ANÁLISIS

DE
PROTEÍNAS
• Amaya Espinoza Mariana
• Contretras Salcido Regina Andrea
• Dorantes Donjuan Paola Vanessa
• Higuera Flores Daniel Sebastián
• Peralta Villalba Yatzil Guadalupe

Biología Celular
Maestra: Yulia Lipovka
 CONTENIDO
Western blot

Espectometría de masas

Cristalografía de rayos X

Espectroscopía de resonancia magnética nuclear

(RNN)
Proteínas de fusión

Transferencia de energía de resonancia (FRET)

Sistema de doble híbrido (East two-hybrid)

Co-inmuno precipitación

DNA footprinting (Estudio interacción proteína-DNA).

 WESTERN
BLOT
● Permite la detección de una proteína
dentro de una muestra biológica.

● La especificidad se logra mediante el

uso de un anticuerpo que reconoce y se
une a un epítopo único de la proteína de
interés.
 PASOS DEL
0 WESTERN BLOT
Preparación de la 02 03 a
Transferencia
1
muestra Electroforesis membrana
Extracción y desnaturalización Separación de proteínas en base a Traslado de la proteína a un
de la proteína de interés. su tamaño y carga eléctrica. medio más resistente.

04 05 de
Detección
Inmunotinción bandas
Visualización de la proteína Detección de la proteína mediante
diana usando anticuerpos. quimioluminisencia, fluorescencia o colorimetría.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
• Las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o
mecánicos.

• Con la ruptura celular, se liberan enzimas proteasas que pueden

01
degradar la proteína de interés.

• Se añade un tampón que contiene un agente reductor, así como

detergente y el calentamiento para reducir y desnaturalizar la
proteína.
ELECTROF
ORESIS
• Las proteínas cargadas negativamente,
cuando se someten a un campo eléctrico,
migran al electrodo positivo.

• SDS iguala la carga en todas las proteínas

02
• La tasa de migración viene determinada
por su peso molecular. Las moléculas
más pequeñas migran más rápidamente
que aquellas con pesos moleculares
mayores.

• Es importante determinar la
concentración de proteínas para asegurar
cargar la cantidad correcta de proteínas
en el gel.
 ¿CÓMO SE
REALIZA?
Las muestras se cargan en los pocillos del gel mediante una pipeta.

Una vez finalizada la carga, el gel se somete a un campo eléctrico

generado por una fuente de alimentación.

El progreso en el gel se
monitoriza observando
el frente coloreado por
el colorante presente en
03
el tampón de carga y la
posición de los
marcadores de tamaño
siempre que estos estén
teñidos.
 RENCIA
•

•
Es la transferencia de proteínas a otra
superficie (membrana).

La membrana es un soporte sólido que une e

03
inmoviliza las proteínas, permitiendo así la
detección de un anticuerpo.

• Se realiza porque los geles son un sustrato que

pueden romperse fácilmente.

• Es similar a la electroforesis, ya que se

“transfiere” del gel las proteínas cargadas
negativamente hacia un polo positivo dentro de
un campo eléctrico.

• Se debe evitar la entrada de burbujas en el gel

y la membrana, además de tocar la membrana
con las manos descubiertas.
 INMUNOTI
NCIÓN
Se usan anticuerpos específicos para
que solo se visualice la proteína

0
diana.

4
 DETECCIÓN DE
MÉTODOS BANDAS MÉTODOS
DIRECTOS
Utilizan un anticuerpo primario conjugado con
un marcaje detectable, como una enzima,
biotina o molécula fluorescente.
INDIRECTOS
Utilizan dos anticuerpos; un anticuerpo
primario y un anticuerpo secundario conjugado
con un marcaje detectable.

QUIOMIOLUMI
NISCENCIA
FLUORESCENC
IA
COLORIMETRÍ
A
 Espectrometría de
La espectrometría de masas es un método sensible para la identificación de

masas
proteínas no identificadas. También es una técnica muy sensible que requiere
muy poco material y es capaz de determinar la masa precisa de proteínas
intactas y de sus péptidos derivados mediante degradación enzimática o
química
Esta técnica analítica es imprescindible para varias ramas de la industria
química como: petroquímica, farmacéutica, cosmetológica, de alimentos, entre
otras. Entre algunas aplicaciones podemos mencionar el análisis de muestras
de: productos organometálicos, productos naturales, productos de síntesis,
contaminantes ambientales, productos del área bioquímica, polímeros,
biomoléculas pequeñas, etc. Cabe mencionar que con el uso de la
cromatografía de gases acoplada a masas se pueden separar mezclas y
elucidar cada uno de los componentes de ésta.
 Método MALDI-
TOF
Su función es obtener mediciones precisas del peso molecular de proteínas y
péptido, la espectrometría de masas ha irrumpido en el laboratorio de
microbiología ofreciendo una alternativa rápida y fiable para la identificación de
microorganismos. La reciente creación de plataformas simples y fáciles de
utilizar dirigidas al diagnóstico microbiológico ha llevado a su creciente
incorporación a los laboratorios de microbiología.
 Técnica MS/MS
La técnica MS/MS  también conocida como espectrometría de masas en tándem, es útil para la detección y determinación
precisa del mapa de modificaciones postraduccionales de las proteínas, tales como la fosforilación o acetilaciones. Debido a
que las modificaciones comportan un incremento característico de la masa, son fácilmente detectables. La proteómica, un
termino general que aglutina diferentes tecnologías, es la caracterización de todas las proteínas de una célula, incluyendo las
interacciones proteína-proteína y las traducciones postraduccionales. La espectrometría en combinación con otras técnicas de
purificación rápida, es el método más potente .

