PRESENTADO POR: DAYANNA MEDINA MUÑOZ

PRESENTADO A: ING. MARTHA P. APARICIO

PROYECTO DE AULA - BIOPROCESOS
INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZ
INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
2022
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Bioproceso de bebidas alcohólicas no destiladas (vino)
RESUMEN 1. DESCRIPCIÓN TEÓRICA
El proceso fermentativo se realizó aislando
la levadura silvestre de las cascaras de piña
El vino es una de las bebidas alcohólicas
(Ananas comosus), de la variedad Golden y
más consumidas en todo el mundo y cada
la levadura Saccharomyces cerevisiae se
país, región y bodega se rige por su propia
utilizó como microorganismo productor para
experiencia y conocimiento para prepararlo.
la fermentación de zumo de piña. Los
parámetros pH (5) y °Brix (16.5) No existe una metodología estándar para
presentaron los mejores resultados con un elaborar vino. En cambio, hay algunas
tiempo de fermentación de 72 horas. La etapas en este proceso que son
levadura Saccharomyces cerevisiae mostro indispensables para obtener esta bebida
mayor concentración de alcohol que fue del tan popular, mientras que otras son
1°GL. Mientras la levadura silvestre obtuvo opcionales o se aplican en casos muy
0.1°GLde alcohol. Asimismo se ajustó la específicos.
cinética de fermentación de zumo de piña al
modelo cinético de Michaelis – Menten,
obteniéndose los parámetros cinéticos del 1.1. ETAPAS DE LA
modelo. ELABORACIÓN DEL VINO
Palabras claves: Fermentación, modelo Materia prima: Se utilizó piñas
cinético y levadura sobremaduradas de la variedad Golden.
INTRODUCCIÓN Figura 1. Piña Golden.
La fermentación alcohólica constituye un
proceso para la obtención de productos
muy utilizados desde tiempos muy antiguos,
sin embargo este descubrimiento
permanece hasta hoy en día en una de las
ramas más importantes en cuanto a la
obtención de productos de uso industrial, el
alcohol es quizás el producto de obtención
por fermentación más conocido por sus
usos principales que radican en la
elaboración de bebidas alcohólicas. Por
otra parte este es un proceso bioquímico
muy complejo, en su realización y se debe
considerarse muchos factores y variables Fuente: Fruver home. Piña Golden. 2021.
que pueden afectar al producto de interés, Recepción y selección: Al momento de
tales como pH, ºBrix, Temperatura, recepción se verificó a que las piñas se
concentración del microorganismo encuentren bien en su apariencia
productor que al relacionarse entre sí senescente, que no presenten daño físico
adecuadamente pueden llegar a producir en la superficie de la fruta. Ya que esto
grandes cantidades de este metabolito de podría alterar algunos cambios
interés. fisicoquímicos en la fermentación

