MICROBIOLOGÍA

AMBIENTAL

GUÍA DE PRÁCTICA N° 4

MEDIOS DE CULTIVO

ALUMNO (A): Mayerly Esther Jaramillo Mori.

FECHA: 26/10/2022

1. Objetivo
• Conocer la clasificación, preparación, esterilización y distribución de los medios de
cultivo.
• Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta preparación del medio de
cultivo en la práctica microbiológica.
• Adquirir práctica en el preparado de algunos medios de cultivo.
• Reconocer la necesidad de evitar la contaminación tanto de los medios de cultivo
como de los demás elementos utilizados en el laboratorio de microbiología
ambiental.

2. Generalidades
Los microorganismos se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos,
razón por la cual es difícil aislarlas, para lo cual debemos estar preparados para aislar,
cultivar e identificar a los mismos. Si bien el aislamiento es un paso crucial en este
camino, comenzaremos examinando los medios de cultivo, ya que en estos últimos se
basan muchos de los principios del aislamiento. Un medio de cultivo es un conjunto de
nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones
necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es un soporte que
proporciona sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproducción de
microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, por
ello, la variedad de medios de cultivo también lo es, no existiendo un medio de cultivo
universal adecuado para todos ellos.
El conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos es
fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Los requisitos que debe
reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el
que se desarrollan.
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado
por una serie de factores de gran importancia:
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• Disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener
como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos
casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del
crecimiento. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de
infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la
preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba
la pérdida de los factores nutritivos lábiles.
Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es
utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de
nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar
directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y
otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añaden
sustancias como suero, sangre, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos
carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o
potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza
vitamínica.
Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como
indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de actuar
como inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

• Consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo
productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en
estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran
inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a
temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen
la capacidad de licuarla. Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por
su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos
cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

• Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

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Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno
normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos.
Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente
en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los
microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas
parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los
anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de
las citadas condiciones.

• Condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en
los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las
estufas de cultivo a 35-37 ºC cuando sea necesario que mantenga la humedad
necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

• Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en
presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los
microorganismos fotosintéticos.

• pH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los
microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH
neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe
olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el
crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos
metabólicos normales.

• Temperatura
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y
43 ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0º C y los temófilos a 80º C o incluso a
temperaturas superiores (hipertemófilos).
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En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho

más reducidos, alrededor de 37º C, y los saprófitos desarrollan en rangos más
amplios.

• Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles:
- Para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o
incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes
inoculados en dichos medios.
- Para que el resultado obtenido sea el correspondiente al nivel de contaminación
de la muestra a analizar.

3. Composición de los medios de cultivo

Sus componentes básicos deben satisfacer las mínimas exigencias nutricionales para el
desarrollo microbiano y varían según el tipo de bacteria. Incluyen: agua, nutrientes como
fuentes de nitrógeno, carbono y energía; y en ciertos casos, factores de crecimiento.
Se considerarán además para el crecimiento, necesidades de O2 (aerobios), CO2 parcial
(microaerófilos) o total (anaerobios) y condiciones óptimas de pH y temperaturas de
incubación.
Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son:
a. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene de
ciertas algas marinas.
Las bacterias no son capaces de degradarlo. Se licúa completamente a la
temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40°C.
b. Azúcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más
empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa.
c. Peptonas. Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o
enzimática de proteínas animales o vegetales.
d. Extractos. Son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales
obtenidos con agua y calor. Los extractos son ricos en proteínas de bajo peso
molecular y en factores de crecimiento.
Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc.
• Extracto de carne: Concentrado de componentes hidrosolubles de la carne.
Aporta sustancias nitrogenadas como: aminoácidos, bases púricas y pirimídicas,
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ácidos orgánicos, creatina, urea, y sustancias no nitrogenadas como glucógeno,

