Universidad Nacional Abierta y a Distancia

Escuela de Ciencias Básicas, Tecnología e Ingeniería-

UNAD

INFORME
Componente
Prá ctico
BIOTECNOLOGIA

Esta práctica se desarrollará a partir del uso de la

herramienta multimedia especialmente creada para
este fin. Unidad 1, 2 y 3 LABORATORIO VIRTUAL DE GRUPO: 50907
BIOTECNOLOGIA

Presentado por:
Luz Merys Coronado M.
Código: 1065581623

Tutora: Fedra Lorena Ortiz

 OBJETIVO GENERAL

- Desarrollar prácticas virtuales de laboratorio del curso de

Biotecnología a partir del uso de la herramienta multimedia
especialmente creada para este fin.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

- Identificar el entorno para el desarrollo de las prácticas virtuales.

- Acceder al instructivo el cual contiene los requerimientos técnicos y
procedimientos para actuar con el laboratorio.
- Resolver dudas mediante Skype en los horarios establecidos.
- Identificar características metabólicas de microorganismos
productores de enzimas de enzima amilolíticas
- Producir amilasas por los microorganismos del suelo.
- Aislar ADN bacteriano.
 PRACTICA 2- PRODUCCIÓN DE AMILASAS POR LOS MICROORGANISMOS
DEL SUELO

FUNDAMENTACION TEORICA

La producción de enzimas para uso industrial tuvo sus orígenes en

Dinamarca y Japón, a finales del siglo XIX cuando se produjeron las
primeras preparaciones de renina a partir del estomago de terneros y de
amilasa de origen fúngico. Las enzimas son productos de las células y por
lo tanto pueden obtenerse a partir de tejidos animales, tejido vegetal o a
partir de fermentaciones empleando microorganismos seleccionados. Los
microorganismos pueden utilizar diferentes compuestos orgánicos como
fuentes de carbono para sus necesidades metabólicas como glucosa,
sacarosa, celulosa almidón.

Los organismos que utilizan el almidón comúnmente se les denominan

amilo líticos, pueden utilizar este polímero porque poseen enzima alfa
amilasa la cual se encarga de degradar el almidón hasta convertirlo en
glucosa, mundialmente la producción de enzimas está desarrollándose
cada vez más con el fin de optimizar procesos y convertirlos en
bioprocesos. Debido a esto diversos lugares del mundo se investiga en el
área de la enzimología y su impacto que ocasionan en los procesos y
reacciones químicas. Actualmente las enzimas amilasas son las más
estudiadas debido a su influencia directa en la degradación del almidón,
uno de los productos mas explotados a nivel mundial
Conceptos claves
Almidón: es un polisacárido muy importante en la constitución de los alimentos que lo
contienen desde el punto de vista nutricional y tecnológico.
Amilasas: son enzimas responsables de la degradación del almidón, hidrolizan los enlaces
glucocídicos a-1-4

METODOLOGIA

Materiales

- 3 cultivos de bacterias
- Azas de transferencias
- 9 erlenmeyer con caldo de cultivo estéril
- Incubadora a 37°C
 - Agua destilada estéril
- Tubos de ensayo con 9ml de solución salina estéril (80)
- Pipetas de 10 mm
- Espectrofotómetro
- Mechero
- Celdas de cuarzo
- Balanza analítica
- Horno

Procedimiento:

Cultivos de bacterias
Se trabajara con tres bacterias diferentes (a, b, c) contenidas en
caja de Petri con agar.
Activación de la bacteria a
Se toma la caja de Petri a con una mano y con la otra mano se
flamea el asa en el mechero, se espera que esta se enfríe y luego se
toma una colonia de la bacteria y se la coloca en el erlenmeyer 1
que contiene caldo nutritivo estéril; seguidamente se flamea el asa
nuevamente se toma una colonia de la bacteria a y se la coloca en el
erlenmeyer 2 que contiene caldo nutritivo estéril; posteriormente
se flamea el asa y se toma una colonia de la bacteria y se pone en el
erlenmeyer 3 que también contiene caldo nutritivo estéril.
Se procede a tapar los erlenmeyer con papel aluminio.
Del mismo modo se realiza la activación de las bacterias b y c
siguiendo los mismos pasos.

Cultivo
Se colocan los 9 erlenmeyer anteriormente preparados en la
incubadora shaker termostato a 37°C por 24hr a 100 rpm.