2
3
Bioproceso de bebidas alcohólicas no destiladas (vino)
alcohólica. Después se procedió Fermentación: Para la fermentación se
inmediatamente al pesado. preparó 500 ml de zumo de piña con pH de
5 y °Brix de 16.5. Después se procedió a la
Extracción de levadura de las cascaras
incubación en baño maría a 35ºC de
de piña: Para este proceso se midió
temperatura, por un tiempo de 72 horas.
250cm2 de la cáscara de piña y con la ayuda
de un hisopo se muestreo la levadura Mosto alcohólico: Una vez que se inicie la
silvestre de la superficie de piña, Por otro fermentación se controló el CO2. Después
lado el medio cultivo se esterilizó en se procedió a tomar de datos con el equipo
autoclave a 121°C/15 min. También se Multilog- Pro. Esto con la finalidad de
utilizó como medio de cultivo YPDA (1% realizar el modelamiento cinético de
extracto de levadura, 2% peptona fermentación de zumo de piña.
micológica, 2% de glucosa, 2% agar)
Figura 2. Diagrama de flujo para la fermentación de
suplementado con 25 mg/L de penicilina y zumo de piña con levadura silvestre de la fruta
cloranfenicol. Así mismo para la siembra de
la levadura silvestre se realizaron 3
preparaciones a diferentes diluciones (101
y 103). Después las placas se incubaron en
una incubadora a 27°C de temperatura por
un tiempo de 3 días y posteriormente se
hizo el recuentro de levadura silvestre
dando como resultado 2x105 CFU/g.
Inoculación de la levadura: La inoculación
de la levadura silvestre se realizó con la
adición de agua tibia a 30°C, en un tubo de
ensayo de 50ml en el cual se añade 30ml
de zumo de piña y cáscaras de piña
(250cm2) como levadura silvestre, luego fue
cubierto y dejado en reposo en una
incubadora a una temperatura de 27°C por
un espacio de 5 a 10 minutos, con un pH
óptimo de 5. La activación de la levadura se
nota por la formación de burbujas en la
superficie del reactor así mismo para iniciar Fuente: Tesis una. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL
ALTIPLANO. Puno Perú. 2017.
la fermentación alcohólica es necesario
realizar una agitación con el fin de 2. METODOLOGIA DEL
homogenizar, y finalmente dejar en reposo. BIOPROCESO (CINÉTICA DE
MICHAELIS MENTÉN)
Acondicionamiento: En este proceso se
mezcló la muestra y los insumos en un La fermentación alcohólica es un proceso
recipiente. Agregándose 500 ml de zumo de metabólico que se caracteriza por la
piña, 18 gramos de azúcar, 0.02 gramos de degradación incompleta del azúcar,
ácido cítrico y cascaras de piña (250cm2). anhídrido carbónico y etanol a través de
La cual se realizó con el fin de obtener enzimas de ciertos microorganismos,
resultados óptimos en la fermentación de levaduras básicamente; llevada a cabo por
zumo de piña.
3
4
Bioproceso de bebidas alcohólicas no destiladas (vino)
levaduras del género Saccharomyces
cerevisinas que actúa como complejo
enzimático para la degradación de los
azúcares tales como sacarosa y maltosa.
Figura 3. Curva de crecimiento de los
microorganismos
Fuente. : (Levenspiel, 2004).
La curva de crecimiento de
microorganismos se observa 4 fases
distintas; una fase de adaptación,
crecimiento exponencial, otra estacionaria y
una de muerte. Cada fase es de importancia
potencial en procesos microbiológicos. En
cuanto a las velocidades de formación de
etanol y CO2 estas están ligadas
directamente al crecimiento de la levadura
como se observa en la figura 4. Asimismo la
cinética de formación de cada producto
puede representarse en un cultivo
discontinuo. En la figura 4. Se muestra la
curva de la cinética de Fermentación
alcohólica con sus 4 fases distintas que
intervienen en la fermentación.
Figura 4. Cinética de la fermentación
alcohólica.
4
Fuente. (Muller, 2010).
Los rangos de pH y temperatura óptimos
para obtener mayores rendimientos y
velocidades de producción de etanol y CO2
en los cultivos sumergidos son a pH de 4 a
5.5 y temperatura de 28 a 35ºC,
respectivamente. Estas condiciones se
prefieren para fermentar mostos destinados
a la destilación, y duran entre 18 y 72 h. Sin
embargo, cuando se elaboran productos
que no van ser destilados, se seleccionan
