DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA HUMANA

CÁTEDRA 1 - MATERIA QUÍMICA BIOLÓGICA II - CICLO LECTIVO 2020

SEMINARIO 17

Biología Molecular:
Herramientas, técnicas y
aplicaciones en medicina

Objetivos de aprendizaje

• Conocer y familiarizarse con los principios básicos de la biología molecular.

• Describir los fundamentos de las técnicas de rutina de biología molecular.
• Comprender su aplicación en el diagnóstico clínico.
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BIOLOGÍA MOLECULAR: Herramientas, técnicas y aplicaciones en medicina

La biología molecular, entendida como el área de estudio de las moléculas de ácido

desoxirribonucleico (ADN) y de ácido ribonucleico (ARN), es un campo que vincula diferentes
aproximaciones en el funcionamiento de cualquier organismo vivo. Los procesos patogénicos en
el ser humano son la más clara evidencia del rol central del ADN y ARN en enfermedades de base
genética como las producidas por deficiencias enzimáticas descriptas en las clases anteriores (por
ejemplo, deficiencia de glucosa-6-P-deshidrogenasa, glucosa-6-fosfatasa, piruvato quinasa,
carnitina-palmitoil transferasa, acil-CoA deshidrogenasas, etc.) y otras enfermedades no
mencionadas en este curso como la fibrosis quística, la hemofilia, la enfermedad de Huntington y
algunos tipos de cáncer de origen genético. También es posible encontrar una participación
limitada en trastornos multifactoriales como la diabetes, la enfermedad cardíaca, la obesidad,
entre otras.
En este seminario se resumen algunas de las principales herramientas y técnicas de
biología molecular y su aplicación en la medicina, describiendo los conceptos básicos más
importantes para el área de la salud, que faciliten la comprensión del uso de las herramientas de
la biología molecular en la práctica médica cotidiana y la utilidad clínica de las pruebas de
laboratorio moleculares en la prevención, el diagnóstico y el tratamiento de diversas
enfermedades.

-Transcripción reversa

La cuantificación e identificación de los ARN mensajeros presentes en ciertas células o

tejidos es una forma indirecta de determinar las proteínas expresadas en los mismos. Para esto,
se purifica el ARN del sistema en estudio y se utiliza una enzima que sólo se encuentra en ciertos
virus: la transcriptasa reversa. Para esta reacción se necesitan moléculas de ARN que son el
molde, la enzima transcriptasa reversa, un cebador o primer (oligonucleótidos de ADN
complementarios a una parte de la secuencia de las moléculas de ARN), y desoxirribonucleótidos
(dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Utilizando los ARN mensajeros como molde, la enzima produce una
copia de ADN (ADNc) a partir del ARN. El ADN producido por la transcriptasa reversa, debido a
que usa ARNm maduro como templado, no contiene intrones (Figura 1).

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Figura 1: Transcripción reversa

El ARN mensajero purificado de la muestra es utilizado para la síntesis de la primera cadena de ADN copia mediante
Transcripción Reversa. En este proceso es necesario el ARN purificado (molde), la enzima Transcriptasa Reversa,
cebadores de DNA (primers), desoxirribonucleótidos (dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP) y buffers. El cebador se u n e a
la cadena de RNA, y mediante la actividad de la Transcriptasa Reversa se extiende una cadena ADN copia, resu l ta n d o
una molécula híbrida. Finalmente se obtiene el ADN copia que no contiene intrones.

- Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR)

En 1984, Kary Mullis ideó un ingenioso método para amplificar secuencias específicas de
ADN que se denomina Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Mediante esta técnica se
puede amplificar un segmento específico de ADN hasta millones de veces en pocas horas in vitro,
si se conocen las secuencias colindantes (flanqueantes) a esta secuencia blanco.
La PCR se lleva a cabo mezclando en un tubo
a) muestra conteniendo el ADN de interés,
b) oligonucleótidos (de entre 20 y 30 nucleótidos) que actuarán como cebadores (o
primers) uniéndose específicamente a la secuencias flanqueantes de la secuencia blanco,
c) los cuatro desoxirribonucleótidos (dNTPs),
d) un buffer de pH 7,4
e) ADN polimerasa termoestable al calor.
Se realizan replicaciones sucesivas repitiendo tres pasos en cada ciclo, utilizando un
equipo programable denominado termociclador. El termociclador es un aparato con capacidad
para calentar y enfriar rápidamente las mezclas de reacción, de modo que se aprovechen las
cualidades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de la ADN polimerasa.