Preparación del blanco para la bacteria a

Para realizar la lectura en el espectrofotómetro se debe ajustar la
absorbancia a cero por medio de la solución blanco. Esta solución se
prepara colocando 10 ml de caldo nutritivo estéril (sin bacteria) en
un tubo de ensayo, posteriormente transferir esto a una celda de
cuarzo y realizar el ajuste a cero.

Ajuste del inoculo para la muestra a1

Para realizar el ajuste del inoculo de debe leer en
espectrofotómetro cada una de las muestras a 600nm. Se coloca
inicialmente el blanco ajustando el espectrofotómetro en cero
posteriormente, se lee la muestra a1 que contiene el inoculo.
Del mismo modo se realiza el ajuste del inoculo para la muestra a2 y
a3 y se leen los resultados.
Para las muestras de la bacteria b y c se realiza el mismo
procedimiento y se toman las lecturas del espectrofotómetro.

Inoculación
Transferir con pipeta 5ml de caldo ajustado a cada una de las
muestras a tres matraces con caldo de cultivo e incubar a 30°C por
24hr
Prueba de cuantificación de almidón preparación del blanco
Se coloca en un tubo de ensayo 1 ml de solución de sales mas 1 ml
de reactivo (yodo o lugol) y 2 ml de agua destilada cada una de
estas soluciones se deben colocar con una pipeta diferente.
Posteriormente se coloca 1 ml se solución blanco en cubeta de
cuarzo, colocar el espectrofotómetro a 650 nm y ajustar a cero la
absorbancia.
Importante destacar que esta solución será utilizada como blanco
para las bacterias a, b y c

Prueba de cuantificación de almidón lectura de muestra

En un tubo de ensayo se coloca 2 ml de agua mas 1 ml del cultivo
del erlenmeyer a1 y adicionar 1 ml de reactivo (lugól). Se procede a
homogenizar la muestra en un en un vortex.

Medida de absorbancia
Ajuste a cero y medida para los inóculos
Para la medición de absorbancia del inoculo se toma a1 ml de
muestra y se coloca en una celda de cuarzo. Inicialmente se debe
colocar en el espectrofotómetro la solución blanco preparada
anteriormente se ajusta a cero y luego se coloca la celda que
contiene el inoculo, se mide y se anotan los resultados.
Se realiza el mismo procedimiento para las muestras a2, a3 y con
las muestras b y c. Se procede a leer los resultados.

Cuantificación de biomasa
 Se pesa en la balanza analítica 9 tubos de falcón de 15 ml vacios y
registrar el peso (peso1) de cada tubo en la tabla de resultados.
Posteriormente se transfiere con una pipeta estéril 10 ml de cultivo
a1 a un tubo falcón ( de la misma se procede para cada una de las
muestras a2, a3, b1, b2. B3, c1, c2 y c3).
Los nueve tubos son centrifugados a 5000 rpm durante 5minutos
luego de la centrifugación de cada tubo se procede a eliminar el
sobrenadante y dejar solo el pelet, después se debe secar el tubo
falcón con el botón pelet en horno a 90°C durante 24 horas.
Por último el tubo que está completamente seco se debe pesar y
ese dato se refleja en una tabla como peso 2.

RESULTADOS

Para hallar la biomasa total se realiza la siguiente ecuación

BIOMASA = la diferencia entre el peso 2 y el peso 1, los resultados son

expresados en gramos por litro y se registran en la tabla de resultados

Tabla de Resultados

Réplica Peso 1 Peso 2 Biomasa (g/L)

A Caldo 1 5.4 7.02 16.20
Caldo 2 5.6 7.28 14.80
Caldo 3 5.8 7.54 17.40
B Caldo 1 6.3 8.82 25.20
Caldo 2 6.7 9.38 26.80
Caldo 3 6.1 8.54 24.40
C Caldo 1 5.5 8.25 27.50
Caldo 2 6.3 9.45 31.50
Caldo 3 6.0 9.00 30.00

Cuestionario:

Cuál de los microorganismos es el más efectivo?

Las amilasas se caracterizan por hidrolizar ordenadamente unidades de

maltosa. En la presente práctica se evidencia que el microorganismo más
efectivo es la cepa A1, se puede apreciar los datos obtenidos de las
siembras en las diferentes diluciones para la absorbancia.

PRACTICA 3- PRODUCCIÓN DE AMILASA POR LOS MICROBIOS DEL SUELO

Objetivo:

Examinar los microorganismos que se encuentran en la tierra en forma

natural, en busca de producción de amilasa.

