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 INTRODUCCION:

El fraccionamiento celular es una técnica que nos permite obtener componentes

celulares aislados, en grandes cantidades y con alto grado de pureza, a partir de un
tejido, es decir,
diferentes estructuras subcelulares se separan por centrifugación de homogeneizados.
Los homogeneizados se preparan rompiendo las células de los órganos o tejidos, en
medios apropiados que preservan los organelos, para lo cual se emplean soluciones de
sacarosa u otros azúcares que permitan conservar la integridad de los organelos y evitar
la tendencia de estos a volverse agrupar después de sacarlos de la célula.
El método más empleado para separar los organelos celulares es la centrifugación
diferencial, que consiste en someter al homogeneizado a diferentes velocidades en la
centrifuga para lograr las separaciones, basadas sobre diferencia de densidad y tamaño
de los organelos.

OBJETIVO:

 El objetivo principal de esta práctica es extraer biomoléculas y los organelos

subcelulares por centrifugación diferenciada.

METODO:

En esta práctica utilizaremos la centrifugación diferenciada, la cual consiste en

someter el homogeneizado a diferentes velocidades en la centrifuga para lograr
separaciones, basadas en la diferencia de densidades y tamaño y peso de los organelos.
Este tipo de centrifugación debe hacerse a una temperatura de 4°C.
MATERIALES:

 Un mortero
 Placas de Petri
 Muestras de sangre
 Balanza
 Centrífuga
 Un hígado de pollo
 Tubos de ensayo

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Materiales Reactivos:

 Solución de sacarosa

 Solución de NaCl 0,85 %

 Sol. de KCl 0,154 M

PROCEDIMIENTO:

 A PARTIR DE UNA MUESTRA DE SANGRE:

1. Desinfectar el Pulpejo del Dedo con alcohol

2. Pinchar con una lanceta, y tomar la muestra en tubos capilares
3. Sellar los capilares con plastilina.
4. Colocar las muestras en la centrífuga y centrifugar a 5,000 rpm x 6
minutos
5. Separar el plasma en tubo eppendorf.
6. Guardar a 4°C para su posterior análisis.
 A PARTIR DE UN ORGANO:
1. Colocamos el hígado en la placa Petri
2. Perfusión: Inyectar KCl 0.154 M helado hasta que expulse los residuos
de sangre, quedando el tejido más claro.
3. Allí mismo pesamos 2 gramos y trituramos con una tijera
4. Agregar la misma cantidad de KCl y triturarlo en el mortero.
Obtendremos un homogeneizado
5. Filtramos el homogeneizado, colocamos en un tubo de ensayo y luego
contrapesar para colocarlo en la centrífuga
6. Colocar los tubos de ensayo con homogeneizado en la centrífuga
7. Obtención de la fracción nuclear: el sedimento formado por núcleos y
células que no rompieron durante la homogeneización y fragmentos de
membranas plasmáticas.
8. Obtención de la fracción mitocondrial y obtención de la fracción
microsomal:
9. El sobrenadante último se le denomina fracción soluble y contiene
algunas enzimas que no forman parte de las estructuras intracelulares.

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 RESULTADOS:

En cada experimento se obtuvo dos fracciones un sobrenadante y un sedimento o pellet. Las

cuales se organizaron en las siguientes tablas.

 A PARTIR DE UNA MUESTRA DE SANGRE:

Tabla 1: Resultados del fraccionamiento subcelular a partir de la muestra de sangre

Centrifugación Sobrenadante Precipitado

Nombre Contenido Nombre Contenido
5000 rpm x 6 minutos Plasma Agua y Elementos Glóbulos
proteínas y formes blancos,
otras glóbulos
biomoléculas rojos y
plaquetas.

• A PARTIR DE UN ÓRGANO:
Tabla 2: Resultados del fraccionamiento subcelular a partir de un hígado de pollo

centrifugación Sobrenadante Sedimento

Nombre Contenido Nombre Contenido
1000 gravitaciones Liquido partículas fracción nuclear Núcleos y
postnuclear menos células
densas no
sedimentada
s
10,000 Liquido partículas fracción mitocondrias y
gravitaciones postmitocondria menos mitocondrial: lisosomas
l densas no
sedimentada
s
100,000 Cytosol o sabia contiene fracción microsomas,
gravitaciones celular algunas microsomal fragmentos de
enzimas, y retículos
biomoléculas. endoplasmático
y membrana
plasmática.

DISCUSION:
El fraccionamiento subcelular realizado mediante el método de centrifugación
diferencial es muy usado Es una técnica utilizada para separar los distintos orgánulos y
componentes celulares con miras a su estudio bioquímico y con el microscopio
electrónico (Bobadilla, Et al. 2010). La técnica inicia con el homogeneizado, existen

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muchas maneras tanto químicas como mecánicas para realizarlo. En esta práctica se
realizó con tijeras y un mortero lo cual permite la lisis de la célula sin dañar los
organelos.
En la muestra de sangre es necesario el uso de anticoagulante EDTA que preserve la
muestra. En el proceso de centrifugación los elementos formes se precipitan dejando un
sobrenadante, que es el plasma.