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Cada ciclo es la repetición de los siguientes 3 pasos:
1) Desnaturalización de la doble hélice de ADN: las dos hebras de la molécula de ADN
original se separan mediante calentamiento de la solución a 95ºC durante 15 segundos.
2) Hibridación de los cebadores: La solución se enfría rápidamente a una temperatura
entre 50º y 60ºC que es generalmente la temperatura a la cual cada cebador se une con una
hebra de ADN desapareada. Un cebador hibrida con el extremo 3’ de la secuencia blanco en una
hebra y el otro cebador hibrida con el extremo 3’ de la secuencia en la hebra complementaria. No
se formará nuevamente el ADN doble hebra inicial porque los cebadores están presentes en
exceso.
3) Síntesis de ADN: Se utiliza una enzima termoestable (Taq polimerasa) proveniente
de una bacteria termófila (Thermus aquaticus) que tiene temperatura óptima de acción alrededor
de 70ºC y es resistente a temperaturas extremas. La Taq polimerasa cataliza la elongación de
ambos cebadores copiando la secuencia blanco.
Estos tres pasos constituyen un ciclo de PCR, que se repite consecutivamente varias
veces. Cada ciclo de PCR duplica la cantidad de ADN, por lo que finalmente se produce un
aumento de 2n de la cantidad de ADN original, siendo n el número de ciclos que se llevan a cabo.
La amplificación es de un millón de veces después de 20 ciclos y de mil millones de veces
después de 30 ciclos, los cuales se pueden llevar a cabo en menos de una hora (Figura 2).
Los productos de PCR obtenidos al final de la reacción son analizados mediante una
electroforesis en gel. El ADN que ha sido amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa,
migra en una región del gel de acuerdo a la cantidad de pares de bases (tamaño) que tiene la
secuencia, y es acumulada en una banda que se ubica en paralelo a una de las bandas de
tamaño determinado de un patrón comercial que contiene ADN de diferentes longitudes y que es
corrido de forma simultánea con la muestra; esto, permite determinar el tamaño de la secuencia
estudiada en pares de bases.
Se denomina RT-PCR, a la técnica que consiste en primero realizar transcripción reversa
utilizando una muestra de ARN y luego utilizar el ADN obtenido de esta reacción como templado
de una reacción de PCR. Este procedimiento es utilizado ampliamente en el diagnóstico clínico
por ejemplo para detectar y cuantificar virus con genoma de ARN en una muestra humana.
La PCR en tiempo real (del inglés real time PCR) es una modalidad de PCR donde la
acumulación de ADN amplificado es detectado y cuantificado a medida que la reacción avanza, es
decir, “en tiempo real”. Esto se logra incorporando una molécula fluorescente que se asocia al
ADN amplificado. Así, el incremento de esta fluorescencia es proporcional al incremento de la
cantidad de moléculas de ADN amplificadas en la reacción.

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Figura 2: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

A: Esquema de los pasos de la reacción de la PCR. B: Cada ciclo de PCR duplica la cantidad de ADN, por lo que
finalmente se produce un aumento de 2 n de la cantidad de ADN original

Aplicaciones: La PCR permite amplificar una secuencia de ADN presente en una

proporción muy pequeña del ADN total de una muestra. Es una técnica sumamente sensible, se
puede amplificar y detectar una única molécula de ADN, aportando una información muy valiosa
en medicina. Además, la PCR es una herramienta esencial para la toma de decisiones en todas
las etapas de la atención del paciente: la evaluación del riesgo, la detección, el diagnóstico, la
estadificación y el pronóstico, la selección de la terapia, y el seguimiento en diferentes
enfermedades. A continuación se describen algunos ejemplos:
• Detección de bacterias y virus: mediante PCR se puede detectar la presencia de bacterias
y virus en estadios tempranos de la infección o en estado latente. En estos casos, los
individuos infectados no han desarrollado todavía respuesta inmune a dichos patógenos,
por lo cual no puede detectarse la infección determinando la presencia de los anticuerpos.
Entonces, se recurre a la detección del agente patógeno empleando primers o cebadores
complementarios a una parte del genoma del agente infeccioso. Aún unas pocas copias
originales de una bacteria o virus en la muestra del paciente pueden detectarse luego de la
amplificación. Se aplica, por ejemplo, en la detección del virus Sars-Cov-2 (utilizando la
RT-PCR en tiempo real), en la detección de los virus de la hepatitis B (HBV) y C (HCV) y el

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de inmunodeficiencia humano (HIV). La búsqueda de microorganismos en muestras de
tejido puede ser muy lenta y laboriosa, pero con la PCR se puede detectar la presencia de
solo 10 de estos microorganismos por cada millón de células humanas.
• Seguimiento de enfermedades: los métodos moleculares cuantitativos se han convertido
en una ayuda imprescindible para el seguimiento en respuesta a la terapia, especialmente
en pacientes infectados con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la
hepatitis B y el virus de la hepatitis C.
• Colaboración con la medicina forense en variados aspectos, por ejemplo la identificación
de personas permitiendo el reconocimiento de cadáveres o parentescos biológicos en
casos de disputa de paternidad.
• Establecimiento de grupos tisulares precisos en transplantes, amplificando y comparando
secuencias de los HLA del donante y receptor para determinar compatibilidades.
• Estudio de relaciones evolutivas entre los organismos, ya que bajo ciertas circunstancias el
ADN puede mantenerse intacto durante miles de años o incluso más tiempo.

