CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO

https://www.youtube.com/watch?v=VhayBwZOBn0 curva de cremiento microbiano

https://www.youtube.com/watch?v=faObFbcQL3M curva de crecimiento
https://www.youtube.com/watch?v=fxha8CqCKdk calcular el tiempo de duplicación
https://www.youtube.com/watch?v=RnM-5avNaZo curva de crecimiento en Excel

I. INTRODUCCION

El estudio y desarrollo del crecimiento microbiano comprende varias disciplinas a pesar de ser
un fenómeno natural, su descripción en términos cualitativos y cuantitativos es compleja,

En un cultivo microbiano todas las partes están sujetas a las mismas condiciones de
temperatura, pH, concentración de nutrientes, etc., las frases que ocurren en un cultivo
microbiano reflejan cambios en la biomasa y en el medio ambiente. Las fases son: Latencia,
Logarítmica, estacionaria y muerte.

La determinación de la concentración celular (X), se hace de diversas maneras dependiendo

de las características físicas de los microorganismos, principalmente su tamaño. El crecimiento
celular se determina midiendo en número de células o la masa celular. El número de células
se puede medir en organismos celulares (bacterias y levaduras) utilizando microscopios, se
considera que este es un método rápido y barato para ciertos tamaños de células, pero con la
desventaja de que no se obtiene información acerca del estado de dichas células (vivas o
muertas). Otro procedimiento es “plaquear”, o sea, colocar un volumen pequeño de cultivo en
una placa de petri con medio nutritivo en incubarlo a una determinada temperatura durante un
tiempo fijo, el resultado del número total de células vivas se obtiene contando el número de
colonias y multiplicando por el inverso de la dilución que se haya hecho. El método más
empleado para medir el crecimiento en bacterias es por nefelometría (dispersión de la luz) o
mediante un mediado electrónico. Ambos métodos dan buenos resultados y permiten trabajar
con diluciones diluidas.

Dado que dos nuevas células producidas por el crecimiento y división de una célula son
capaces de crecer a la misma velocidad que la célula progenitora, el número de células en un
cultivo aumenta con el tiempo en progresión geométrica, es decir exponencialmente. La
velocidad de crecimiento de un cultivo en un momento dado, es directamente proporcional
al número de células presentes en ese momento, así se tiene:

dN/dt = KN (1), integrando tenemos; N = No.ekt (2), donde:

N = número de células en cualquier momento (t)
No = número de células en el tiempo cero.
K = constante de crecimiento (h--1)

Para los organismos que se reproducen por fisión binaria, una generación se define como la
duplicación del número de células (N) aumenta con las generaciones (G) de acuerdo a la
relación N = No2g (3), combinando las últimas dos ecuaciones tenemos No.ekt = No2g (4)
simplificando tenemos g/t = k/Ln2.
 La presente práctica tiene como objetivo determinar la curva de crecimiento, constante de
crecimiento y el tiempo de generación bacteriana.

II. MATERIAL Y METODOS:

2.1 Material biológico.

• Cepa de Escherichia coli

2.2 Material y equipo de laboratorio

• Reactor Air Lift
• Reactor con agitación sin aireación.
• Placas Petri
• Pipetas serológicas de 1 ml
• Pipetas serológicas de 5 ml
• Pipetas serológicas de 10 ml
• Tubos de ensayo de 13x100
• Matraces de 250 ml
• Balones de 1000 ml
• Asa bacteriológica
• Mecheros
• Alcohol yodado
• Tubo Nº 3 del Nefelómetro de Mac Farland.

2.3 Medios de Cultivo, Nutrientes y Reactivos

Agar nutritivo
• NaCl
• Caldo nutritivo
• Solución salina
• KNO3

2.4 Procedimiento.

PREPARACION DEL INOCULO.

De un cultivo de E. coli sembrado por el método de extensión en superficie en una placa
de Petri conteniendo agar nutritivo e incubado a 37ºC por 24 horas, hacer un lavado con
5 ml de SSF, depositarlo en un tubo de ensayo y roturarlo como suspensión bacteriana
original. A partir de esta suspensión hacer diluciones comparándolas con el tubo N 3 del
Nefelómetro de Mac Farland (9x108 UFC/ml). Luego hacer diluciones hasta obtener una
concentración aproximada de 109 bacterias/ml. Esta suspensión se denominará inoculo.

INOCULACION DE LOS BIORREACTORES

Los biorreactores caldo nutritivo, serán inoculados con 3 ml del inoculo. Hacer funcionar
los biorreactores y medir los parámetros de iniciación (pH, temperatura)

RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC/ml)

A los tiempos 0, 2, 4, 6, 10, 12 y 14 horas, tomar muestras de 1 ml, leer en
espectrofotómetro y hacer diluciones de siembra (según cuadro Nº 1) y sembrar 1 ml en
las placas Petri, agregarle 1 ml de agar nutritivo licuado a 45ºC y luego homogenizar por
movimientos rotatorios de las placas, dejar que el medio solidifique. Llevar a incubar las
placas a 37ºC por 24 horas. Pasado este tiempo, hacer los recuentos de las colonias con
ayuda de un cuenta colonias.

