2 Illumina Sequencing Overview 15045845 D

Secuenciación de Illumina
Revisión general
Part # 15045845_Rev.C
© 2013 Illumina, Inc. All rights reserved.

Illumina, IlluminaDx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cBot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium,
iSelect, MiSeq, Nextera, NuPCR, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, TruSight, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks
of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.
Objetivos de la sesión
Al finalizar este entrenamiento, usted será capaz de:
– Enlistar la pasos principales en el flujo de trabajo de la secuenciación de Illumina.

– Describir la generación de Clústeres
– Discutir el proceso de Secuenciación por síntesis
2 Part # 15045845_Rev.D For Research Use Only. Not For Use in Diagnostic Procedures
Flujo de trabajo de Illumina para Secuenciación
1
Preparación de
muestras
2
Generación de Clústeres
3
Secuenciación
4
Análisis de datos
1
Preparación de
muestras
2
Generación de Clusters
3
Secuenciación
4
Análisis de datos
La preparación de muestras es un paso crítico para el
éxito de la secuenciación
Biblioteca con dos índices
El objetivo de la preparación de muestras es obtener

fragmentos de ácidos nucleicos con adaptadores
unidos en ambos extremos
1
Preparación de
muestras
2
3
Secuenciación
4
Análisis de datos
¿Qué es una Celda de Flujo?
La generación de Clústeres ocurre

en la celda de flujo
Una celda de flujo es un

portaobjetos de vidrio grueso con
canales o carriles
Cada carril se recubre

aleatoriamente con una capa de
oligos que son complementarios a
los adaptadores de la biblioteca
¿Que es un Clúster?
Los Clústeres son puntos brillantes

en una imagen
Cada clúster representa miles de

copias de la misma cadena de DNA
en un punto de 1–2 micras
Cycle 1, G Channel
Biblioteca Clúster
Individual clonal
de DNA amplificado
Instrumentación
Biblioteca Clúster
Individual clonal
de DNA amplificado
cBot Secuenciador
Hibridación del Fragmento y Extensión
Secuencia
Adaptadora
Bibliotecas individuales
de DNA son hibridadas a
la capa de primers.
Las bibliotecas unidas

son extendidas por la
polimerasa.
Superficie de la
celda de flujo
recubierta con una
capa de pares de
oligos
Extensión
3’
Desnaturalización de la doble cadena de DNA
Cadena
recién
La molécula de doble sintetizada
Molde
cadena es
original
desnaturalizada
Lavado de la cadena descarte

molde original
La cadena recién
sintetizada es unida
covalentemente a la
superficie de la celda de
flujo.
Cadena Sencilla de DNA
NOTA:
Moléculas
individuales se unen
a la celda de flujo en
un patrón aleatorio
Amplificación en Puente
La cadena sencilla gira y forma un

puente por hibridación con el primer
complementario adyacente.
El primer hibridado es
extendido por la
polimerasa
Formación de un puente de doble

cadena
Desnaturalización del Puente de doble cadena
El puente de doble
cadena es
desnaturalizado
Resultado:
Dos copias de cadena sencilla
unidas covalentemente
Las cadenas sencillas giran y

forman un puente por hibridación
con el primer complementario
adyacente.
El primer hibridado es
extendido por la
polimerasa
El ciclo de amplificación en
puente se repite hasta que
múltiples puentes son
formados
Linealización
Los puentes de dsDNA

son desnaturalizados
Escisión de la Cadena Anti sentido
Las cadenas anti sentido son

escindidas y lavadas, dejando
un clúster con las cadenas
sentido únicamente.
Bloqueo
Las terminaciones 3’ libres

son bloqueadas para
prevenir la unión de DNA no
deseado.
Lectura 1 Hibridación del Primer
El primer de secuenciación es
hibridado a la secuencia
Primer de
adaptadora. secuenciación
1
Preparación de
muestras
2
Generación de Clústers
3
Secuenciación
4
Análisis de datos
Secuenciación por Síntesis (SBS)
Añadir 4 Fl- Imagen del FI- Escisión del Terminador &

NTP’s + NTP colorante fluorescente del
Polimerasa incorporado FI-NTP
X 36–251
Química del Terminador Reversible
• 4 nucleótidos en la misma reacción