FUNDAMENTACION TEORICA

El almidón está conformado por un polímero lineal de glucosa llamado

amilosa y por un polímero ramificado también de glucosa llamado
amilopectina, lo que hace que sea considerado como un polímero natural
con una alta riqueza calórica, la degradación del mismo en las moléculas
de glucosa que representan energía para las células se realza a partir de
enzimas extracelulares como la amilasa, la cual es segregada por una gran
variedad de microorganismos en ambientes naturales. Uno de los
objetivos de la biotecnología es encontrar microorganismos productores
de enzimas, que bajo condiciones óptimas produzcan enzimas a nivel
industrial.

MATERIALES

- Pipeta de 10 ml
- Pipeta de vidrio de 1 ml estéril
- 50 ml de agua destilada previamente esterilizada
- Un gramo de tierra seca recogida 1cm por debajo de la superficie,
de diferentes sitios o también diferentes alturas o de pueden tomar
muestras de diferentes tipos de suelo ( se debe colocar en bolsas
estériles y rotular) mínimo utilizar tres muestras
- Una solución de yodo
- Bastoncillos de algodón estéril
- Cajas de Petri estéril con 15 a 20 mm con nutriente de agar
preparado con 0.2 de almidón soluble
PROCEDIMIENTO

Se mezcla 1 gr de tierra seca recogida a 1 cm debajo de la superficie de

diferentes alturas o diferentes muestras de suelo y diluirlo en 15 ml de
agua esterilizada. Se procede a sembrar en una plaga de agar
nutriente/almidón y se extiende la muestra por toda la superficie de la
superficie, rotular la caja de Petri con el nombre del grupo y sitio de la
muestra.

Se incuba a 30°C por 48hrs. Pasado este tiempo se procede a contar las
colonias de cada uno de los sitios.

Con mucho cuidado se vierte la dilución de yodo sobre las placas de la

muestra hasta cubrir completamente la superficie del agar y se realiza el
recuento de las colonias que presenten halos de hidrólisis alrededor de la
misma, dicho recuento corresponderá a las colonias que cuentan con
actividad amilolíticas.

Cuestionario:

1- Explique cuál es el mecanismo bioquímico del rompimiento de los

enlaces glucocídicos /-1 -4 por parte de la amilasa.
R/ el glucógeno es un polímero grande y ramificado conformado por
moléculas de glucosa que se une a dos tipos de enlace que son a-1,4
y a-1,6. Los responsables de las ramificaciones son los enlaces a-1,6
los cuales se producen cada diez residuos aproximadamente
la degradación del glucógeno conocido como glucogenolisis da
lugar a la ruptura a la glucosa 1- fosfato quien puede ser convertida
a glucosa 6-fosfato que puede seguir distintos caminos metabólicos.
Para que ocurra este proceso se requieren de 4 enzimas como son
glucógeno fosforilasa, transferasa y a-16 glucosidasa (enzima
ramificante) y fosfoglucomutasa.
Glucosa fosforilasa: su función es la ruptura terminal del glucógeno.
Transferasa ya-1,6-glucosidasa (enzima ramificante): utilizada para
remodelar haciendo apto el glucógeno para su posterior
degradación.
 Fosfoglucomutasa: encargada de transformar el producto de
ruptura del glucógeno en forma apropiada para su posterior
metabolismo.