temperaturas bajas para favorecer la
formación equilibrada de aromas y sabores.
La ingeniería bioquímica en la evaluación
de datos en la concentración celular,
viabilidad y observación microscópica de la
distribución de células Saccharomyces
cerevisiae en esferas de carraginina,
llevados a cabo en un reactor de lecho
empacado obteniendo mejores resultados
de fermentación en el contorno del reactor,
esto debido a la transferencia adecuada de
calor de 30- 35 °C . También existen
algunos factores que afectan de forma
importante el desarrollo de la fermentación
y con ello el rendimiento como son el tipo de
levadura, la concentración del sustrato, la
temperatura, el pH y entre otros.
Fermentación con levaduras.
Aproximadamente el 96% de la
fermentación del etanol se lleva a cabo
mediante cepas de Saccharomyces
5
Bioproceso de bebidas alcohólicas no destiladas (vino)
Cerevisiae se produce durante la
glicolización etanol, la reacción global es la
siguiente:
Glucosa + 2 ADP 2 Etanol + 2 CO2 + 2ATP
El rendimiento teórico de un gramo de
glucosa es de 0.51g de etanol y 0.49g de
CO2 sin embargo en la práctica
aproximadamente el 10% de la glucosa se
transforma en biomasa y el rendimiento de
etanol y CO2 alcanzan el 90% del valor
teórico. La Saccharomyces cerevisiae es
anaerobia facultativa, por lo que se obtiene
un mayor rendimiento de biomasa en
aeróbiosis que en anaerobiosis. El cultivo
aerobio es importante durante la
propagación del inóculo, llamado también
cultivo semilla, siendo su objetivo la
acumulación del mayor número de células
sanas en el menor tiempo posible.
Menciona que los demás levaduras de vino
y en particular las levaduras de
Saccharomyces cerevisiae no se cualquiera
de los sistemas de fermentación
muestreados que aparentemente es
diferentes de los otros jugos de frutas. Estos
hallazgos sugieren que el jugo de uva
recién triturado puede tener algunos efectos
en las otras levaduras autóctonas que
tienen un papel importante en la
fermentación alcohólica. En un cultivo
sumergido (cinética), la velocidad
específica de crecimiento de la levadura se
puede representar con la ecuación cinética
general para los microorganismos
unicelulares:
Dónde:
ln: Logaritmo natural, adimensional.
µ: Velocidad específica de crecimiento de la
levadura, h-1.
5
X1: Concentración de biomasa de levadura
al tiempo.
X2: Concentración de biomasa de levadura
al tiempo.
Δt: Intervalo de tiempo t2 – t1, h.
2.1. MODELAMIENTO CINÉTICO.
Como una introducción, debemos
mencionar que la vida microbial es
esencialmente química en la naturaleza. En
una célula viviente, cientos de reacciones
químicas tienen lugar usualmente en forma
bien balanceada. La velocidad de la
reacción química es descrita con un grupo
de modelos matemáticos llamados
ecuaciones cinéticas, esta velocidad es una
función de la concentración y de los
reactantes Para entender el
comportamiento de cualquier fermentación,
es necesario el estudio cinético que
consiste en la medición o estimación de las
velocidades de síntesis celular, formación
de productos y de los efectos del medio
ambiente sobre estas velocidades la fig. 5.
Los modelos a nivel celular abarcan
mayormente proceso de lote o batch, que
son los de mayor importancia comercial. Se
menciona que en los modelos cinéticos, es
esencial la distinción entre modelos
estructurados y no estructurados. De
manera que los modelos matemáticos de
una reacción bioquímica están basados en
los modelos cinéticos para el crecimiento de
una población de microorganismos. La
descripción matemática varía en
complejidad dependiendo del número y tipo
de asunciones realizadas. Los modelos
cinéticos para el crecimiento de una
población de microorganismos constituyen
la base para un modelo matemático global
en un reactor bioquímico. (Erazo &
Palomino, 1999), en su artículo de cinética
de reacciones bioquímicas presenta el
modelo cinético de Michaelis - Menten para
6
Bioproceso de bebidas alcohólicas no destiladas (vino)
la determinación de la velocidad de Figura 5. Velocidad de reacción y constante de
crecimiento celular, el cual se define como: Michaelis - Menten