fosfatos de hexosas, ácido láctico, sales inorgánicas. La calidad de este tipo de
extracto varía con la carne empleada, el tiempo y la temperatura de extracción.
Su función es ser complemento vitamínico de las peptonas.
• Extracto de Levadura: Se obtiene por autolisis de las células de levadura de
cervecería y de panadería, que son inducidas a autolisarse por calor a 55°C o
pueden ser hidrolizadas con HCI o enzimas proteolíticas. Su función es ser
suplemento vitamínico de las peptonas, pero también aporta mezclas de
aminoácidos y péptidos, y carbohidratos. Sustituye al extracto de carne.
e. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguíneo son añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos
microorganismos patógenos.
f. Sistemas amortiguadores. Son sales que se añaden al medio para mantener el pH
dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisódicos o
bipotásicos.
g. Indicadores de pH. Son indicadores ácido-base que se añaden para detectar
cambios de pH en el medio.
h. Agentes reductores. Sustancias que se añaden al medio para crear las condiciones
que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios. Ej.:
cisteína y tioglicolato.
i. Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc. que a
determinadas concentraciones en el medio actúan como agentes selectivos frente a
determinados microorganismos.

4. Clasificación de los medios de cultivo

Según su composición y objetivos se clasifican de la siguiente manera:
a. MEDIOS COMUNES: Aquellos que contienen los mínimos componentes
nutricionales para organismos heterotrófícos no exigentes. Estos pueden ser
líquidos, sólidos y semisólidos. Ejemplo:
• Medios Líquidos: Son de consistencia líquida. Ejemplo: Caldo nutritivo, caldo
peptonado, caldo triptosa, caldo carne y otros.
• Medios Sólidos: Nutrientes compuestos de un medio líquido base, al que se le
agregan sustancias orgánicas de poco o nulo valor nutritivo como el agar o
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gelatina, para dar al medio consistencia de gel. Ejemplo.: Agar nutritivo, agar
peptonado, agar almidón, medio de gelatina y otros.
El Agar Nutritivo depositado en placas Petri, permite el aislamiento de bacterias
no exigentes a partir de una fuente problema. También es importante su utilidad
para otros fines como para la preparación de cosechas bacterianas masivas en la
elaboración de antígenos, vacunas, conservación de cepas para estudios
culturales en tubos de prueba, etc.
• Medios Semisólidos: Compuesto por cualquiera de los medios líquidos antes
mencionados, a los que se adiciona una cantidad suficiente de agar (0.5%). para
obtener un estado de gel blando (semisólido). Principalmente se les usa para
estudios de motilidad macroscópica en columna de los microorganismos,
mantenimiento en cepario y estudios de la capacidad respiratoria.

b. MEDIOS ENRIQUECIDOS O SUPLEMENTADOS: Son medios complejos

(normalmente) con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de
determinados microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes). Se
componen de un medio basal ordinario suplementado con factores de crecimiento
como sangre, suero sanguíneo, líquido pleural, vitaminas, extracto de levadura,
bases nitrogenadas, carbohidratos y sales minerales. Estos medios pueden ser:
líquidos o sólidos. Ejemplos:
• Medios Líquidos: Caldo cerebro corazón, caldo extracto de levadura, caldo
suero, caldo tripticasa soya, etc.
• Medies Sólidos: Agar cerebro corazón, agar extracto de levadura, agar sangre,
agar chocolate, suero coagulado de Loeffler y otros.

c. MEDIOS DEFINIDOS O SINTETICOS: Preparados exclusivamente de

sustancias químicas definidas, por lo tanto su composición se conoce.

d. MEDIOS NO DEFINIDOS O COMPLEJOS: Contienen algunos ingredientes

cuya composición exacta se desconoce. Ejemplo: Caldo nutritivo, Caldo de triptona,
Agar Mc Conkey.

