Instituto Politécnico Nacional

Centro de Estudios Científicos y

Tecnológicos No.6
“Miguel Othón de Mendizábal”.

Carrera: Técnico en Ecología

Caracterización y Calidad del agua

UNIDAD 3. Características biológicas de las aguas naturales,

residuales y residuales tratadas.

PRÁCTICA No. 11

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

NATURALES, RESIDUALES Y RESIDUALES TRATADAS
(NMX-AA-042-SCFI-2005)
UNIDAD 3. Características biológicas de las aguas naturales, residuales y residuales tratadas.

PRÁCTICA No. 11

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS NATURALES, RESIDUALES Y RESIDUALES TRATADAS

(NMX-AA-042-SCFI-2005)

INTRODUCCIÓN

El agua que en su mayoría las comunidades utilizan como agua potable proviene de fuentes
superficiales como: ríos, corrientes y lagos. Estos tipos de fuentes naturales en particular las
corrientes y los ríos se contaminan con algunos desechos domésticos e industriales, llamadas
aguas residuales. Debido al crecimiento de las poblaciones los problemas de contaminación se han
incrementado notablemente, cada vez se requiere en mayor cantidad de agua potable y la usada
debe ser desechada, generalmente regresándola a los cuerpos receptores que a su vez son fuente
de suministro de otra comunidad. Se sabe que los microorganismos patógenos que llegan a los
depósitos de agua, proceden de aguas contaminadas con las excretas del hombre y animales, por
otra parte, ciertas especies de bacterias particularmente eschericha coli y varios microorganismos
similares denominados coliformes, estreptococo fecal y clostridium perfringens habitan
normalmente el intestino grueso de hombres y animales y en consecuencia siempre están en las
materias fecales. Por lo que la presencia de cualquiera de estas especies en una muestra de agua
es evidencia de contaminación fecal.
Los procedimientos bacteriológicos para el análisis de aguas potable y residual son:
a) Cuenta en placa para determinar el número de bacterias coliformes totales y fecales.
b) Pruebas para determinar la presencia de bacterias.
c) Técnicas de filtración por membrana.

OBJETIVO
Realizar correctamente y en base a la Norma NMX-AA-042-SCFI-2005 el procedimiento adecuado
para determinar la presencia de bacterias coliformes y fecales en las aguas.

EQUIPO, MATERIAL, REACTIVOS Y PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

• Medios de cultivo y soluciones
• Estufa de incubación
• Cuenta colonias
• Microscopio compuesto
• Autoclave
• Aza bacteriológica
• Frascos de dilución
• Tubos de ensaye con tapa
• Cajas petri
• Mechero Bunzen
• Gradillas
• Material común de laboratorio
• Agar eosina-azul de metileno
Diagramas de bloques

Preparar el agua de
Preparar el material y Esterilización seca y
Etapa 1 dilución y medio de
lavarlo húmeda
crecimiento

Autoclave (T° 121°C

Sea en estufa (T° 180° a durante 15 min) para
200°C) para material de medio de crecimiento y
cristaleria agua esteril para
disoluciones

Preparar el medio de
Preparar el área de Limpiar mesa de crecimiento calculando
Etapa 2
trabajo trabajo de acuerdo al No de
cajas

Hacer disoluciones con

el agua muestra Incubar cajas
problema

Observar las Calcular en No. de

caracterízticas coloniales colonias por conteo Morfología colonial G
Etapa 3
(forma de crecimiento, directio (menos de 100 RAM
bordes, superficie) col)

Selección de colonia y
Hacer un troris cubrir con cristal violeta agregar Lugol
dilución

observar al microscopio a
cubrir con alcohol cubrir con saframina dejar secar
Inmersión.
PROCEDIMIENTO
Para determinar la calidad de las aguas se aplican diferentes procedimientos que determinan el
Número Más Probable de Poblaciones Microbiológicas (NMP), que pueden ser coliformes fecales
(termotolerantes) y escherichia coli con las siguientes pruebas:

1. Coliformes Totales y Fecales

PRUEBA PRESUNTIVA

- Contar con 3 series de 3 ó 5 tubos de fermentación cada uno con caldo lactosa o caldo lauril
triptosa.

- Tomar la primera serie de tubos e inocular cada tubo con 10 ml de muestra o con 1 ml de la
primera dilución seleccionada (10-2).

- Tomar la segunda serie de tubos e incubar cada tubo con 1 ml de muestra directa o con 1 ml de
la segunda dilución inmediata utilizada en la primera serie (10-3).

- Tomar la tercera serie de tubos e incubar con 0.1 ml de muestra directa o con 1 ml de la tercera
dilución inmediata a la segunda (10-4).

- Agitar suavemente los tubos.

- Incubar a 35 ± 0.5 °C durante -24 hrs o ± 2 hrs. los tubos que presentanproducción de gas se
consideran positivos. Los tubos negativos se re-incuban 24 hrs más.

- Los tubos negativos a las 48 hrs de incubación se descargan reportándoseausencia de coliformes.

- Los tubos positivos a las 24 hrs y 48 hrs se toman para la prueba confirmativa.

PRUEBA CONFIRMATIVA

- resembrar los tubos de la prueba presuntiva en tubos de fermentación con

caldo lactosa bilis verde brillante EC.

