Laboratorio de Microbiología industrial

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

OBJETIVOS

● Producción de vino a partir de procesos microbiológicos como producto de valor

agregado.
● Reconocer los sistemas tipo batch y sus facultades en la manipulación de
microorganismos a nivel industrial a pequeña escala.
● Agrupar el conocimiento previo sobre las características de cada microorganismo
para comprender el proceso global de la fermentación alcohólica.

PENSAMIENTO CONTINUO

INTRODUCCIÓN

El proceso de fermentación
se lleva a cabo en un
fermentador o biorreactor,
que contiene un medio de
cultivo compuesto por
determinados sustratos que
son transformados
por acción microbiana en
metabolitos, nuevos productos generados a través de actividades catabólicas y anabólicas,
o biomasa, debido a que el microorganismo aumenta su concentración en el transcurso del
proceso de fermentación a medida que va modificando el medio; estos fenómenos de
crecimiento y formación de producto puede desarrollarse simultáneamente o no, según sea
el microorganismo utilizado. El comportamiento de un microorganismo en crecimiento es
determinado por su interacción con el medio ambiente creado en el reactor, por efectores
intracelulares, como dotación genética intrínseca y mecanismos de regulación metabólica, y
extracelulares de naturaleza física y química, como la temperatura y los componentes del
medio, , respectivamente, que deben cumplir con todos los requerimientos nutricionales y
requerimientos específicos indispensables para la formación del producto deseado.[1]

La fermentación alcohólica, también llamada como fermentación del etanol o etílica, es un

proceso anaeróbico realizado por levaduras, mohos y algunas bacterias, es llevada a cabo
principalmente por Saccharomyces cerevisiae, que tiene la capacidad de convertir hasta un
90% de la glucosa en cantidades equimolares de alcohol y CO 2 , cuya finalidad biológica es
proporcionar energía de forma anaeróbica disociando las moléculas de glucosa en ácido
pirúvico, que es descarboxilado en CO2 y acetaldehído, este último es reducido en alcohol
etílico por la acción de la enzima deshidrogenasa. [2 ] La presencia de azúcares asimilables
superiores a 0.16 g/l-1 produce invariablemente formación de alcohol en proceso de
crecimiento de levadura de Saccharomyces cerevisiae aún en presencia de exceso de
oxígeno. Este fenómeno es denominado como efecto Crabtree.[1]

PENSAMIENTO ESTRUCTURAL

Materiales y reactivos:
● Reactor
● Pulpa de fruta
● Azúcar
● Fosfato diamónico libre de arsénico
● Cepa de Saccharomyces cerevisiae
● pHmetro
● Brixómetro
● Densímetro para líquidos pesados
● Alcoholímetro
● Bureta de 25 ml
● Soporte y pinza de bureta
● 2 Vasos de precipitado de 100 ml y de 250 ml
● NaOH, 0,1N
● Botellas para envase

Métodos:
● Determinación de ph
● Titulación
● Recuento de microorganismos en cámara neubauer
● Determinación de grados brix
● Determinación de grados alcohólicos

Inicio de la fermentación: 13 de noviembre de 2019

La fruta seleccionada por los cuatro integrantes del mesón, fue comprada
por tres de ellos, de los cuales dos compraron dos libras y el otro estudiante
compró una sola libra de guanábana, cada uno se encargó de retirar la
cáscara, lavarla, extraerle las semillas, diluirla en agua en una proporción
2:3 [pulpa 2: agua 3] realizando licuados y filtraciones para su homogeneización.
Posteriormente se envasó en un recipiente previamente higienizado y se llevó al
laboratorio en un lapso de tiempo menor a 12h tras su preparación.

Luego de agregar la pulpa diluida al recipiente de fermentación se midieron los

grados Brix con la intención de medir la cantidad de azúcar proporcionada
naturalmente por la fruta y así calcular y agregar la cantidad faltante para completar
20°Brix.