Nota: En el siguiente link se puede ver una animación sobre la técnica de PCR:
https://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html

- Secuenciación de ADN

La secuenciación de ADN consiste en la determinación del orden de los nucleótidos (A, C,

G y T) en una molécula de ADN, lo cual resulta útil en la investigación básica de los procesos
biológicos fundamentales, así como en campos aplicados, como el diagnóstico de enfermedades
hereditarias y la investigación forense.
La secuencia provee la clase de información genética que se transporta en un segmento
específico de ADN. Por ejemplo, se puede usar la información de las secuencias para determinar
qué tramos de ADN contienen genes y qué tramos transportan instrucciones regulatorias, que
activan o desactivan genes. Además, y de manera muy importante, los datos de las secuencias
pueden resaltar los cambios en un gen que pueden causar enfermedades. El desarrollo de la
secuenciación del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en
biología.
La mayoría de los métodos de secuenciación que se utilizan actualmente se basan en el
método originalm ente desarrollado por Sanger en el año 1977. El principio clave del método
clásico de terminación de la cadena o método de Sanger es el uso de didesoxinucleótidos
trifosfato (ddNTPs) como terminadores de la cadena de ADN. Estos ddNTPs terminan la
elongación de la cadena al carecer del grupo 3'-OH del azúcar que se necesita para la formación
del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos durante la elongación de la cadena de ADN. En
estas condiciones de elongación, se generan moléculas de ADN simple cadena que difieren en
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longitud en apenas un nucleótido y que pueden separarse unas de otras por electroforesis en gel
de poliacrilamida.
Este método requiere una hebra molde de ADN simple cadena, un cebador o primer de
ADN, una ADN polimerasa, dNTPs y los ddNTPs que terminan la elongación de la cadena de
ADN. La cantidad de ddNTPs que se agrega es una proporción mucho menor que la de los
dNTPs. Una modificación del método original de Sanger es utilizar ddNTPs terminadores de la
cadena marcados fluorescentemente. Este método es conocido como secuenciación por
terminador fluorescente y utiliza cada uno de los cuatro ddNTPs que terminan la cadena
marcado con un fluoróforo de diferente color.
La reacción de secuenciación se realiza con la muestra de ADN a secuenciar la ADN
polimerasa, los cuatro desoxinucleótidos estándar (dATP, dGTP, dCTP Y dTTP), y los cuatro
ddNTPs cada uno marcado con un fluoróforo de distinto color. La ADN polimerasa comienza a
generar los fragmentos de ADN complementarios a la secuencia de ADN molde. La incorporación
de un didesoxinucleótido en la cadena naciente de ADN termina su extensión, lo que produce
varios fragmentos de ADN de longitud variable según la secuencia de la molécula de ADN molde.
Los fragmentos de ADN sintetizados, conteniendo la marca fluorescente según el ddNTP
incorporado, son desnaturalizados por calor y separados por tamaño (con una resolución de un
solo nucleótido) mediante electroforesis. Esta técnica se desarrolla en equipos automatizados
que realizan una separación electroforética capilar y detectan la fluorescencia para determinar la
secuencia: un sensor detecta el color emitido por cada banda a medida que la electroforesis
avanza por lectores láser y envía los datos a un programa informático que ensambla la secuencia
(Figura 3). Esta automatización de la lectura hace al método atractivo por su gran capacidad y
rapidez.
Posteriormente, se desarrollaron los denominados métodos de “Next-generation
sequencing” (NGS) o de alto rendimiento. Estos hicieron la secuenciación genómica más rápida y
de menor costo, permitiendo una aplicación más extensiva de la técnica.

Nota: En los siguientes links se puede ver cómo se realiza el método de secuenciación
automática:
https://www.dnalc.org/resources/animations/cycseq.html

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Figura 3: Secuenciación de ADN

Esquema como se realiza la secuenciación de ADN por terminador fluorescente. Cada banda en la electroforesis y p i co
de color en el registro de la computadora representa un nucleótido en la secuencia de ADN.

-Enzimas de restricción

Las enzimas o endonucleasas de restricción son enzimas de origen procariota que

reconocen secuencias de bases específicas en el ADN doble hélice (4-8 pares de bases) e
hidrolizan las uniones fosfodiéster en cada hebra de la región reconocida. Por lo general, los
sitios de corte son secuencias palindrómicas (repetición invertida) y los puntos de corte están
dispuestos simétricamente. La reacción catalizada por estas enzimas puede ocurrir en el centro
mismo de la secuencia reconocida dejando lo que se conoce como extremos “romos” con ADN
doble cadena, o extremos “cohesivos” si el corte ocurre en posiciones diferentes en una hebra y
en la otra del ADN, dejando en este caso una porción de hebra simple cadena (Figura 4).
Las bacterias utilizan la actividad endonucleasa de estas enzimas para eliminar ADN
foráneo que pudiera ingresar a la célula, sin embargo, el ADN propio no se destruye porque los
sitios reconocidos por estas enzimas se encuentran metilados. Se han purificado y caracterizado
más de 100 enzimas de restricción, denominadas con una abreviatura de tres letras que se refiere
al organismo hospedador, por ej. Eco de Escherichia coli o Hin de Haemophilus influenzae.

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Figura 4: Enzimas de restricción.

Los puntos de corte están indicados por las flechas. El corte con BamHI (izquierda) produce extremos simple ca d e n a o
“cohesivos” y el corte con AluI (derecha) produce extremos doble cadena o “romos”. En cada hebra, la enzima hidro l i za
el enlace fosfodiéster en el lado 3’ del eje de simetría.