• Precisión superior
• Sin problemas con las repeticiones de
homopolímeros
Sitio de
Escisión
Siguiente
Ciclo
• Incorporación
• Detección
• Desbloqueo
Bloqueo • Remoción del Terminación 3’ libre
fluoróforo
Clústeres
100 Micras
Secuenciación con Terminaciones Paired
Terminaciones Cadena
3’ Bloqueadas Secuenciada
La cadena secuenciada
es eliminada
Las terminaciones 3’ de
la cadena molde y la
capa de primers son
desbloqueados
La cadena molde “sentido”

se dobla para formar un
puente por hibridación con
uno de los primers en
capa Formación
del Puente
Las terminaciones 3’ de
los primers en capa son
extendidos
Extensión 3’
Cadena
Doble de
DNA
Los puentes son linealizados

y la cadena molde “sentido”
original es escindida
Cadena
“Sentido”
Original
Terminaciones
Las terminaciones 3’ 3’ Bloqueadas
libres de la cadena molde
anti sentido y los primers Primer de
en capa son bloqueados Secuenciación
para prevenir la unión de
DNA no deseado.
El primer de
secuenciación es Cadena molde
hibridado a la secuencia anti sentido
adaptadora.
Secuenciación por Síntesis 2° Lectura
Añadir 4 Fl- Imagen del FI- Escisión del Terminador &

NTP’s + NTP colorante fluorescente del
Polimerasa incorporado FI-NTP
X 36–251
Secuenciación de Terminaciones Paired en
Bibliotecas con Lectura de un solo Índice
Secuencias Multiplexed
con un índice utilizan
sequencing 3 Lecturas
Utilizes deReads
3 Sequencing Secuenciación
3
1
Read 1 Seq Primer

(HP6) Terminaciones Read 2 Seq Primer
Paired giran (HP7)
Index Seq Primer

(HP8)
Secuenciación de Terminaciones Paired en
Bibliotecas con Lectura de dos Índices
Secuenciación de Terminaciones Paired en Bibliotecas
con Lectura de dos Índices
1 2 3 4
Terminaciones
Paired giran
Secuencias con dos índices, utilizan 4 Lecturas de Secuenciación
1
Preparación de
muestras
2
3
Secuenciación
4
Análisis de datos
Revisión General del Análisis de Datos
Software de Software de Software de

Control Análisis Visualización
Revisión General del Análisis de Datos
Tipo de Análisis Software Salida/Outputs
Software de
Control
Imágenes, Intensidades y
ICS/MCS/RTA Llamado de Bases
CASAVA
HiSeq Analysis
Software de Software
Análisis MiSeq Reporter Alineación, Detección de
Variantes
Software de
Visualización
Anotación, Filtración, Reportes
Resumen
1
Preparación de
muestras
2
3
Secuenciación
4
Análisis de datos
Preguntas?

2 Illumina Sequencing Overview 15045845 D

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

2 Illumina Sequencing Overview 15045845 D

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Secuenciación de Illumina

© 2013 Illumina, Inc. All rights reserved.

Al finalizar este entrenamiento, usted será capaz de:

– Enlistar la pasos principales en el flujo de trabajo de la secuenciación de Illumina.

Biblioteca con dos índices

El objetivo de la preparación de muestras es obtener

La generación de Clústeres ocurre

Una celda de flujo es un

Cada carril se recubre

Los Clústeres son puntos brillantes

Cada clúster representa miles de

Las bibliotecas unidas

Lavado de la cadena descarte

La cadena sencilla gira y forma un

Formación de un puente de doble

Las cadenas sencillas giran y

Los puentes de dsDNA

Las cadenas anti sentido son

Las terminaciones 3’ libres

Añadir 4 Fl- Imagen del FI- Escisión del Terminador &

• 4 nucleótidos en la misma reacción

La cadena molde “sentido”

Los puentes son linealizados

Añadir 4 Fl- Imagen del FI- Escisión del Terminador &

Read 1 Seq Primer

Index Seq Primer

Secuencias con dos índices, utilizan 4 Lecturas de Secuenciación

Software de Software de Software de

Tipo de Análisis Software Salida/Outputs

También podría gustarte