Modelo de Michaelis - Menten:

Dónde: µ: velocidad de la reacción del

sustrato.
S: constante de saturación.
µmax: velocidad máxima
km: constante de Michaelis Menten

Fuente. (Connor, 2000)

2.2. CINÉTICA DE MICHAELIS –
MENTEN
b) Velocidad de reacción/velocidad 'µ’
La cinética de Michaelis - Menten describe
La velocidad (µ) indica el número de
la velocidad de reacción de muchas
reacciones por segundo que son
reacciones enzimáticas. Su nombre es en
catalizadas por una enzima. Con
honor a Leonor Michaelis y Maud Menten.
concentraciones crecientes de sustrato [S],
Este modelo sólo es válido cuando la
la enzima va acercándose asintóticamente
concentración del sustrato es mayor que la
su velocidad máxima (µmax), pero nunca la
concentración de la enzima, y para
alcanza. Por esta razón, no hay un [S]
condiciones de estado estacionario, o sea
determinado para la µmax. De todas
que la concentración del complejo enzima-
formas, el parámetro característico de la
sustrato es constante
enzima está definido por la concentración
a) Determinación de Constantes de sustrato a la cual se alcanza la mitad de
la velocidad máxima (µmax/2).
Para determinar la velocidad máxima de
una reacción enzimática, la concentración c) Constante de Michaelis - Menten (Km)
de sustrato ([S]) se aumenta hasta alcanzar
Entonces, aunque la concentración de
una velocidad constante de formación de
sustrato a Vmax no puede ser medida
producto. Fig. 5. Esa es la velocidad
exactamente, las enzimas pueden ser
máxima (µmax) de la enzima. En este caso,
caracterizadas por la concentración de
los sitios activos de la enzima están
sustrato a la cual la velocidad de reacción
saturados con sustrato. En la figura 5. Se
es la mitad de la velocidad máxima. Esta
muestra el grafico de velocidad de reacción
concentración de sustrato se conoce como
y constante de Michaelis – Menten durante
constante de Michaelis - Menten (Km).tal
la fermentación.
como se muestra en la figura 6. Esta
constante representa para enzimas que
exhiben una cinética de Michaelis - Menten
simple, la constante de disociación (la
afinidad del complejo enzima - sustrato (ES)
por el sustrato). Valores bajos indican que
6
7
Bioproceso de bebidas alcohólicas no destiladas (vino)
el complejo (ES) está unido muy
fuertemente y raramente se disocia sin que
el sustrato reaccione para dar producto.
Figura 6. Velocidad inicial en función de la
[S].
Fuente: (Connor, 2000).
d) Parámetros derivados de análisis de
Michaelis – Menten. Km:
Indica la concentración de sustrato
intracelular es una constante para una
enzima determinada Km = (k2 + k-1)/ k1
está relacionada con la “afinidad” de la
enzima por su sustrato.
µmax: es un parámetro directamente
proporcional a la concentración de enzima
total µmax= kcal [Et] no es una constante ya
que depende de [Et].
Número de recambio: Número de moléculas
de sustrato transformados por minuto por
mol de enzima Kcal [1/s] mide la eficiencia
de la enzima “turnover number” sirve para
comparar enzimas 1/kcal [seg] tiempo de un
ciclo catalítico.
Constante de especificidad: sirve para
comparar la eficiencia de una enzima dada
para distintos sustratos Kcal/Km. 1
3. TECNOLOGÍA BIOTECNOLÓGICA
1
Tesis una. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO.
Puno Perú. 2017
7
La elaboración de vino es antigua, pero las
bodegas imponen nuevas tendencias
basadas en tecnologías biológicas para
optimizar el proceso y mejorar el producto
final.
La palabra “biotecnología” suele asociarse
con procesos modernos y, en ocasiones, de
difícil comprensión. Sin embargo, la
biotecnología es antigua como la
humanidad. El empleo de seres vivos para
la obtención de productos de consumo
humano lleva miles de años de historia. Uno
de estos procesos de la biotecnología
tradicional es la elaboración de bebidas
alcohólicas, como el vino. Actualmente, la
biotecnología moderna aporta novedades
que mejoran la producción enológica y la
calidad del producto final.
