, la tabla N°5 nos muestra las
características microbiológicas permitidas en
muestra de agua potable y no se encuentra una
aprobación del límite establecido por la
resolución 2015. De lo cual se determina que
el crecimiento de coliformes totales sobrepasó
el límite establecido, clasificando la muestra
de agua tomada como no potable (Benítez et
al, 2013).
Escherichia coli
0 UFC/100 cm3
< de 1 microorganismo en 100 cm 3
0 microorganismos en 100 cm 3
Ausencia en 100 cm3
En la técnica de filtración por membrana, en
cuanto al agar Mc Conkey se evidenciaron
colonias Rojas, lo cual indica presencia de
microorganismos como Salmonella, Shigella y
bacterias coliformes; este es un medio
selectivo y diferencial, este medio contiene
sales biliares y cristal violeta lo que hace que
se inhiba el desarrollo de bacterias Gram
positivas y algunas Gram negativas exigentes,
en este medio la única fuente de carbono es la
lactosa (Baron, Peterson, & Finegold, 1994),
las bacterias que no fermentan la lactosa
forman colonias incoloras o transparentes dado
las características de las colonias formadas,
estas son lactosa (-).
La acción inhibitoria de Chromocult sobre
bacterias Gram positivas, no afectan la
morfología y fisiología de las coliformes,
además por la acción conjunta de peptonas
selectivas, piruvato y tampón de fosfatos se
garantiza un rápido crecimiento también de
coliformes con daños sublaterales. (Carrillo y
Lozano, 2008). Esta prueba presentó
contaminación del medio por lo cual no se
toma en cuenta.
En la membrana que se dispuso en el medio
que contenía agar SPC se revela el crecimiento
de colonias con coloración amarilla, que con
base en las diferentes pruebas que se
aplicaron, se sospecha la presencia de
levaduras. Este agar es un estándar en la
evaluación de agua y agua residual, ya que
facilitan el recuento de bacterias aeróbicas. La
triptona además de funcionar como fuente de
nutrición, inhibe el crecimiento de Gram (+).
El extracto de levadura suministra las fuentes
de nitrógeno y de vitaminas, que requieren una
vasta cantidad de organismos para su
crecimiento y la fuente de energía utilizada en
este medio es la glucosa (Soria, F, 2009 e
Invima, 2017).
La inhibición de organismos gram positivos en
el cultivo sobre EMB, confirma la presencia
del microorganismo Candida albicans y
E.Coli, evidenciada como colonias rosadas y
azules violetas en el medio, además tiene una
función relevante en la digestión de los
azúcares, mediante un proceso de
fermentación (Becton Dickinson GmbH,
2013).
Los resultados obtenidos comparados con las
tablas de recuentos oficiales y los límites
permitidos en el país decretadas por la
CONCLUSIÓN
En la realización de las pruebas para el control
microbiológico de la calidad del agua se puede
concluir que la prueba más adecuada es la del
número más probable en cuanto a la
determinación de coliformes totales debido a
que aparte de la presencia de gas y la turbidez
también se puede hacer una prueba
confirmativa para este tipo de técnica está
otorgó unos resultados aproximados que en
comparación con la literatura no muestra una
diferencia en cuanto a los resultados obtenidos
sin embargo muestra ciertas improbabilidades.
Entonces, el seguimiento de los
microorganismo presentes en el agua es poco
preciso dada la alta tasa de diversidad
microbiana que se puede encontrar en el agua
potable y dentro de las fuentes de
abastecimiento de las mismas. Sin embargo el
uso de bioindicadores como E.coli es
importante en este estudio por que permite la
aproximación de dichos resultados en la
identificación de microorganismos patógenos
dentro de la muestra de agua analizada y de
acuerdo a los resultados determinar la
optimización del consumo.
Para los productos de consumo tales como las
carnes es necesario tener un seguimiento post
Secretaría de Salud con el fin de monitorear,
prevenir y controlar los riesgos para la salud
humana causados consumo de agua cruda o
tratada. La certificación sanitaria es el orden
administrativo expedido por la secretaría de
salud competente a través del cual se acredita
el cumplimiento de las normas y criterios de la
calidad del agua para consumo humano,
soportado en el concepto sanitario, proferido a
solicitud del interesado o de las autoridades de
control. Con los resultados obtenidos se puede
deducir que la evaluación la calidad para
consumo humano con base al criterio, puede
ser un concepto favorable con requerimientos,
es decir, que es el que se declara cuando el
sistema de suministro de agua para consumo
no cumple con la totalidad de las buenas
prácticas sanitarias. (Ministerio de la
protección social, 2001).
producción para el control de crecimiento de
microorganismos tales como los mesófilos y
coliformes totales (no fecales). El grado de
calidad o confiabilidad de un producto de
consumo es medido a través de tanto factores
físico químicos como de factores
microbiológicos. Las coliformes fecales
representan un importante riesgo para la salud,
de allí radica la importancia de la
implementación de mecanismos para el control
y supervisión de la concentración de los
mismos.
La técnica del NMP no es tan eficaz para el
conteo directo de microorganismos
encontrados en una muestra más que todo si la
muestra es agua con poca turbidez.
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(Pectoralis major y Pectoralis minor) que se

CUESTIONARIO

1. ¿Cuál técnica utilizada para evaluar la calidad microbiológica del agua es mejor?