GRAFICA DE LA CURVA DE CRECIMIENTO

Plotear los recuentos vs tiempo en el papel semilogaritmico y graficar la curva de
crecimiento de la bacteria. De igual modo, plotear las densidades ópticas vs tiempo y
graficar en papel semilogaritmico. Diferenciar las fases lag, log, estacionaria y muerte
bacteriana. Calcular de la fase log, las constantes de crecimiento, tiempo y numero de
generaciones de la bacteria.

Cuadro Nº 1. Tiempo de Incubación y Diluciones de Siembra.

TIEMPO DILUCIONES

(horas) SIN AIREACION CON AIREACION

00 -4 y -5 -4 y -5
02 -4 y -5 -4 y -5
04 -4 y -5 -5 y -6
06 -5 y -6 -6 y -7
08 -6 y -7 -7 y -8
10 -7 y -8 -7 y -8
12 -7 y -8 -5 y -6
14 -6 y -7 -5 y -6

NEFELOMETRO DE Mc FARLAND

Nº BaCl2 0.048M H2SO4 0,36M Volumen UFC/ml

ml ml final ml
0,5 0,05 9,95 10 1,5x108
1 0,1 9,9 10 3x108
2 0,2 9,8 10 6x108
3 0,3 9,7 10 9x108
4 0,4 9,6 10 12x108
5 0,5 9,5 10 15x108
6 0,6 9,4 10 18x108
7 0,7 0,3 10 21x108
8 0,8 9,2 10 24x108
9 0,9 9,1 10 27x108
10 1,0 9,0 10 30x108
 METABOLISMO AEROBIO Y ANAEROBIO

I. INTRODUCCION

Todos los organismos heterótrofos obtienen fundamentalmente su energía de las reacciones

de oxidación y reducción, es decir, aquellas en la que los electrones son transferidos de un
dador electrónico o agente oxidante a un aceptor electrónico o agente reductor. Los organismos
aeróbicos obtienen la mayor parte de su energía de la respiración aerobia, que se define como
la oxidación de los combustibles orgánicos por el oxígeno molecular, donde el oxígeno actúa
como final de electrones en la cadena respiratoria.

Los heterótrofos anaeróbicos obtienen también su energía de las reacciones de óxido-

reducción (respiración aerobia), pero en este caso, los aceptores finales de electrones son otras
sustancias distintas al oxígeno, inorgánicas u orgánicas.

Los organismos anaeróbicos pueden ser estrictos o facultativos, estos últimos pueden vivir en
presencia o ausencia de oxígeno. un anaerobio facultativo típico lo constituye Escherichia coli,
quien en presencia de glucosa tiene un metabolismo distinto en aerobiosis y anaerobiosis.

Los objetivos de la presente práctica son:

• Establecer diferencias entre los procesos de respiración aeróbica y anaeróbica.
• Medición de biomasa y consumo de glucosa rn cada uno de los procesos mencionados.

II. MATERIAL Y METODOS:

2.1 Material biológico.

• Cultivos de Escherichia coli

2.2 Material de vidrio.

• Placas Petri
• Pipetas serológicas de 1 ml
• Pipetas serológicas de 5 ml
• Pipetas serológicas de 10 ml
• Tubos de ensayo de 13x100
• Matraces de 250 ml
• Balones de 1000 ml
• Probeta de 50 ml

2.3 Biorreactores

• Reactor Air Lift

 • Reactor con agitación sin aireación

• Asa bacteriológica
• Mecheros
• Alcohol yodado
• Tubo Nº 3 del Nefelómetro de Mac Farland.

2.4 Medios de Cultivo, Nutrientes y Reactivos

• Agar nutritivo
• NaCl
• Caldo nutritivo
• Solución Salina Fisiológica
• Vaselina Estéril
• Caldo base de fermentación

2.5 Procedimiento.

INOCULACION DE LOS BIORREACTORES

.
En los biorreactores, para metabolismo aeróbico y anaeróbico, conteniendo cada uno 400
ml de caldo nutritivo-KNO3 al 0.5%, inocular una suspensión de E. coli de 106 bact/ml
De un cultivo de E. coli a partir de un cultivo de 24 horas sembrado por el método de
extensión en superficie en una placa de Petri conteniendo agar nutritivo e incubado a 37ºC
por 24 horas, hacer un lavado con 5 ml de SSF, depositarlo en un tubo de ensayo y
roturarlo como suspensión bacteriana original. A partir de esta suspensión hacer
diluciones comparándolas con el tubo N 3 del Nefelómetro de Mac Farland (9x10 8
UFC/ml). Luego hacer diluciones hasta obtener una concentración aproximada de 109
bacterias/ml. Esta suspensión se denominará inoculo.

INOCULACION DE LOS BIORREACTORES

Los biorreactores caldo nutritivo, serán inoculados con 3 ml del inoculo. Hacer funcionar
los biorreactores y medir los parámetros de iniciación (pH, temperatura)

RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC/ml)

A los tiempos 0, 2, 4, 6, 10, 12 y 14 horas, tomar muestras de 1 ml, leer en
espectrofotómetro y hacer diluciones de siembra (según cuadro Nº 1) y sembrar 1 ml en
las placas Petri, agregarle 1 ml de agar nutritivo licuado a 45ºC y luego homogenizar .

GRAFICA DE LA CURVA DE CRECIMIENTO

Plotear los recuentos vs tiempo en el papel semilogaritmico y graficar la curva de
crecimiento de la bacteria. De igual modo, plotear las densidades ópticas vs tiempo y.