e. MEDIOS ESPECIALES: Son aquellos que además de contener los requerimientos

nutricionales básicos, llevan en su composición sustancias inhibidoras con carácter
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selectivo y compuestos específicos e indicadores para poner de manifiesto los

principales caracteres bioquímicos esenciales para el diagnóstico específico. Entre
las sustancias inhibidoras, los medios pueden contener sales biliares, antibióticos,
colorantes u otros; pueden afectar el metabolismo o sistema enzimático con carácter
de selección. Comprende:
- Medios de ENRIQUECIMIENTO: Que favorecen el crecimiento de uno o un
grupo de microorganismos en particular, e inhiben en lo posible a otros de la
microflora acompañante. Ejm.: Agua peptonada alcalina (APA).
- Medios SELECTIVOS: Que favorecen el aislamiento de un determinado grupo
de microorganismos mediante la obtención de colonias (cepas puras). Todos son
utilizados en condiciones sólidas. Ejm: Agar McConkey y Agar Saboraud.
- Medios DIFERENCIALES: Empleados para detectar reacciones bioquímicas,
con carácter diferencial de grupos, géneros y especies microbianas. Ejm. Agar
TSI.

5. Posibles fuentes de error en la preparación de medios de cultivo

- Medio inadecuado.
- Pesaje erróneo.
- Material de vidrio mal lavado.
- Agua de mala calidad.
- Sobrecalentamiento.
- Esterilización inadecuada.
- No ajustar pH.
- Distribución incorrecta.
- Inadecuado almacenamiento.
-
6. Preparación
En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados,
normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la
preparación de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada
del mismo y disolverla en agua destilada, siguiendo las instrucciones del fabricante y
luego esterilizarlo.
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En caso que el medio de cultivo debamos hacerlo nosotros, la preparación de un medio

de cultivo comienza por hacer un estudio de la fórmula que constituye una receta que
deberá respetarse estrictamente.
Primero se agrega agua destilada o desionizada a un recipiente, luego se van
incorporando todos los ingredientes de la lista en el orden en el que se encuentran, es
conveniente disolverlos de a uno antes de agregar el siguiente. Si se usa agar, este se
debe agregar al final.
A continuación, se enumeran algunas precauciones que deben tenerse en cuenta
durantela elaboración de los medios:
- La balanza a utilizar en la pesada del medio deshidratado o de sus ingredientes debe
estar calibrada en frecuencia establecida en un Plan Maestro de Calibraciones del
Laboratorio.
- Los recipientes a utilizar en la preparación y envasado de los medios deben estar
limpios, ya que residuos de detergentes o restos de otras sustancias que se hallen por
lavado deficiente, puede causar efecto inhibitorio en la capacidad de crecimiento de
los microorganismos.
- Los recipientes destinados a la preparación de medios de cultivo deben ser lo
suficientemente grandes para que el medio de cultivo que se prepara pueda ser
agitado con facilidad, y los destinados al envasado para que durante la esterilización
por autoclave no haya derrame de medios de cultivo o rotura de frascos.
- Las espátulas, cucharas y agitadores utilizados para la elaboración del medio deben
estar limpios.
- El agua para disolución de los medios debe ser Agua Purificada o Destilada.
- Cuando el envase de medio de cultivo se abre por primera vez deberá anotarse, cerca
de la fecha de ingreso, la fecha de apertura (día, mes y año).
- Verificar que el medio de cultivo no se encuentra vencido. En caso que esto suceda,
descartarlo y utilizar otro envase.
- Agitar el envase para favorecer la mezcla de sus componentes.
- Pesar exactamente la cantidad deseada de acuerdo al volumen total a preparar,
siguiendo las indicaciones descriptas en la etiqueta del envase.
- Cerrar herméticamente el envase del medio de cultivo pesado (para evitar absorción
de humedad, oxidación y/o contaminación) y guardarlo en su correspondiente lugar
de almacenamiento.
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- Rehidratar con el volumen correcto de agua. Para ello, primero es conveniente

agregar aproximadamente la mitad de la cantidad de agua necesaria y agitar
suficientemente para conseguir una suspensión homogénea; luego incorporar la
cantidad de agua restante, aprovechando esta adición para desprender e incorporar al
conjunto las partículas de medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la
pared.
- Calentar el medio cuando es indicado por el fabricante. Por lo general los medios
líquidos pueden necesitar calentamiento sólo cuando es necesario disolver
completamente; y los medios agarizados necesitan calentar hasta ebullición.
- Medir el pH antes de su esterilización y ajustarlo en caso de ser necesario. Registrar
el valor obtenido.
- Tapar y etiquetar cada recipiente con el nombre del medio de cultivo.
- Autoclavar.