Aplicación: las enzimas de restricción se utilizan in vitro para “cortar” moléculas de ADN y
proporcionar pequeños fragmentos específicos que se pueden analizar y manipular con más
facilidad que la molécula original. Luego del tratamiento del ADN, la cantidad y la longitud de los
fragmentos obtenidos dependerán de la frecuencia de la secuencia específica para dicha enzima
(si esta secuencia se encuentra varias veces repetida en el ADN, la enzima cortará más veces
generando fragmentos de distintos tamaños).
Nota: En el siguiente link se puede ver una animación sobre la forma de acción de una
enzima de restricción https://www.dnalc.org/resources/animations/restriction.html

-Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es una técnica que utiliza un campo eléctrico para separar
moléculas por su tamaño y carga. Debido a que el ADN y el ARN contienen grupos fosfatos
cargados negativamente, estas moléculas migrarán hacia el electrodo positivo (ánodo). Las
moléculas más cortas se movilizarán con mayor rapidez por los poros de un gel que las moléculas
más largas, por lo tanto la separación se basará en el tamaño (longitud de los fragmentos). Para
visualizar el ácido nucleico separado se utilizan agentes luminiscentes o colorantes como el
bromuro de etidio, que se intercala en el ADN de doble cadena y generar una señal lumínica que
es directamente proporcional a la cantidad de ácido nucleico presente (Figura 5).
Nota:
En el siguiente link se puede ver una animación sobre cómo se realiza una electroforesis
en gel de agarosa: https://www.dnalc.org/resources/animations/gelelectrophoresis.html

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Figura 5: Electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio de los fragmentos
separados

APLICACIONES DE TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN MEDICINA

-Detección de polimorfismos

Un polimorfismo es una variación en la secuencia de un lugar determinado del ADN en los

cromosomas (locus) entre los individuos de una población. Aquellos polimorfismos que afectan a
la secuencia codificante o reguladora y que producen cambios importantes en la estructura de la
proteína o en el mecanismo de regulación de la expresión, pueden traducirse en diferentes
fenotipos. (Ej: color de los ojos, Rh, histocompatibilidad). Existe otro tipo de polimorfismos, en
regiones codificantes o regiones regulatorias del ADN, estrechamente relacionadas a genes y
pueden estar involucrados en la etiología (causa) de enfermedades heredables. Estas variaciones
en el genoma sirven como base para el uso de técnicas de biología molecular en el diagnóstico de
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enfermedades. En la actualidad la secuenciación es el método utilizado para analizar regiones del
ADN, zonas de genes, regiones no codificantes, etc.

Polimorfismos de regiones altamente variables, causados por repetición de secuencias de

ADN

El ADN humano contiene algunas secuencias que están repetidas en tándem (una al lado
de la otra) un número variable de veces en ciertos loci dispersos en el genoma. Esas regiones se
llaman regiones hipervariables, y son polimórficas ya que la secuencia varía en el número de
copias de la unidad que se repite. Existen dos clases de secuencias repetitivas de ADN: los
minisatélites (variable number of tandem repeats, VNTRs) y los microsatélites (short tandem
repeats, STRs).
Los VNTRs en humanos son secuencias de 1-5 kb que consisten en un número variable
de unidades repetitivas de 15 a más de 100 pb de longitud en el genoma de diferentes individuos .
Se comparan los patrones generados por muestras de ADN de distinto origen (conocido y
desconocido). La coincidencia entre los patrones indica con alta probabilidad que las muestras
provienen de la misma fuente. El análisis de los VNTR es aplicable cuando se pueden obtener
muestras de ADN en buenas condiciones y en cantidad abundante.
Los STRs son secuencias repetidas en tándem de entre 2 y 5 nucleótidos, característica
que los diferencia de los VNTRs. El tamaño total de un STR es más pequeño que el de los VNTR.
La secuencia de las regiones flanqueantes a ambos lados del STR es igual en todos los sujetos y
contienen repeticiones más cortas (Figura 6). Literalmente, cientos de sistemas de STRs han sido
mapeados en todo el genoma humano, varios fueron investigados para su aplicación en tests de
identificación de humanos. Pueden ser detectados mediante la amplificación por PCR de los
segmentos del genoma que contienen diferente número de repeticiones, utilizando para ello
cebadores o "primers" que flanqueen los STRs. Luego de la amplificación del ADN, los
fragmentos se visualizan mediante electroforesis y tinción con Bromuro de etidio o técnicas
análogas. Esta opción se ha vuelto más frecuente con el aumento de información de secuencias
en bases de datos que permiten el diseño de cebadores flanqueantes de STRs. Se analizan
principalmente repeticiones de 4 pb. Dada la enorme variedad de alelos presentes en una
población, al examinar múltiples STRs loci, se puede obtener un alto grado de discriminación entre
individuos.