2- Investigue procedimientos biotecnológicos que se utilizan para la

producción de amilasa a nivel industrial.
Las enzimas son productos de la célula y por ello pueden obtenerse
a partir de tejido animal, tejido vegetal y por fermentación
utilizando microorganismos seleccionados.
A causa del empleo de las enzimas de origen microbiano la
utilización de las enzimas de origen vegetal y animal ha ido
decayendo.
Para la obtención de enzimas microbianas se realiza el siguiente
proceso.
Selección de microorganismo: generalmente se empieza por cultivo
en el cual se enriquece la cepa seleccionada el cual puede ser
adquirido mediante la firma American Tipe Culture collection
(ATCC).
Cultivo: la materia prima varía según la enzima que se desea
elaborar. Los orígenes pueden ser de materia azucarada (melaza,
jarabe de glucosa), materias proteicas (caseína, gelatina…),
componentes nitrogenados (nitratos, urea), sustancias
favorecedoras del crecimiento como extractos autorizados de
levadura, sales minerales con inclusión de elementos trazas.
Fuera de la composición del medio están los parámetros que deben
ser controlados como la temperatura, PH, aireación y velocidad de
agitación.
Para la fermentación se distinguen los cultivos con superficie de
medio líquido o semisólido para lo cual son usados sartenes o
tambores rotatorios y para cultivos en profundidad los cuales son
los más utilizados en la actualidad y se realizan mediante tanques
agitados de lecho fijo.
Luego de la incubación del proceso fermentativo se separa la
biomasa y los componentes sólidos mediante centrifugación, al
líquido sobrante se somete a purificación para posteriormente ser
 utilizado en enzimas de origen animal o vegetal. Para la purificación
y aislamiento de enzima microbiana se siguen los siguientes
procesos:
- Adsorción selectiva con hidróxidos de hierro o aluminio
coloidales
Es necesario tener en cuenta el PH ya que no todas las
proteínas se absorben en las mismas condiciones, después de
absorbida son lavadas con solución salina para después ser
fluido a ph diferentes mediante otra solución salina que puede
ser de fosfato.
- Por precipitación: al reducirse su solubilidad al punto de
precipitarse, las enzimas son fraccionadas, este proceso se
logra mediante a través de la adición de sales a cierto ph y
concentración ionica elevada a baja temperatura, la sal mas
usada es el sulfato de amonio por su bajo costo y su alta
solubilidad.
- Ultrafiltración por aspiración: a través de membranas de
porosidad fina como tamiz molecular, este proceso permite
separar enzimas sin cambio de fases ni altas temperaturas.

Mediante la combinación de estos procesos a base de

electroforesis de alta tensión, cataforesis y electrodiálisis se
logra la separación de las mezclas complejas de enzima.

3- Explique porque se propone la utilización de lugól o solución de

yodo para comprobar la acción amilolítica de microorganismos.

Solución.
El lugól tiene la capacidad de reconocer la presencia del almidón,
ya que este absorbe el yodo presentando una coloración azul
intensa. Para el reconocimiento de la presencia de almidón en el
caso que son se cuente con lugól se puede emplear medicamentos
que contengan yodo como en el caso del betadine.

PRACTICA 4- AISLAMIENTO DE ADN BACTERIANO

Objetivo: aislar los ácidos nucléicos de la bacteria Escheriquia Coli

FUNDAMENTACION TEORICA

Sin lugar a dudas con el descubrimiento de la doble estructura axial

del ácido "Desoxi-ribonucleico" (ADN) por Crick y Watson en 1953,
seguido por los procesos que permiten la inmovilización de las
enzimas, los primeros experimentos de ingeniería genética
realizados por Cohen y Boyer en 1973 y aplicación en 1975 de la
técnica del "hibridoma" para la producción de anticuerpos
"monoclonales", gracias a los trabajos de Milstein y Kohler. (1983).
Han constituido un avance sin precedentes en el desarrollo de la
Biotecnología. Estos importantes descubrimientos han dado lugar a
numerosos trabajos de mejoramiento genético tanto en plantas
como animales; el cultivo de tejidos vegetales y animales a partir de
células madre, y el importante acontecimiento de la aparición de la
oveja Dolli en el contexto científico, que dio un vuelco total al
concepto de Biotecnología.

MATERIALES

- Pipeta de 1 ml
- 3 ml de agua destilada
- 6 ml de etanol frio
- 0.5 ml de detergente domestico
- Lizozima en polvo
- Tubos de ensayo
- Baño María 60°C

PROCEDIMIENTO

Extracción de ADN bacteriano

Activación de bacteria:

De una caja Petri que contiene bacteria E. Coli se coge una colona de las
bacterias y se coloca en 25 ml de caldo nutritivo en un matraz, este
procedimiento es realizado en condiciones asépticas.
El matraz se tapa y se lleva a incubación por 18 hrs a 37°C , pasado este
tiempo se toman 5 ml del matraz y se coloca en un tubo de ensayo el cual
debe contener 10 mg de lizozima y posteriormente agitarlo por 2 min.

Después de agitado se incuba la muestra en baño María por 30 min a

37°C, luego se le añade a la suspensión bacteriana 5 ml de detergente y se
lleva a baño María a 60°C por 2 min y por último se enfría la mezcla con
agua fría.