No todas las células sedimentan a la misma velocidad. Las células más grandes se
sedimentan más rápido que las pequeñas. Por lo tanto, se puede separar un tipo de célula
de otro si hay una diferencia suficiente en el tamaño y la velocidad de sedimentación.
Por ejemplo, las plaquetas se pueden separar de los glóbulos rojos y blancos porque son
mucho más pequeñas. Solo es necesario elegir la combinación correcta de fuerza
centrífuga y tiempo. Si la sangre se centrifuga a 2900 g durante 3 minutos, las plaquetas
no tendrán tiempo de desplazarse hacia abajo con las células más pesadas y se pueden
obtener un plasma rico en plaquetas (Flores Rojas, 2016).

Los tejidos preparados para el fraccionamiento subcelular es necesario que estén suspendidos
en una solución amortiguadora isotónica. Esto es para mantener constante el pH frente a
cualquier cambio brusco y así la integridad de los organelos y enzimas durante el proceso.
Además, debe un ambiente frio no permitirá la desnaturalización de las proteínas.

El homogeneizado sometido a la primera centrifugación, que fue de 1000 veces la fuerza de

gravedad durante 10 minutos. Se obtuvo como resultado un sedimento (fracción nuclear)
donde se encontraban los núcleos celulares y algunas células que no fueron desnaturalizadas
en la homogeneización. Esto se debe a que el tamaño y densidad de los componentes del
precipitado es mayor que la del sobrenadante. La manera de saber si hemos realizado de
manera correcta y la fracción nuclear contiene los núcleos celulares es midiendo la
concentración de ADN de los precipitados y el mayor será la fracción nuclear (Paniagua, et al.
2007).

El sobrenadante que se somete a una segunda centrifugación de 10000 veces la fuerza de la

gravedad forma un sedimento donde se encuentran las mitocondrias, lisosomas y
peroxisomas. Este sedimento es llamado fracción mitocondrial y el sobrenadante es llamado
liquido postmitocondrial. Bobadilla, K. Et al, (2010) menciona, es necesario verificar que las
operaciones que realizamos son correctas, por ello para verificar la presencia de mitocondrias,
lisosomas y peroxisomas en la fracción mitocondrial se mide la actividad de la enzima
glutamato deshidrogenasa. Ya que la mayor actividad de ellas se produce en las mitocondrias.

El sobrenadante sometido a la tercera centrifugación (100000 g, 2 horas), formando un

sedimento llamado fracción microsomal. Este contiene retículo endoplasmático rugoso y
ribosomas libres. Su existencia en el precipitado se comprueba con la actividad de la glucosa-6-
fosfatasa, ya que esta enzima está ligada a la membrana del retículo endoplasmático ( Rigalli,
2016).
Al final de todo el proceso queda un sobrenadante llamado fracción soluble, donde se
encuentran microtúbulos y filamentos, membrana plasmática, enzimas y biomoléculas. El
método para comprobar la existencia de sus componentes es midiendo la actividad del lactato
deshidrogenasa.

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Algunas de las aplicaciones tienen las fracciones obtenidas el fraccionamiento
subcelular son:
 Identificación y caracterización de organelos
 Entrega información acerca de la organización estructural y funcionalidad de la
célula.
 Reconocimiento de proteínas
 Localización de actividades enzimáticas
 Permite entender el funcionamiento gracias al estudio detallado de sus partes.

CONCLUSIONES:

o En esta práctica de laboratorio que el procedimiento debe hacerse en

temperaturas fría para evitar la desnaturalización proteica.

o Las fracciones celulares son ampliamente usadas para la investigación en la

bioquímica y fisiología de organelos fuera del ambiente complejo de la célula
intacta.

o La fracción nuclear se obtuvo a 1000g x 10min de homogeneizado de hígado.

o Se obtuvo la fracción soluble en el sobrenadante, separando la fracción

microsomal.

o La sangre está constituida por plasma y elementos formes, que contiene

biomoléculas de importancia.

REFERENCIAS:

Pardo Fernández, P., Matus de la Parra, A., & San Juan Serrano, F. (2011). Búsqueda de
marcadores de madurez de los gametos durante el ciclo gametogénico de Crassostrea gigas
(Thunberg, 1873). Boletín. Instituto Español de Oceanografía, 18(1-4), 165-173.
http://193.146.153.28/index.php/boletin_ieo/article/viewArticle/179

Rigalli, A. (2016). Enzimas de glucólisis y gluconeogénesis. Un enfoque detallado. Algunos

aspectos puntuales. https://rephip.unr.edu.ar/bitstream/handle/2133/6709/glucidos
%20hexokinasa%20glucokinasa%20glucosa%20fosfatasa.pdf?sequence=3

Bobadilla, K., Hernández-Sánchez, F., González-Hernández, Y., & Torres-Rojas, M. (2010).

Aislamiento de organelos en macrófagos humanos infectados con Mycobacterium
tuberculosis. NCT Neumología y Cirugía de Tórax, 69(3), 151-156.
https://www.medigraphic.com/cgi-bin/new/resumen.cgi?IDARTICULO=28209

Paniagua R, Manuel N, Pilar S, Manuel Álvarez-Uría, Benito F, Ramón A, Francisco J. Sáez.

(2007) Biología celular. 3° edición. Editorial Mc Graw Hill, pp. 16-19.
http://www.untumbes.edu.pe/vcs/biblioteca/document/varioslibros/0592.%20Biolog
%C3%ADa%20celular.%20Paniagua.pdf

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Flores Rojas, E. L. (2016). Comparación de técnicas para el análisis de velocidad de
sedimentación globular en los pacientes del Laboratorio Clínico Profesional en el Período
febrero-junio 2016. http://www.dspace.uce.edu.ec/handle/25000/10100

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