01
Cristalografía de
rayos x
Técnica experimental para el estudio y análisis de
materiales, basada en el fenómeno de difracción de
los rayos X por sólidos en estado cristalino. Los rayos
X son difractados por los electrones que rodean los
átomos por ser su longitud de onda del mismo orden
de magnitud que el radio atómico.
 Cristalografía de rayos x
El haz de rayos X emergente tras esta interacción contiene información
sobre la posición y tipo de átomos encontrados en su camino. Los
cristales, gracias a su estructura periódica, dispersan elásticamente los
haces de rayos X en ciertas direcciones y los amplifican por interferencia
constructiva, originando un patrón de difracción.

Un físico británico William Bragg en 1913 creó la “Ley de Bragg” que esta
es la que permite estudiar las direcciones en las que la difracción de
rayos X sobre la superficie de un cristal produce interferencias
constructivas, dado que permite predecir los ángulos en los que los rayos
X son difractados por un material con estructura atómica periódica
(materiales cristalinos).
 Otras contribuciones
de la cristalografía de
rayos x
Dada la relación existente entre la estructura tridimensional
de las moléculas y sus propiedades químicas y físicas, la
cristalografía ha contribuido al avance en varias disciplinas
científicas como la química, la biología molecular, la geología,
la física aplicada y la ciencia de materiales.
PROTEÍNAS DE
FUSIÓN

• Son aquellas formadas a partir de la traducción de dos o más genes

previamente independientes que se han unido bien por algún proceso
natural o artificialmente en el laboratorio empleando tecnología de
ADN recombinante.

• Presentan propiedades diferentes a las de las proteínas originales.

EJEMPLOS:
• •Proteína BCR/ACL: Se produce de forma espontánea por la fusión
del gen BCR del cromosoma 22 y el gen ABL del cromosoma 9.
• •Abatacept: Se emplea como medicamento. Está compuesta por una
inmunoglobulina fusionada al antígeno citotóxico de linfocito T
CTLA-4.
Sistema de doble
híbrido (East two-
hybrid
 RESOURCES
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PHOTOS
● Female student sitting with book and smiling
● Teenage student sitting at table in classroom
● Modern microscope in laboratory
● Scientist making test in laboratory

VECTORS
● Abstract science background
● Chemistry test tubes
● Flat chemistry background
● Flat chemistry laboratory with flasks
● Flat chemistry background
● Flat chemistry background II
TRANSFEREN
CIA DE
ENERGÍA DE
RESONANCIA
(FRET)
¿QUÉ ES?

• Es un mecanismo que describe la transferencia de energía entre dos

moléculas sensibles a la luz (cromóforos).

Los cromóforos son los elementos del átomo de una molécula

responsables del color.
 Fluoróforos utilizados
Pares CFP-YFP. para FRET.
Un par común de fluoróforos para uso biológico es un par de proteína fluorescente cian (CFP) -
proteína fluorescente amarilla (YFP).

Ambos son variantes de color de la proteína verde fluorescente (GFP). El etiquetado con tintes
fluorescentes orgánicos requiere purificación, modificación química e inyección intracelular de
una proteína huésped.

Las variantes de GFP se pueden unir a una proteína huésped mediante ingeniería genética, lo
que puede ser más conveniente. Además, una fusión de CFP e YFP ("dímero en tándem") unida
por una secuencia de escisión de proteasa puede usarse como ensayo de escisión.
 Fluoróforos utilizados
BRET.
para FRET.
Una limitación de FRET realizada con donantes de fluoróforos es el requisito de iluminación
externa para iniciar la transferencia de fluorescencia, que puede conducir a ruido de fondo en
los resultados de la excitación directa del aceptor o al fotoblanqueo.

Para evitar este inconveniente, se ha desarrollado la transferencia de energía por resonancia de

bioluminiscencia (o BRET).

Esta técnica utiliza una luciferasa bioluminiscente (típicamente la luciferasa de Renilla

reniformis) en lugar de CFP para producir una emisión de fotones inicial compatible con YFP.
 Fluoróforos utilizados
Homo-FRET. para FRET.
En general, "FRET" se refiere a situaciones en las que las proteínas donantes y aceptoras (o
"fluoróforos") son de dos tipos diferentes.