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Figura 6: Esquema de microsatélites o short tándem repeats (STR)

Se muestran las secuencias de cuatro nucleótidos (CAGG, en este ejemplo) repetida en diferentes cromosomas un
número diferente de veces (STR), siendo para el par de cromosomas rojos 7 y 4 veces, para los amar illos 5 veces ca d a
uno, para el par de cromosomas verdes 6 y 4 veces y para el par de color celeste, 10 y 5 veces. En azul claro te n e m o s
representadas las secuencias flanqueantes de las STR (GGCCAT). https://forensemolecular.es.tl/strs.htm

Huella genética:
La huella dactilar genética, o huella genética, es un método de aislamiento e identificación
de elementos variables dentro de la secuencia de ADN. La técnica fue desarrollada en 1984 por el
genetista británico Alec Jeffreys, después de descubrir la existencia de los minisatélites. Jeffreys
reconoció que cada individuo tiene un patrón único de minisatélites (las únicas excepciones
son los individuos procedentes del mismo cigoto, como los gemelos idénticos). Ya que la huella
dactilar genética de cada persona es única, es un gran método para identificar a alguien de
forma inequívoca. En la actualidad, la huella genética se realiza mediante el análisis de STRs.
Inicialmente, la huella genética fue utilizada para resolución de delitos y para
determinación de maternidad y paternidad. Luego se utilizó para la identificación de restos
humanos, compatibilidad en la donación de órganos, el estudio de las poblaciones de animales
silvestres, y el establecimiento del origen o la composición de alimentos. Por este método pueden
determinarse relaciones familiares: individuos que están estrechamente relacionados
genéticamente tendrán patrones de STRs más similares entre sí que comparados con personas
no relacionadas.
La técnica también se aplica para aportar evidencia a favor o en contra de sospechosos en
casos policiales. La extrema sensibilidad del método permite aislar pequeñas trazas de ADN
humano como evidencia para obtener la huella dactilar de ADN de la persona que la dejó en el
lugar. En estos casos, se comparan las huellas dactilares genéticas de muestras biológicas
obtenidas como evidencia (sangre, semen, tejidos como células del folículo piloso en el extremo
de un único pelo, aún en pequeñas cantidades) con las muestras provenientes de sospechosos.
Las huellas dactilares de ADN resultaron un importante avance en medicina forense.

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En Argentina, en el año 1987, fue creado el Banco Nacional de Datos Genéticos (BNDG),
el cual es un archivo sistemático de material genético y muestras biológicas de familiares de
personas que han sido secuestradas y desaparecidas durante la dictadura militar argentina. En
estos casos se utiliza el material genético de una abuela o abuelo por ejemplo, y de una nieta o
nieto y se analizan los STR localizados en el cromosoma Y (línea paterna) y en las mitocondrias
(línea materna).

-Diagnóstico de enfermedades hereditarias aplicando técnicas de secuenciación

La medicina de precisión es un nuevo concepto que hace referencia a la adaptación del

tratamiento médico a las características individuales de cada paciente. Implica que las decisiones
referentes al tratamiento o la prevención de enfermedades se tomarán sobre la base de la
integración de las características genómicas y moleculares, la información sobre la situación
clínica y los hábitos del paciente.
Por ejemplo, BRCA1 y BRCA2 son genes humanos que producen proteínas supresoras de
tumores. Cuando uno de estos genes está mutado o alterado de forma que la proteína que origina
no se produce o no funciona correctamente, los daños y errores en la transcripción y replicación
del ADN no pueden ser reparados adecuadamente; como resultado, las células están propensas a
desarrollar alteraciones genéticas adicionales que pueden conducir al cáncer. Mutaciones
heredadas específicas en los genes BRCA1 y BRCA2 aumentan el riesgo de cáncer de mama
femenino y de ovario, y se han asociado con un mayor riesgo de varios tipos adicionales de
cáncer por lo que su detección temprana permite evaluar el riesgo de un paciente de presentar la
enfermedad.
Otro ejemplo es el de la poliposis adenomatosa familiar (PAF), enfermedad autosómica
dominante que se caracteriza clásicamente por el desarrollo de cientos a miles de adenomas en el
colon y el recto durante la segunda década de la vida. La PAF tiene una incidencia de 1/8300
nacimientos, y se manifiesta por igual entre ambos sexos. Casi todos los pacientes desarrollan
cáncer colorrectal si no se identifican y son tratados en una etapa temprana. La enfermedad es
causada por mutaciones en el gen APC, un gen supresor tumoral localizado en el cromosoma
5q21.
Hoy en día, es posible analizar las mutaciones en el gen APC. El método más utilizado
actualmente es la secuenciación directa del gen. La información genética no es solo relevante
para el paciente afectado, sino también para la familia inmediata y sus futuros descendientes.
Cuando se identifica una mutación específica causante de la enfermedad, se debe realizar la
prueba genética a todos los parientes de primer grado. Miembros de la familia con un resultado
negativo para la mutación detectada en el paciente no necesitan más investigación y su
seguimiento es el mismo de la población en general. El diagnóstico precoz a través del análisis de
la secuencia del gen logró extender y mejorar la calidad de vida de estos pacientes. También es
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relevante el conocimiento de qué tipo de mutación presentan los pacientes ya que ayuda a
predecir la severidad de la enfermedad, dado que la ubicación de la mutación puede afectar la
función de la proteína de diferente manera.
Secuenciación de nueva generación: La secuenciación de nueva generación (NGS) ha
sido recientemente adaptada para su uso como herramienta de diagnóstico molecular, como por
ejemplo para la caracterización de patógenos, detección de polimorfismos genéticos, diagnóstico
de cáncer, estudio de microbiota, etc. De forma general, las diferentes plataformas de NGS tiene
la capacidad de secuenciar una gran cantidad de material genético en horas a diferencia de los
métodos de secuenciación tradicionales (Sanger) en los que se requerían días a semanas. Las
enfermedades infecciosas y el cáncer son las áreas donde se ha iniciado la implementación de
estas herramientas, principalmente en el estudio de brotes infecciosos y en el diagnóstico de
neoplasias, respectivamente. La NGS entrega una gran cantidad de información, la que debe ser
cuidadosamente analizada por bioinformáticos en conjunto con el equipo médico para enfocar la
búsqueda de lo que se quiere diagnosticar.