Lentamente y con mucho cuidado se verte etanol frio sobre la superficie

de la mezcla de manera que forme una capa, los acidos nucléicos
precipitaran en la capa superior de etanol de la cual se extraerán
utilizando una pipeta. Se puede añadir gotas de azul de metileno con el fin
de teñir el ADN y volverlo más visible.

Para identificar el microorganismo se debe enviar este ADN a su

secuenciación, para este caso se trabajo bajo un supuesto ADN extraido
en el laboratorio y es enviado a GenBank.
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAG
E_TYPE=BlastHome

En el cual arroja como resultado que el organismo patógeno es

Escheriquia Coli.

Escheriquia Coli es un organismo procariota que se encuentra

generalmente en los intestinos del hombre y de los animales ayudando en
la absorción de los nutrientes fue descrita por el bacteriólogo Theodore
Von Escheriquia en 1885 y fue quien lo denomino Bacterium Coli.

Enfermedades que puede causar

Gastroenteritis: es una condición que se caracteriza por inflamación del

tracto gastrointestinal

Síntomas: diarrea, vomito, dolor de cabeza, dolor abdominal, escalofríos,

fiebre.

Esta enfermedad Suele aparecer a partir de la 12-24 horas de haber

estado en contacto con él.
Cistitis: es una inflamación crónica o aguda de la vejiga urinaria con
infección o sin ella, E. Coli es uno de los patógenos asociados a ella
además de Klebsiella y Proteus.

Síntomas: dolor en la vejiga, urgencia miccional diurna mayor 8 veces.

Esta enfermedad es de origen inmunológico y se manifiesta por la llegada

de un antígeno a la vejiga uniéndose a un anticuerpo, depositándose en la
pared vesical activando mastositos y eosinófilos los cuales liberan enzimas
e interleucinas desencadenando la inflamación.

Síndrome urémico hemolítico: es una enfermedad causada por E. Coli la

cual produce una toxina tipo Shiga o verotoxina causando trastornos
cuando una infección en el aparato digestivo produce sustancias toxicas.

Síntomas: diarrea con sangre, dolor, cólicos e hinchazón del estómago,

fiebre y vómitos.

Causas: la causa mas común es por la toxina que produce E. Coli llamada
Shiga la cual entra en el torrente sanguíneo causando daños a los vasos
sanguíneos. Otras causas son la presencia de otras infecciones ya sea por
bacterias neumocócicas, el virus de VIH o la influenza, el uso de
medicamentos para tratar el cáncer. Entre otras enfermedades.

CONCLUSIONES

En el presente trabajo se desarrollaron las prácticas virtuales mediante el

uso de herramientas creadas para este fin.

Mediante el instructivo se determina la producción de amilasas por los

microorganismos del suelo y aislamiento de ADN Bacteriano.

En la práctica número 2 que tiene que ver con la determinación de

producción de amilasas por los microorganismos del suelo consiste en
identificar los microorganismos aislados que son capaces de producir
enzimas amilolíticas.

Y en la práctica numero 3 que tiene que ver con las técnicas de

ingenierías genéticas, consiste en reconocer la importancia de las técnicas
de la ingeniería genética aplicadas al desarrollo Biotecnológico mediante
la extracción del ADN microbiano e identificación de microorganismos
mediante la utilización de las técnicas de ingeniería.

REFERENCIAS BIBLIORAFICAS

Ortiz, F. (2013) Laboratorio virtual de Biotecnología. Universidad Nacional

Abierta y a Distancia, recuperado de
http://stadium.unad.edu.co/ovas/10596_9964/index.html

Bello Gonzales a. (2009). PRODUCCION DE ENZIMAS EN LA INDUSTRIA LACTEA

(LACTASA Y RENINA). Recuperado de file:///C:/Users/Personal/AppData/Local/Temp/2009-
04P-08.pdf

Muñoz, M. Biotecnología. (2012). Buenos Aires, AR: Editorial de la Universidad

Nacional de Quilmes. (2a. Ed.) Capítulo III. Recuperado de https://elibro-
net.bibliotecavirtual.unad.edu.co/es/lc/unad/titulos/77596?as_all=Biotecnolog
%C3%ADa&as_all_op=unaccent__icontains&prev=as

Ostos Ortíz O. Rosas Arango S. González Devia J. (2018).Cielo. Aplicaciones biotecnológicas

de los microorganismos. http://www.scielo.org.co/pdf/nova/v17n31/1794-2470-nova-17-31-
129.pdf