Sin embargo, en muchas situaciones biológicas, los investigadores pueden necesitar examinar
las interacciones entre dos o más proteínas del mismo tipo, o incluso la misma proteína consigo
misma, por ejemplo, si la proteína se pliega o forma parte de una cadena polimérica de
proteínas o para otras cuestiones de cuantificación en células biológicas.
 APLICACIONES.
FRET se puede utilizar como una regla espectroscópica para medir la distancia y detectar
interacciones moleculares en varios sistemas y tiene aplicaciones en biología y bioquímica.

PROTEÍNAS.

FRET se usa a menudo para detectar y rastrear interacciones entre proteínas. Además, puede
usarse para medir distancias entre dominios en una sola proteína marcando diferentes regiones
de la proteína con fluoróforos y midiendo la emisión para determinar la distancia.

MEMBRANAS.
FRET se puede utilizar para observar la fluidez de la membrana, el movimiento y la dispersión
de las proteínas de la membrana, las interacciones lípido-proteína y proteína-proteína de la
membrana, y la mezcla exitosa de diferentes membranas. También se utiliza para estudiar la
formación y las propiedades de los dominios de membrana y balsas lipídicas en las membranas
celulares y para determinar la densidad de superficie en las membranas.
 APLICACIONES.
QUIMIOSENSO
RIAL.
Las sondas basadas en FRET pueden detectar la presencia de varias moléculas: la estructura de
la sonda se ve afectada por la unión o actividad de moléculas pequeñas, lo que puede activar o
desactivar el sistema FRET. Esto se usa a menudo para detectar aniones, cationes, pequeñas
moléculas sin carga y también algunas biomacromoléculas más grandes.

VÍAS DE
SEÑALIZACIÓ
Otro uso de
N.FRET es el estudio de vías metabólicas o de señalización.
 DNA
FOOTPRINTING
(ESTUDIO DE
INTERACCIÓN
PROTEÍNA-DNA)
¿QUÉ ES?

• Es un método para determinar la especificidad de secuencia de las

proteínas que enlazan con el ADN. La dermatoglifia del ADN utiliza
un agente que daña el ADN (ya sea un reactivo químico o una
nucleasa) que rompe el ADN en cada par de bases. La ruptura del
ADN es inhibida donde el ligando enlaza con el ADN.
 PASOS DEL DNA
Se clona el fragmento
de DNA que contiene el
FOOTPRINTING.
02 03
Se digiere el DNA con una
DNA-asa I (esta enzima corta
01 sitio en el que se une la
las moléculas del DNA de
forma aleatoria, a diferencia de
proteína. las enzimas de restricción que
lo cortan en secuencias
determinadas).

Se separan los fragmentos radioactivos por
electroforesis y se revela el
autoradiograma. Cuando el represor lac se
04 une a su ligando (una secuencia de 24
pares de bases) la DNA-asa I no puede
atacar la secuenca, por lo que los
fragmentos cubiertos por el represor no
apareceran en el autoradiograma.
La misma muestra de DNA sin proteger por el
represor se somete a un proceso normal de
secuenciación, comparándose con el
autoradiograma anterior. La secuencia exacta
05 de bases en el operador lac puede ser leída
directamente ya que está representada por los
fragmentos escalonados de DNA que están
ausentes en el footprint.
 ESPECTROSCOPÍA
DE RESONANCIA
Se utiliza para la estructura deMAGNÉTICA
pequeñas moléculas y actualmente se utiliza cada vez más para
estudiar la estructura de pequeñas proteínas o dominios proteicos.
NUCLEAR
Esta técnica es la que más proporciona detalle sobre la estructura tridimensional de moléculas
en solución.
 ESPECTROSCOPÍA
DE NMR
Algunos núcleos atómicos, particularmente los de hidrógeno tienen un campo
magnético o espín, es decir tiene una magnetización intrínseca, como
una barra magnética. El espín se alinea en el interior de un fuerte campo
magnético.

Hay una NMR que distingue señales procedentes de

núcleos de hidrógeno de diferentes aminoácidos e
identificar y medir los pequeños cambios que
ocurren.

La técnica pierde resolución al incrementar el

tamaño de la macromolécula. Los estudios de NMR
se realizan en solución, el método presenta ventaja
de poder seguir carrubios en la estructura de la
proteína. La NMR también se utiliza con éxito para
estudiar moléculas no proteicas.
 CO-
INMUNO
PRECIPIT
ACIÓN
 Co-Inmuno
●
Precipitación
Es un método para la identificación
de proteínas que se unen
fuertemente. En este método un
anticuerpo reconocer a una
proteína diana específica. El
anticuerpo está asociada a agentes
que están unidos a una matriz
solida y que arrastra al complejo a
la base del tubo de ensayo. Si una
proteína este fuertemente unida a
otra, al momento de ser capturada
por el anticuerpo, la proteína
asociada se precipitará.
¡GRA
CIAS!