-Consejo genético

El consejo genético es el proceso de comunicación en el que se tratan cuestiones

médicas, genéticas y sociológicas asociadas al riesgo de aparición de una enfermedad
hereditaria, es decir, una enfermedad que está escrita en los genes de una familia. Con la
verificación de la presencia de genes defectuosos en un individuo, particularmente en familias que
se conoce que lo portan, los consejeros genéticos informan a los pacientes o familiares del riesgo
de padecer una enfermedad hereditaria, de la posibilidad de trasmitirlo a las siguientes
generaciones, de las medidas preventivas o terapéuticas que se pueden realizar y de la
posibilidad de realizar un test genético para su detección. El conocimiento del mapa del genoma
humano y los desarrollos tecnológicos hacen posible detectar alteraciones cromosómicas,
enfermedades con transmisión mendeliana, defectos metabólicos, marcadores de múltiples
enfermedades.

-Microarrays

En los últimos años se desarrolló una técnica que permite la detección de muchos genes al
mismo tiempo con el fin de determinar qué alelos de estos genes están presentes en las muestras
obtenidas de pacientes: los microarrays (también conocidos como biochips). La superficie de un
biochip pequeño se cubre con miles de piezas de DNA de una sola hebra, en donde cada una
corresponde a un gen diferente o un segmento del mismo. Luego, el biochip se incuba con una
muestra del DNA de un paciente y se determina el patrón de hibridación mediante análisis
informático. Los resultados pueden determinar, por ejemplo, cuál de las múltiples mutaciones
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conocidas para una enfermedad genética es la que porta el paciente o para determinar qué alelos
de las enzimas que metabolizan un fármaco están presentes y, por lo tanto, la probabilidad de que
un paciente tenga una reacción adversa a un fármaco en particular. Otro uso consiste en
determinar qué genes están expresados en una determinada muestra. El ARN mensajero de una
muestra de tejido se utiliza para producir el ADN copia mediante transcripción reversa, el ADNc
hibridará solamente con aquellos genes que están expresados en el tejido analizado. Por ejemplo,
en un paciente con cáncer esta técnica podrá utilizarse para determinar la clasificación del cáncer
con mucha rapidez y diseñar el tratamiento de forma específica para cada paciente.

Nota: En el siguiente link se puede ver una animación sobre los microarrays:
https://www.dnalc.org/resources/animations/dnaarray.html

-Producción de Proteínas Terapéuticas

La ingeniería genética es la utilización de la tecnología del ADN recombinante para alterar

la composición genética de un organismo. El ADN recombinante es una molécula de ADN artificial
formada in vitro por la unión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos distintos que
normalmente no se encuentran juntos. La producción de una proteína no presente en un
organismo determinado y producidas a partir de ADN recombinante, se llaman proteínas
recombinantes.
Una contribución muy importante de la ingeniería genética a la medicina es haber
desarrollado la habilidad de producir cualquier proteína en cantidades casi ilimitadas, siempre que
se conozca el gen que codifica dicha proteína. Con el desarrollo de métodos que permiten la
transferencia de genes específicos de una célula a otra, y la inducción de la expresión de los
mismos en el nuevo hospedador, la industria farmacéutica ha adquirido una gran potencialidad.
Algunas compañías farmacéuticas producen polipéptidos humanos por bacterias o levaduras.
En el año 1978, gracias al desarrollo de la ingeniería genética, se consiguió la síntesis de
la insulina. El procedimiento se realizó utilizando bacterias Escherichia coli como “fábricas” para
producir de forma separada las cadenas A y B de la insulina humana, introduciendo para ello los
genes que las codifican en las bacterias mediante un vector. Los vectores (por ejemplo un
plásmido bacteriano) son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN
que llevan insertados mediante técnicas de ADN recombinante. Posteriormente se llevaba a cabo
la purificación, plegamiento y unión in vitro de las cadenas (mediante la oxidación de las cisteínas
para formar los puentes disulfuro de la proteína activa). El resultado fue una insulina humana, más
barata de producir, potente y segura, ya que no mostraba los problemas que producían las
homólogas animales. Empezó a distribuirse a principios de los años 80 como tratamiento contra la
diabetes, siendo (una vez más) la primera proteína recombinante aprobada como medicamento
(Figura 7). De manera similar, en 1985 se logró desarrollar la hormona de crecimiento
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recombinante, empleada para tratar niños con deficiencias de esta hormona (anteriormente era
aislada de tejido de hipófisis de cadáver, cuyo suministro resultaba escaso).
Además, la técnica de ADN recombinante ha permitido la obtención de proteínas
antigénicas de agentes infecciosos para la creación de vacunas. Las vacunas recombinantes
contienen antígenos virales (proteínas). Como carecen de material genético y no pueden
replicarse, su utilización es totalmente segura, sin riesgo de infección por su uso. La primera
vacuna obtenida con esta técnica fue la vacuna contra Hepatitis B en 1986. Hoy en día se
encuentran varias vacunas en desarrollo contra el SARS-Cov-2 utilizando esta técnica.
Además de la insulina y la hormona del crecimiento, se han producido por esta técnica
glucagon, interferón, factores de la coagulación, factor VIII, interleuquinas, anticuerpos
monoclonales, eritropoyetina, etc.