Levaduras en la industria del vino
La vitivinicultura tiene unos 4000 años.
Desde que los egipcios y babilonios
cultivaron vides e hicieron vinos por primera
vez, la industria enológica y sus productos
tuvieron, y tienen hasta hoy, gran
importancia social, económica y cultural. En
la actualidad, la producción enológica no
solo deleita el paladar de millones de
personas, sino que los viñedos y bodegas
se han convertido en un atractivo turístico
mundial.
En sus comienzos, los hombres
recolectaban uva para su consumo y, al
almacenarla, se formaba espontáneamente
esta bebida espirituosa. En aquellas épocas
no se conocían las transformaciones
biológicas detrás de la producción del vino.
Hoy se sabe que el proceso principal por el
cual se transforma el mosto de la uva en
vino es la fermentación alcohólica, que
consiste en la transformación de los
8
Bioproceso de bebidas alcohólicas no destiladas (vino)
azúcares contenidos en la uva, en alcohol Para saber si la inoculación es exitosa y la
etílico y dióxido de carbono. levadura añadida produce la fermentación
esperada, hoy en día se pueden emplear
Las responsables de esta transformación
métodos moleculares para analizar el
son las levaduras, hongos microscópicos
material genético (ADN) de las levaduras,
adheridos al hollejo de la uva. Al nutrirse de
conocer su estabilidad y detectar si se
los frutos, las levaduras liberan sus
producen cambios que puedan afectar el
productos que el hombre aprovecha para su
producto. Estas técnicas brindan resultados
beneficio. El uso de seres vivos para la
rápidos, fiables y relativamente
obtención de un producto útil es lo que
económicos, importantes cuando se
define a un proceso como “biotecnológico”.
manejan grandes volúmenes de cultivo.
1.1. Nuevas tecnologías en la
3.1. Levaduras mejoradas
producción de vinos
genéticamente
La revolución provocada en los últimos 30
Otra de las mejoras en la elaboración de
años por el desarrollo de las técnicas de
vinos se está dando por el uso de enzimas
Ingeniería genética, ha abierto muchas
(catalizadores o aceleradores biológicos) y
opciones para el control de los procesos
organismos genéticamente modificados en
biotecnológicos. Estos avances permiten
estos procesos. La modificación genética se
hoy la utilización de diversas herramientas
aplica tanto a las levaduras como a la vid,
moleculares y organismos genéticamente
un proceso aún en etapa experimental. En
modificados en el proceso de fabricación de
la vid, se ha logrado introducir genes para
vinos.
producir plantas transgénicas resistentes a
La levadura vínica más importante es ciertas enfermedades víricas y fúngicas.
Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo,
Sin embargo, el mayor avance se ha
cuando la materia prima llega a la bodega
obtenido mediante el empleo de levaduras
tras la vendimia, muchas otras especies de
recombinantes en la elaboración del vino.
levaduras están presentes, además de
En base al conocimiento de los
hongos filamentosos, bacterias y virus, y
mecanismos de adaptación a estrés de las
normalmente, en mayor número que
levaduras vínicas y a la identificación de los
Saccharomyces cerevisiae.
genes implicados en ellos es posible
También las cambiantes condiciones diseñar estrategias de manipulación
meteorológicas provocan una gran genética para conseguir una mejor
variabilidad de la calidad y cantidad de respuesta a las condiciones que
levaduras presentes en la materia prima comprometen la eficiencia de las levaduras
durante las sucesivas campañas. Este
La técnica del ADN recombinante ha
problema puede solventarse añadiendo al
cambiado en pocos años el panorama de la
mosto un cultivo iniciador de levadura
biotecnología, y ha posibilitado hazañas
seleccionada que, de esta forma, dé lugar a
impensables hace unas cuantas décadas.
una fermentación homogénea año tras año
Sin embargo, no se debe lanzar el mensaje
de que ahora todo es posible.2

