Danna Michell Galeano Peña

Elementos que debe tener un plásmido (vector): 1. Origen de replicación. 2. Sitios de inserción(Dianas) 3. Marcador de selección:
transformadas y no transformadas. 4. Marcador de identificación: Me permite identificar entre las transformadas recombinantes y
transformadas no recombinantes). 5. Operon Lac: Conjunto de genes distintos,
actúa como marcador de identificación y permiten a las bacterias metabolizar o usar
la galactosa como fuente de energía. Los plásmidos se usan para bacterias. Virus
Bacteriofagos: Tienen origen de replicación, sitios de inserción y secuencias cos.
Son parásitos obligados e infectan a bacterias; podemos aprovechar el genoma
(ADN) como vector del inserto. El vector del fago landa es el ADN, tienen
secuencias cos en los extremos,sirven para que el virus identifique su propio
genoma, los extremos cos se comportan como extremos cohesivos y se forman
como si fueran un plásmido. No provocan la muerte de las células que infectan de
una vez sino que se multiplican (ciclo lisogénico). Híbridos: 1. Cósmidos:
Combinación de un plásmido con una secuencia cos, no pueden infectar células
animales ni vegetales porque tiene la cápside del fago. Tienen todo los elementos
del plásmidos. 2. Fagemidos (fago-plasmidos): Está compuesto por un plasmido
pero tiene el origen de replicación de un fago M13. Tiene un origen de replicación
especial y permiten obtener copias de replicación monocatenarias: M13, fd, f1.
Cromosomas artificiales: Se llaman así porque se han cogido de distintos tipos de
células y se han modificado. Hay dos tipos de cromosomas artificiales: BAC y YAC
(levaduras). Células hospedadoras: Células eucariotas (Animales, vegetales y
levaduras) , procariotas. Fases del proceso de clonación: 1. Creación del vector
recombinante. 2. Introducción del vector recombinante en la célula hospedadora:
Transformación bacteriana (para bacterias).Conseguimos que adquieran algo que
no tenían (el vector), sólo las bacterias competentes. Transfección (solo nos sirve
para células eucariotas). La forma de hacer que el vector entre en esta célula será
encapsulando al vector en una vesícula que llamamos liposoma;lo introduce en ella por
endocitosis. Transducción (Está mediado por virus). La cápside del virus es la que permite la
entrada del vector en la célula hospedadora; para levaduras no. Electroporación (todos)Dar
descargas eléctricas (algunas células se mueren) a las células que tenemos y eso hace que se
generen canales o se abran poros permitiendo así la entrada de vectores. 3. Selección e
identificación. Locus: Localización en el genoma, allí hay una secuencia de ADN, las letras que
ocupan ese sitio pueden ser diferentes opciones, podemos tener muchas opciones para el
mismo locus. Cada una de esas opciones que tenemos para el mismo sitio es un alelo, y todo
ese conjunto o posibles variantes para el mismo sitio es un
conjunto de alelos que formarían el polimorfismo,
ejemplo:humanos, cada uno de nosotros tiene dos alelos
posibles.Técnicas de hibridación en soporte sólido. Dot blot:
Podemos estudiar varias muestras a la vez. Utiliza membranas de nailon como soporte sólido, las
sondas son de ADN y el marcaje con isótopos radioactivos. Pasos: Aplicación de la muestra a la
membrana, Pre Hibridación(bloqueo), hibridación, lavado posthibridación, revelado. Aso dot blot:
Podemos detectar polimorfismos (combinación de alelo para un locus), e identificar células
recombinantes. Southern blot: Solo ADN, identificar fragmentos separados por electroforesis y
transferidos a la membrana. Pasos: digestión enzimática, electroforesis en gel de agarosa,
desnaturalización del ADN, transferencia a la membrana de nylon, bloqueo de la membrana,
fijación, añadir sonda e incubar, lavado y revelado). Northern blot: Solo ARN, identificar
fragmentos separados por electroforesis y transferidos a la membrana, igual que Southern Blot
pero esta técnica no necesita digestión previa y la electroforesis en condiciones
desnaturalizantes. Microarrays: Conjuntos de sondas de ADN, se crea ADNc
(monocatenario) con nucleótidos fluorescentes.Hibridación en medio líquido:
Técnica de captura de híbrido:Formación de híbridos ARN-ADN que serán
capturados por anticuerpos específicos fijados a las paredes de una placa
microtiter(se añade la muestra con las sondas, si la muestra es ADN, la
sonda es ARN, y viceversa, hibridación, lavado, adición de Ac marcados,
lavado y revelado), técnica de ADN ramificado (ADNb): Aumentar la señal de
la hibridación (se añaden las sondas y los oligonucleótidos, se incuba para
que se hibriden, lavado y revelado). Hibridación IN SITU (ISH):Que hibriden
en la misma célula, hay dos técnicas. Hibridación in situ FISH: Hibridación in situ con
fluorescencia (fluorocromos), Imagines en la que podemos ver los núcleos o los cromosomas.
Sondas CEP: hibridan en el centrómero y sirven para alteraciones cromosómicas numéricas.
Sondas LSI: en un locus concreto y sirven para anomalías cromosómicas numéricas,
estructurales(deleción). Translocación no recíproca: sondas de separación [ins]. Translocación
recíproca: sondas de fusión (cromosomas involucrados) (puntos de rotura de cromosomas).
Pintado de cromosomas, sondas teloméricas, fish multicolor (sondas BSP), cariotipo espectral.
Hibridación in situ cromogénica (CISH):Técnica cromogénica y se marca con enzimas (el color
se genera en el sitio donde haya hibridado la sonda). (Desparafinar con xilol y rehidratar,
digestión enzimática, prehibridación, hibridación, lavado, detección del híbrido, contratinción y
observación).