Figura 7: Producción de insulina humana

-Animales transgénicos

La ingeniería genética permite modificar genéticamente animales y vegetales, con

diferentes aplicaciones, que van desde el mejoramiento de las razas domésticas hasta el empleo
de los animales como fábricas de fármacos. La modificación genética se realiza de dos maneras:
1) anulando o alterando ciertos genes presentes en un animal de manera que esta modificación se
transmita a la descendencia (transferencia génica por inyección directa de ADN extraño en un
cigoto obtenido por fecundación in vitro) o 2) transfiriendo genes a un animal desde la misma
especie o de una especie diferente.

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Los ratones transgénicos constituyeron una herramienta fundamental en el laboratorio para
el estudio de la fisiología animal y sirvieron de modelos experimentales para entender las
bases de muchas enfermedades que afectan al hombre (Figura 8). Luego se desarrolló la
tecnología para hacer los ratones “knockout”, es decir, ratones en los que se anulaba la actividad
de un gen para analizar luego los efectos producidos por esta falta. Esta técnica hoy es muy
importante en el estudio de la función de los genes, tanto en ratones como en otros
organismos.

Figura 8: Aproximadamente hace 20 años se creó el primer animal transgénico en un ratón, al cual se le incorporó a su
genoma la hormona de crecimiento por lo que el ratón creció más de lo normal

Los ratones transgénicos se obtienen por inyección directa del ADN en el pronúcleo del
ovocito fecundado, o bien por transformación de células embrionarias in vitro con el ADN de
interés. En la actualidad, es posible obtener otros animales transgénicos, además de roedores.
Los animales más grandes, como ovejas, cabras, cerdos y vacas pueden modificarse
genéticamente gracias al desarrollo de las técnicas de clonación. Esta aplicación se da
especialmente en especies de interés comercial o agrícola-ganadero (vacas, cerdos, ovejas,
caballos). En el área médica, los animales transgénicos son utilizados en la producción de
proteínas recombinantes (granjas farmacéuticas). En estas granjas farmacéuticas se crían ovejas,
cabras, vacas o cerdos transgénicos que producen en su leche proteínas terapéuticas humanas.
Ejemplos: obtención de eritropoyetina, α1-antitripsina, proteína C, factor VIII de coagulación,
antitrombina III, etc.

-Xenoinjertos

En la medicina personalizada de precisión para el cáncer, se busca utilizar información

específica del tumor de una persona con el fin de facilitar el diagnóstico, planificar el tratamiento o
dar un pronóstico. Los xenoinjertos (en inglés, xenograft) son trasplantes de un órgano, un tejido o
células a un individuo de otra especie, con el fin de probar la eficacia de medicamentos y otros
tipos de tratamientos antes de administrarlos al paciente.
En el caso del estudio de tratamientos contra el cáncer, el tejido tumoral se extrae de un
paciente y se implanta en ratones inmuodeficientes con fines de investigación. Los ratones con
xenoinjertos derivados de pacientes (PDX, del inglés "patient-derived xenograft") se pueden
usar para estudiar cuál podría ser el mejor tratamiento para un determinado paciente. Estos
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injertos también se usan en la búsqueda de nuevas drogas contra el cáncer. En la Figura 9 se
esquematiza la generación de los ratones PDX y su utilización.

Figura 9: Generación de ratones PDX Una porción de un tumor de un paciente es implantada en un ratón (deficiente e n
su propio sistema inmune). Así el tumor crece en el ratón y puede ser estudiado de distintas maneras. Se realiza el
análisis genómico o la amplificación del mismo en mayor número de ratones para, por ejemplo, realizar pruebas de
distintos tratamientos posibles. Además se puede preservar una muestra para el banco de tumores.

UNA MIRADA HACIA EL FUTURO…

El rápido avance de las técnicas de biología molecular ha permitido el desarrollo de

técnicas prometedoras que aportan una nueva perspectiva para el tratamiento de enfermedades
donde las metodologías convencionales no han tenido éxito.