4300 mL de pulpa fueron depositados en el recipiente y midieron 9°Brix

Se llevó a un volumen final de 6000 mL adicionándole agua se calcularon los

Grados Brix equivalentes a ese nuevo volumen

C1V1=C2V2 → (9°Brix)(4300 mL)= (C2)(6000 mL) C2=

6.45°Brix

6.45°Brix corresponde al azúcar que la guanábana le proporciona a la reacción.

 Si se quiere empezar la fermentación con 20°Brix, quiere decir que faltan 13.55°Brix,
que serán proporcionados al añadirle azúcar comercial a la reacción. Se debe
establecer a cuántos gramos de azúcar equivalen dichos grados.

13.55°Brix =135.5 g/L

Teniendo 6 litros como volumen se tiene que (135.5 g/L)(6L)= 813g de azúcar

Se estableció una concentración de 0.5g/L de fosfato diamónico por lo que al tener 6

litros como volumen se añadieron 3g de fosfato diamónico

Durante las dos semanas del proceso de fermentación se llevó a cabo

la medición de las variables mencionadas, una vez al día, diariamente
(en los días de actividad académica)

Interrupción del proceso de fermentación: 26 de Noviembre de 2019

Filtrado y envasado del vino: 3 de Diciembre de 2019

Mediciones de variables de control:

PENSAMIENTO CIENTÍFICO
Hipótesis nula
Se obtiene una producción de alcohol insuficiente o reducida, a razón de una posible
contaminación, generalmente por bacterias del género Lactobacillus sp, Micrococcus sp.
Sporolactobacillus sp y Zymomonas mobilis, debido a que se establece un efecto
competitivo por el sustrato. También, podría deberse a la floculación de las células de
levadura, que consiste en la agregación de las células de levadura, lo que disminuye la
velocidad de producción de alcohol y, por último, la variación de las condiciones de
fermentación, tales como temperatura, pH, etc; que tienen gran influencia sobre el proceso
de fermentación.

Hipótesis alterna
Se logra producir un vino de Guanábana utilizando el método de cultivo de Batch, cultivo
discontinuo, adicionando la cepa de Saccharomyces cerevisiae que en presencia de una
alta cantidad azúcares asimilables ( 24 grados Brix) y condiciones favorables para su
crecimiento, acelera la degradación de la glucosa produciendo grandes cantidades de ATP
a través de la fosforilación oxidativa dando lugar al ciclo de los ácidos tricarboxílicos y
disminuyendo el consumo de oxígeno, por lo cual, producirá grandes cantidades de etanol
en condiciones aerobias (efecto Crabtree).

PENSAMIENTO OPERACIONAL

Resultados
Representación del seguimiento de las variables de control durante el periodo de
fermentación [13 Noviembre al 22 de noviembre]

Tabla 1/Gráfica 1. Variación de los grados Brix en los ocho días de medición
Tabla 2/ Gráfica 2.Variación del pH en los ocho días de medición

Tabla 3/ Gráfica 3. Variación de la acidez en

los ocho días de medición

Tabla 4/ Gráfica 4. Variación

del recuento celular en los ocho días de medición
PENSAMIENTO GENERALIZADOR

La realización del ensayo de fermentación alcohólica tuvo su inicio a partir de la utilización

de un reactor, construido teniendo como base un recipiente plástico al cual fue adaptada
como una trampa de anaerobiosis y dos llaves de paso para la extracción de muestras a
evaluar, en conjunto con la pulpa de fruta extraída desde casa por cada uno de lo
integrantes del grupo. Fue seleccionada la Guanábana como el componente principal y su
pulpa fue obtenida a partir de varios procesos de licuado.