En cuestiones de determinación de microorganismos es recomendable utilizar el método de

NMP, las bacterias o microorganismos coliformes detectadas en la técnica de filtración por
membrana no son necesariamente las mismas que son capaces de fermentar lactosa en el
procedimiento de NMP, el procedimiento de filtración por membrana tiene la ventaja de tener
una mejor productividad en comparación de la técnica NMP, sin embargo los resultados de
ambas técnicas son numéricamente totalmente diferentes creando una dificultad a la hora de
identificacion de microorganismos coliformes. En la técnica de NMP se determinan bacterias del
grupo coliforme de acuerdo a la aparición de gas al interior de la campana de Durham y la
turbidez presente en el medio, entonces se puede estimar bacterias capaces de fermentar lactosa,
no esporógenas, gram negativas, aerobias y anaerobias facultativas.

2. ¿Cuál técnica es más confiable?

La técnica más confiable es la de filtración por membrana, una desventaja de este método es que
al incrementarse el crecimiento de otros microorganismos externos a los coliformes estos pueden
verse reprimidos por los mismos. Sin embargo resulta ser más confiable debido a que la técnica
de NMP es una técnica bastante imprecisa debido a que esta solo permite determinar que tipos de
microorganismos se tiene en el medio más no la cantidad exacta de microorganismos, por lo
tanto la determinación de poblaciones de microorganismos coliformes se hace difícil, o incluso
imposible (Venegas, 2014).

3. ¿Según sus resultados y las tablas de valores permitidos para una muestra como la que usted
trajo, qué calidad tiene su muestra? ¿Es adecuada para el consumo humano? Explique.
De acuerdo a los resultados obtenidos se puede afirmar que el agua tratada para la práctica no
es potable por ende no es apta para el consumo humano, debido a que esta sobrepasa los límites
de tolerancia de microorganismos presentes en la muestra. Comparando los resultados
obtenidos con los valores permitidos para determinar la calidad de agua se encontraron 4
unidades formadoras de colonias lo que resulta no apta para ser consumidos.

4. Si usted tuviera que consumir agua como la de su muestra, ¿cómo haría para mejorar su
calidad?
Existen métodos que ayudan a disminuir la carga microbiana que puede existir en el agua y
así mismo, disminuyen el riesgo de adquirir agentes patógenos causando gran variedad de
enfermedades. Una de las primeras medidas de precaución que se toman es la asentación y
filtración del agua, para esto, se pone el agua en un recipiente y se deja que el material
particulado de la muestra se precipite hacia el fondo del mismo, y posteriormente se lleva un
proceso de filtración, que puede ser por alguna membrana con tamaños de poro reducidos o
con una serie de material particulado apilado y comprimido en una columna por el cual el
agua contaminada pasa, eliminando gran cantidad de material particulado y microbios.
Después de realizar el anterior procedimiento se procede a poner el agua a hervir, para
eliminar microorganismos que puedan presentar remanencia en el líquido. También se le
puede añadir cloro o jugo de limón (Conant and Fadem, 2011).

5. ¿Qué tipo de riesgo para la salud implican los coliformes fecales en una muestra de agua?
Cabe resaltar que los coliformes fecales son un subgrupo de bacterias que se encuentran en
los intestinos de animales de sangre caliente. La presencia de este tipo de bacterias en aguas
indica que estas están contaminadas con heces o con residuos de alcantarillado (NCPH,
2009). Si se consume dicha agua en grandes cantidades, por muy bajo que sea la cantidad de
microorganismos en esta fuente, va a dar a la bacteria patógena la posibilidad de entrar
nuevamente a un hospedero y reproducirse (Organización panamericana de la salud, 2018).
Este tipo de bacterias se encuentran fuertemente relacionadas con las causas de enfermedades
diarreicas; por ejemplo, Shigellae dysenteriae es causante de la disentería, la cual presenta
una alta tasa de mortalidad. También pueden encontrarse Salmonella typhi, que causa fiebre
tifoidea, Salmonella spp, que causa salmonelosis, Vibrio cholerae, el cual actúa como agente
etiológico del cólera y por supuesto, la famosa Escherichia coli, que, además de ser el modelo
de bacteria de estudio más utilizado en el mundo, es causante de gran variedad de
enfermedades gastrointestinales (Mondaca and Campos, 2018).

6. ¿Qué otros organismos patógenos se pueden encontrar en una muestra de agua?

Existen diversos tipos de agentes patógenos que pueden estar presentes en una muestra de
agua. Muchos de estos patógenos están supeditados a ciertas condiciones que se presenten en
 el ambiente en donde se encuentre la fuente de agua, como, por ejemplo, población humana y
animal, intervención médica y si se encuentra influencia de aguas residuales. En anexos, en la
tabla 1 se observan los principales patógenos que se transmiten por el agua y su relación con
la salud (World Health Organization, 2018 y Ríos Tobón, Agudelo Cadavid and Gutierrez
Builes, 2017).
7. ¿Qué mejoraría en los procedimientos utilizados en esta práctica?

Se debe tener en cuenta que el frasco en el que se tome debe estar estéril, para evitar
contaminación externa o procedente del contacto con otras superficies y no contaminar las
pinzas para tomar las membranas.

ANEXOS

McConkey Chromocult EMB Endo SPC

Agar Chromocult

Agar EMB