-Terapia génica

Muchas enfermedades de origen genético se traducen en defectos en la expresión de

proteínas, las cuales son difíciles de administrar o modificar mediante técnicas farmacológicas ya
sea por su tamaño, complejidad o inaccesibilidad celular. Una de las aplicaciones futuras más
promisorias de la genética molecular en el tratamiento de las enfermedades es la implementación
de la terapia génica, la cual puede ser definida como la administración e introducción de material
genético en un tipo celular o tejido apropiado para afectar la expresión génica con el fin de obtener
un efecto terapéutico deseado, superando las barreras de una terapia farmacológica
convencional.
La terapia génica puede aplicarse utilizando diferentes estrategias:
1) Ex vivo: consiste en extraer las células que se deben reparar de un paciente, repararlas
en el laboratorio y reimplantarlas en el organismo del individuo en cuestión.
2) In situ: consiste en introducir el gen reparador directamente en el propio órgano
defectuoso del individuo.
3) In vivo: consiste en administrar directamente al paciente el gen corrector para que este
alcance el punto a tratar (Figura 10).

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Entre los principales obstáculos de esta aproximación se encuentra la dificultad de dirigir el

material genético específicamente a aquellas células o tejidos donde hace falta que el gen ejerza
su función, o que la regulación del gen introducido se aproxime a la forma en que se regula el gen
en las personas sanas.

Figura 10: Terapia génica in vivo: Introducción del ADN terapéutico en el paciente.

Por ejemplo, la fibrosis quística es una enfermedad hereditaria causada por mutaciones en
el gen que codifica para la proteína CFTR y afecta principalmente a los pulmones, en los que se
produce la acumulación de secreciones anormales que interfieren con el funcionamiento normal
de los mismos. Desde la identificación del gen CFTR como responsable de la fibrosis quística, la
terapia génica ha sido considerada como una de las vías terapéuticas para abordar el tratamiento
de la enfermedad desde su raíz: mediante la inhalación de moléculas de ADN se entrega a las
células pulmonares una copia normal de dicho gen.
Además de las enfermedades genéticas propiamente dichas, la terapia génica se está
aplicando de forma experimental al tratamiento del cáncer (en aquellos tumores que no tienen un
tratamiento eficaz o en los que el tratamiento convencional ha fracasado) (Figura 11), y, más
recientemente, otras enfermedades como la enfermedad coronaria, la enfermedad arterial
periférica o la artritis reumatoide.

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Figura 11: Ejemplo de terapia génica en cáncer.

En agosto de 2017, la FDA (U.S. Food and Drugs Administration o Administración de Alimentos y Medicamentos de
Estados Unidos) anunció la autorización por primera vez en la historia de la terapia génica contra el cáncer. Se auto ri zó
la utilización de Kymriah (tisagenlecleucel) como tratamiento para niños y jóvenes qu e sufren una forma de leucemia
linfocítica aguda (LLA). Kymriah es una inmunoterapia a base de células T autólogas genéticamente modificadas, es
decir que cada tratamiento de Kymriah constituye una dosis de las propias células T del paciente. El procesami e n to d e
las células T comienza con el recogimiento y envío de las células a un centro de producción, donde se modificarán
genéticamente incluyéndoles un nuevo gen que contiene cierta proteína específica (un receptor antígeno quimérico o
RAQ) la cual sirve para ordenar a los linfocitos T que atacan y eliminan a las células de leucemia cuya superficie tiene el
antígeno específico CD19. Una vez hecha la modificación genética de las células, éstas se vuelven a trasfundir al
paciente para que eliminen las células cancerígenas.

-CRISPR

En la actualidad, se conocen más de 10000 enfermedades hereditarias monogénicas

(causadas por un único gen) que afectan a millones de personas en todo el mundo. Algunas de
estas enfermedades son causadas por mutaciones autosómicas dominantes, es decir que la
herencia de una única copia defectuosa del gen responsable puede causar síntomas clínicos. El
desarrollo de técnicas que permitan editar o corregir con precisión y eficiencia el genoma de
células vivas es, por lo tanto, uno de los objetivos principales de la investigación biomédica. En las
últimas décadas se han investigado e implementado distintas herramientas de edición genómica
entre las cuales se destaca el sistema CRISPR/Cas9, un mecanismo de defensa bacteriano que
ha sido adaptado y rediseñado para su utilización en otros modelos celulares (Figura 12). La
tecnología CRISPR/Cas9 podrá corregir genes defectuosos en personas enfermas. Con esta
tecnología es posible alterar o eliminar cualquier secuencia o base en un genoma de billones de
nucleótidos. Al administrar la proteína Cas9 (“tijeras moleculares”) y los ARN guía apropiados a

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una célula, el genoma de ésta puede cortarse en los lugares deseados (cuyas secuencias serán
complementarias a las de los ARN guía utilizados). Esto permite la eliminación funcional de genes
o la introducción de mutaciones. Luego, utilizando los mecanismos normales de reparación de
ADN que tienen las células, se puede insertar la secuencia corregida del gen. La accesibilidad y el
enorme potencial de CRISPR/Cas9 han dado lugar a una revolución casi sin precedentes en las
ciencias biomédicas y representan un gran avance en el campo de la terapia génica.

Figura 12: Sistema CRISPR/Cas9

Links de interés
Laboratorio virtual para realizar una electroforesis en gel de agarosa:
https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/
Laboratorio virtual de PCR: https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/
Laboratorio virtual de Microarray: https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/

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