2
Divinus. El vino, un producto biotecnológico milenario.
Colombia. 27 marzo, 2014

8
9
Bioproceso de bebidas alcohólicas no destiladas (vino)
4. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Ajuste del modelo cinético de Michaelis –
Menten en función al parámetro de CO2 con
dos tipos de levaduras Saccharomyces
Cerevisiae y levadura silvestre.
Para el ajuste del modelo cinético de
Michaelis – Menten se estudió dos tipos de
levaduras Saccharomyces cerevisiae y
silvestre.
Figura 7. Concentración de CO2 durante el
proceso de fermentación con la levadura
Saccharomyces cerevisiae, CO2 en función
al tiempo
formación de cada producto puede
representarse en un cultivo discontinuo3.
Asimismo, indican que las primeras 24
horas con 5320 seg existe alta producción
de CO2 llegando hasta máximo de 9081.573
ppm. Esto es debido a que el sustrato
contiene carbohidratos suficientes para su
mayor desarrollo poblacional de levaduras.
Por lo tanto durante la fermentación del
zumo de piña se observa que la presión
producida es proporcional al CO2. Por su
parte precisan que las condiciones
adecuadas para la fermentación alcohólica
son la temperatura, CO2, O2, presión,
agua, nutrientes y pH. Así como de
sustancias alimenticias que ella puede
asimilar con facilidad. Asimismo para que la
fermentación sea efectiva se tomó en
cuenta estas condiciones adecuadas4.
Ajuste al modelo de Michaelis – Menten.

Figura 8. Concentración de CO2 durante el

Fuente: Tesis una. UNIVERSIDAD NACIONAL proceso de fermentación con la levadura
DEL ALTIPLANO. Puno Perú. 2017. silvestre, en función al tiempo.

En la figura 7, se puede observar que

durante el periodo de la fermentación del
mosto hay un crecimiento en la
concentración de CO2 en función al tiempo.
En 8989.25 segundos comienza a
estabilizarse la concentración de CO2 hasta
8096.45 ppm. Debido a que el sustrato
alcanza su mayor desarrollo poblacional en
microorganismos, siendo consumidas en
mayor cantidad de azúcar; posteriormente
disminuye hasta un valor despreciable. Al
respecto se menciona que en cuanto a las Fuente: Tesis una. UNIVERSIDAD NACIONAL
DEL ALTIPLANO. Puno Perú. 2017.
velocidades de formación de etanol y CO2
están ligadas directamente al crecimiento Como se puede apreciar en la Figura 8. La
de la levadura de este modo, la cinética de concentración de CO2 en función al tiempo.

3 4
Levenspiel. INGENIERÍA DE LAS REACCIONES. 2004. Leveau & Bouix. MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL. 2000.

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10
Bioproceso de bebidas alcohólicas no destiladas (vino)
Se observa que a los 4030 segundos hasta 6. BIBLIOGRAFIA
10800 segundos hay mayor cantidad de
producción de CO2 llegando hasta
8023.56ppm en donde comienza a 1. Tesis una. UNIVERSIDAD
estabilizarse la levadura. Por su parte se NACIONAL DEL ALTIPLANO. Puno
menciona que teniendo una materia Perú. 2017.
entrante de glucosa se tiene una cantidad 2. Divinus. El vino, un producto
de 51.1 Kg de etanol y CO2 de 48.9 Kg5. Por biotecnológico milenario. Colombia.
otro lado esta actividad fermentativa se 27 marzo, 2014.
forma etanol y se desprende gas carbónico, 3. Levenspiel. INGENIERÍA DE LAS
en la medida que su concentración de CO2 REACCIONES. 2004.
aumenta en el recipiente de fermentación, 4. Leveau & Bouix. MICROBIOLOGÍA
la presión aumenta y trae como INDUSTRIAL. 2000.
consecuencia una disminución de la
actividad celular.
5. Montes & Arevalo. Determinación del
calor de respiración de frutas por el
5. CONCLUSIONES método de titulación. 2001.
El modelo cinético de Michaelis- Menten se
ajustó a un valor de velocidad máxima de
crecimiento 0.00297s-1 y constante de
Michaelis - Menten 5.940g/L para
Saccharomyces cerevisiae. Mientras para
la levadura silvestre se obtuvo una
velocidad máxima de crecimiento es
0.0468s-1 y constante de Michaelis- Menten
140.400g/L. La comparación realizada entre
dos tipos de levadura utilizadas en la
fermentación de zumo de piña tiene un
efecto significativo en cuanto a la obtención
de alcohol en el proceso de fermentación
donde se obtiene 1°GL con la levadura
Saccharomyces cerevisiae. Con un tiempo
de 72 horas.

5
Montes & Arevalo. Determinación del calor de
respiración de frutas por el método de titulación. 2001.

10