- Incubar a 35 ± 0.5 °C durante 24 hrs, los tubos con caldo lactosa (BVB) y a 45.5 ± 0.5 °C durante
24 ± 2 hrs los tubos con caldo EC en baño maría.

- Los tubos con producción de gas se consideran positivos. Registrar el número de cada serie a las
24 hrs de incubación. Los tubos negativos de caldo lactosa verde bilis brillante se incuban 24 horas
más.

- Destacar los tubos negativos y registrar los positivos.

- Sumar por cada serie el total de tubos positivos de caldo lactosa bilis, verde brillante obtenidos
en la prueba confirmativa a las 24 y 48 horas y los tubos con caldo EC a las 24 horas.

- Obtener la combinación y busca el número más probable (NMP) en la tabla correspondiente.

NOTA: se hicieron diluciones decimales mayores de 0.1 ml el valor del NMP obtenido de la tabla se
multiplicará por el factor de corrección siguiente: dilución promedio.

10
NMP de la tabla X = NMP /10 ml
𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙

Tanto el material, los medios y el procedimiento deberá trabajar bajo condiciones de esterilidad
Tabla del (NMP).

2. Técnica de filtración por membrana (millipore)

- Se coloca la membrana en la unidad de filtración previamente esterilizada.

- Se hace pasar un volumen de agua con ayuda del vacío.

- Se retira el disco filtrante o membrana y se coloca sobre una almohadilla absorbente que
previamente se ha saturado con el medio de cultivo adecuado.

- Se acomodan en cajas petri de tamaño especial y se incuban 35 °C durante 20 hrs.

- Las colonias desarrolladas corresponden al volumen de muestra tomada para la determinación.

3. Cuenta Standard en placa.

- Este método es útil para determinar la eficiencia de los procesos de las

operaciones unitarias como: la prueba de eliminación de microorganismos

en la sedimentación, filtración y cloración. Las cuentas se deben hacer

antes y después del tratamiento específico y los resultados indicarán la

medida en que ha sido reducida la población microbiana.

- Se prepara el medio de cultivo específico para el desarrollo de las bacterias (selectivo) de

acuerdo con la cantidad indicada en el frasco y se esteriliza en una autoclave a 121°C durante 15
min a 15 lb/pg2

.- Hacer diluciones de la muestra: 1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10000. Añadir el medio de cultivo que ha
sido mantenido a temperatura de 42-45 °C y suficiente para formar una capa con altura
aproximada de 0.5 cm.

- Mezclar en forma circular para distribuir uniformemente la muestra del medio de cultivo.

- Dejar solidificar a temperatura ambiente e incubar durante 24 hrs a una temperatura de 35 ± 0.5
°C.
- Con ayuda de una cuenta colonias contar el número de colonias desarrolladas (cada una de las
colonias provienen de una célula).

- Relacionar el número de colonias con el número de células viables en el número de colonias por
1 ml de muestra.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

En base al método del NMP reportar:

36g- 1000 ml

X – 80 ml

= 2.9 g

• Presencia de microorganismos patógenos, así como el número de microorganismos/100 ml de

muestra; método de millipore.

Disolución A 27 = 27x103

Disolución D 12 = 12x104

Disolución E 8 = 8x105

• Número de bacterias/mililitro de muestra; método de la cuenta estándar en placa.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son los pasos para la preparación de un medio de cultivo?

-Preparación de material

-Preparación de área de trabajo

- Rehidratar 23 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar

agitando frecuentemente hasta el punto de ebullición durante 1 minuto para disolverlo por
completo. Esterilizar en autoclave a 121ºC (15 lbs de presión) durante 15 minutos.

-Verter en las cajas Petri el medio fundido y estéril en un ambiente aséptico

2. Defina: medio de cultivo, cultivo puro y cultivo mixto.

La población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando éste

contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro oaxénico, cuando
contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto.

3. ¿Qué se entiende por esterilización?

Se define como la destrucción completa de toda forma de vida microbiana incluyendo las esporas
bacterianas, y los priones siendo estas últimas las formas de vida con más alta resistencia a los
métodos de esterilización

4. ¿Cuáles son las condiciones de esterilización por calor húmedo, con qué equipo se efectúa, y
que tipo de material se esteriliza por este método?

Por coagulación de sus proteínas celulares. La esterilización por vapor a presión se lleva a cabo en
una autoclave. Estos equipos emplean vapor de agua saturado, a una presión de 15 libras lo que
permite que la cámara alcance una temperatura de 121ºC.

5. ¿Cuáles son las condiciones de esterilización por calor seco, qué tipo de material se esteriliza
por este método?

Para la esterilización de material de vidrio, instrumentos quirúrgicos, agujas de metal, materiales

no miscibles con el agua, etc. Consiste en colocar el material directamente al fuego hasta que éste
se ponga al rojo vivo. De esta forma se queman los contaminantes hasta reducirlos a cenizas.

BIBLIOGRAFIA

1. APHA-awwa-wsiwa Métodos Normalizados para el análisis de aguas

potables y residuales “Washinton D.C. 18 ° Edition.

2. M.A. Pelazar, R.A. Prid y E.C.S. Chan. Edit. Mac Graw Hill 1982.

3. Departamento de Sanidad del Estado de Nueva York “Manual de

Tratamiento de Aguas” Edit. LIMUSA 1995.