El día 13 de noviembre, fueron llevados los implementos previamente descritos para el

montaje del proceso. Fue necesaria la realización de un nuevo licuado a partir de gazas
para disminuir la presencia de exceso de fibra y porciones de fruta de tamaño considerable
que pueden generar complicaciones en el procesamiento y seguimiento. Se seleccionó a
Saccharomyces cerevisiae como el microorganismo encargado de la conversión de los
azúcares del líquido rico en Guanábana en alcohol a partir de un proceso, en esencia,
anaerobio y se añadió al biorreactor dando inicio al proceso de fermentación. Sin embargo,
no se propició un ambiente para la activación de la levadura, lo cual pudo retrasar un poco
el desarrollo del microorganismo en el medio como se evidencia en la gráfica número 4.

Con el proceso en marcha fueron tomados los parámetros fundamentales a tener en cuenta
para un proceso de fermentación alcohólica correcto. Estos parámetros son el pH, como
medida de la cantidad de iones de hidrógeno disponibles en el medio libremente; la acidez,
como parámetro indicador de la cantidad de iones de hidrógeno libre y asociado; los grados
brix, para la determinación de la concentración de azúcares disponibles; y el número de
levaduras, el cual indica la cantidad del microorganismo desarrollándose de manera
eficiente. Cambios en estas variables permiten determinar fallos en el proceso de
fermentación.

Los resultados obtenidos muestran un proceso controlado globalmente. El pH varía, pero

logra mantenerse dentro del rango aceptable para la producción de vino. La acidez, por su
parte, muestra un aumento de los protones generales, esto quiere decir, un incremento en
la cantidad de iones de hidrógeno total, tanto los libres como los unidos al ácido producto de
la fermentación. La disminución en la concentración de azúcares registrada a partir de
grados brix está correlacionada con la actividad el microorganismo, el aumento en la acidez
y del alcohol por efecto del metabolismo. Por otra parte, el número de levaduras registrado
tuvo un crecimiento coherente los primeros días, pero el día 6 no se obtuvo el resultado
esperado, lo que indica un error aleatorio con una alta probabilidad de haber sido generado
durante la preparación de la dilución.

A partir del momento en el que fue puesta la pulpa de la Guanábana a fermentar con la
levadura se tomaron lectura de paramentos (pH, Titulación, grados brix, y titulación) una vez
al día todos los días de lunes a viernes hasta alcanzar un porcentaje de grados brix de cero
lo que indicaba que la levadura habría consumido toda el azúcar del medio, por lo que fue
necesario detener la fermentación añadiendo 1,1 gramos de bisulfito. Una vez detenida la
fermentación se procedió a realizar el proceso de clarificado para obtener el vino, proceso
que se realizó añadiendo gelatina sin sabor para lograr sedimentar compuestos que pueden
encontrarse en exceso, tales como, levaduras muertas, sales, entre otro. Se extrajo el vino,
el cual fue el sobrenadante final, se midieron sus grados licorosos y, posteriormente, se
realizó el proceso de envasado culminando con el proceso y dando por confirmando la
veracidad del procedimiento para la formación de una bebida alcohólica tipo vino.

CONCLUSIONES

● Se logró realizar la fermentación alcohólica utilizando una cepa de Saccharomyces

cerevisiae en un cultivo constituido por pulpa de guanábana, se obtuvo
aproximadamente 4 litros de vino con un grado de alcohol de 6, aproximadamente;
por lo tanto, se rechaza la hipótesis nula y se acepta la alterna.

Bibliografía

1. Ertola, R., Yantorno, O., & Mignone, C. (2006). MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

[Ebook] (1st ed., pp. 8-10). Washington, D.C.: Departamento de Educación, Cultura,
Ciencia y Tecnología. Retrieved from https://docs.google.com/viewer?
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2. Fermentación alcohólica - EcuRed. (2019). Retrieved 10 December 2019, from
https://www.ecured.cu/Fermentación_alcohólica
3. Mishel,A. y Sánchez, A. (2016). Evaluación de sedimento de vino de mora y su uso
en la elaboración de compost en la Empresa Alma Natura de la Ciudad de
Riobamba. Escuela Superior Politécnica de Chimborazo.