Metodología para la medición del pH:

Si bien cuando se utiliza agua neutra para su preparación los medios de cultivo muestran
un valor correcto de pH, se recomienda comprobar el mismo y proceder su corrección
en caso necesario. Para la toma del pH se recomienda usar un pHmetro.
Para asegurar un pH final correcto, es necesario tomar el valor de pH antes de la
esterilización, y en caso necesario ajustarlo añadiendo cantidad suficiente de NaOH 0,1
N o HCl 0,1 N, o lo que indique el fabricante del medio de cultivo deshidratado.

7. Servir el medio
Los medios sólidos sometidos al proceso de esterilización y enfriados a 50-55°C, deben
de repartirse en alícuotas de 12 a 15 mL en 1-2 placas Petri en condiciones asépticas;
para ello se tendrá que seguir las siguientes indicaciones:
• No destapar las cajas de petri, sino hasta el momento que vayan a ser utilizadas.
Es conveniente colocarse un cubre bocas la persona que va a realizar el vaciado
y evitar hablar en todo momento para no contaminar el medio de cultivo.
• Es conveniente mantener el mechero encendido y trabajar cerca del área estéril
al momento del vaciado en las cajas de petri. Levantar la tapadera de la caja petri
con la mano izquierda, sin soltarla y sin retirarla demasiado de la base de la
misma caja mientras que con la mano derecha tomar el matraz que contiene el
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medio de cultivo y realizar el vaciado de aproximadamente 15 ml a 20 ml de

Agar por placa procurando que no se forman burbujas, se procede a tapar la caja
inmediatamente.
• Si se forman burbujas, tomar el mechero, flamear el medio de cultivo sobre la
superficie de la caja de petri y de manera rápida. Se procede a tapar la caja.
Esperar a que el medio solidifique.
• Se rotulan los medios de cultivo, anotando la fecha y con iniciales el tipo de
medio de cultivo. Se colocan en el refrigerador de manera invertida para evitar
que el vapor condensado caiga sobre el medio de cultivo y lo pueda contaminar.
• Si se desea añadir medio sólido en tubos, se sirve el medio, y se deja que
solidifiquen inclinados, para ello colocarlos en una superficie lisa inclinándolos
en un ángulo de 20° a 30° sobre una varilla de vidrio.

8. Control de inocuidad
Para asegurarnos de que se realizó una esterilización y servido de medio correcto, se
deben dejar las placas o tubos en una refrigeradora por 24 horas. De no haberse
desarrollado ningún microorganismo en este, estará apto para ser utilizado.

9. Materiales para práctica en laboratorio

Describa los materiales, insumos, equipos y servicios utilizados en el desarrollo de
la practica
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10. Procedimiento
Describa detalladamente el procedimiento realizado en laboratorio.
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11. Resultados
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12. Cuestionario
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8. Referencias Bibliográficas
Difco y BBL (2003). Manual de Medios de Cultivo Microbiolicos.
Jorge Luna, F. (2012). Manual de prácticas de laboratorio de Microbiología.
Editorial Unimagdalena.
Lynch, M.J. (1972). Métodos de Laboratorio 2ª. Ed. México: Editorial Interamericana.
Madigan, M. T., Martinko G. M., Parker J. Brock (2004). Biología de los
Microorganismos. Ed. Pretice Hall. 8ª edición.
Thomson, R.B., and J.M. Miller (2003). Specimen collection, transport, and
processing: bacteriology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A.
Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed.
American Society for Microbiology, Washington, D.C.
Tortora G, Funke B, Case C. (2004). Microbiology an introduction. 8th ed. San
Francisco: Benjamin Cummings.
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