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Evaluación de la virulencia de dos aislamientos de Penicillium sp. en frutos de

naranja valencia Severidad y progreso de la enfermedad producida por dos
aislamientos de Penicillium spp. en frutos de naranja.
Valentina Romero Capera, Juan Carlos Samboníi Rengifo, Juan Pablo Galindo Góomez,
Linda Katerine Ortiz Guzmáan

4,0 /5,0
Por favor revisar Bibliografía científica. Incluir artículos científicos internacionales que
provengan de revistas indexadas.

Introducción
La naranja Valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck) se originó en China y es considerada
como cosecha tardía en el subtrópico. Esta variedad es una de las más dulces cultivadas en
las regiones citrícolas del mundo al igual que en Colombia, siendo las regiones
subtropicales las responsables de más del 85% de la producción mundial (DANE, 2016). Se
estima una producción nacional en cítricos del 47% (Noreña, 2020), con pérdidas en
postcosecha del 25% debido a infecciones producto de heridas superficiales infligidas
durante la cosecha y posterior colocnización por hongos causadas por la manipulación
causadas principalmente por hongos (Delgado et. al., 2018). Los hongos fitopatógenos que
afectan principalmente a los cítricos son Penicillium spp. representando el mayor limitante
la mayor parte de la decadencia de cítricos a nivel mundial (Cantillo et. al., 2018).

Una de las especies o de los más representativaos de este género es P. digitatum Sacc. el
cual es un hongo ascomiceto, con hifas cilíndricas y, conidióforos que forman ramas
irregulares tabicadas. Su forma de reproducción es mediante esporas asexuales o conidios
que se generan por escisión en cadenas de longitud variable (Lopez, 2013). Este hongo es
famoso por producir la llamada podredumbre verde, siendo responsable de hasta el 80 %
de las pérdidas durante poscosecha. La alta humedad relativa durante el almacenamiento
de los frutos favorece el desarrollo de este patógeno (Lopez, 2013). Los síntomas se
manifiestan inicialmente con una mancha circular acuosa y descolorida alrededor del punto
de infección, la cual a temperaturas favorables para el crecimiento del hongo (20-28 ºC) se
hace más grande y en el centro de la infección comienza aparecer un micelio de color
blanco (Lopez, 2013). Cuando el área del micelio crece comienzan a producirse esporas de
color verde-oliva. En este sentido, la progresión de la enfermedad lleva a la descomposición
interna del fruto el cual queda completamente cubierto de esporas en un plazo de entre 5 y
10 días (Lopez, 2013).
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Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente es de suma importancia entender,

evidenciar y evaluar los síntomas generados por patógenos del género Penicillium en frutos
de naranja (Citrus Xx sinensis), ya que este conocimiento es vital para la elaboración de
planes de manejo agronómico que busquen minimizar las pérdidas producidas por este
hongo en postcosecha.

Objetivos:

Objetivo general
Evaluar la virulencia de dos aislamientos de Penicillium sp. en frutos de naranja valencia.
los síntomas, signos y severidad de la enfermedad producida por dos inoculaciones de
diferentes aislamientos de Penicillium spp. en Naranja Valencia.

Objetivos específicos
● Aislar el patógeno Penicillium sp. a partir de frutos de naranja valencia con síntomas
de pudrición.
● Realizar una inoculación de los dos aislamientos de hongos pertenecientes al
género Penicillium en frutos de naranja.
● Evaluar el progreso de la enfermedad producida por los 2 aislamientos del del
género Penicillium sp. inoculados en el fruto de naranja.
● Realizar una consulta bibliográfica referente al género Penicillium y su virulencia en
frutos de naranja.
● Determinar cuál de los aislamientos de Penicillium sp. es más virulentos en los frutos
de naranja valencia. Evaluar la severidad de la enfermedad producida por los dos diferentes
aislamientos de Penicillium spp. inoculados en el fruto de naranja.
●
Hipótesis
El hongo proporcionado por la profesora Adriana Gonzáalez Almario causará una mayor
severidad y un mayor progreso de la enfermedad en los frutos de naranja que el hongo
aislado de un fruto de naranja el cual presentaba síntomas de la enfermedad comúnmente
llamada “Podredumbre verde”.

Metodología
La metodología a usar para el desarrollo del experimento por el cual compararemos la
severidad y el progreso de la enfermedad producida por dos diferentes aislamientos del
género Penicillium spp. en los frutos de naranja valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck)
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usando metodologías basadas en López (2013), Pelayo (2012), Gandarilla et. al. (2020),
Ballester (2008) y Vilanova et. al. (2014). El proyecto se llevará a cabo en el laboratorio 218
de Mmicrobiología de la Facultad de cCiencias Aagrarias edificio 500 de la Universidad
Nacional de Colombia. Esta será realizada siguiendo los siguientes puntos:

a. Observación de la presencia de enfermedades en los frutos de Citrus spp:

Se seleccionarán frutos cítiricos como mandarina (C. reticulata) y naranja (C. sinensis)
que presenten síntomas de pudrición y signos del patógeno. Inicialmente, para lograr
aislar al patógeno se trajeron 2 muestras de naranja (C. sinensis) y 1 de mandarina (C.
reticulata) con presencia de síntomas y signos del patógeno.

b. Obtención de patógenos a partir de síntomas y/ signos:

En los frutos elegidos se realizarán las inspecciones y descripción de los evaluaron
síntomas y signos con ayuda del estereoscopiocon el fin de determinar posibles
agentes causales, por lo cual se observaron en primera instancia en el estereoscopio.
Posteriormente se realizarán on montajes para observación al microscopio óptico
compuesto con solución de azul de lactofenol, por medio del método de impronta y
corte a mano alzada.

c. Aislamiento del patógeno a partir de material vegetal:

El aislamiento se realizaráó por medio del método directo, en el cual, con una aguja
micológica esterilizada desinfectada por medio del mechero, se tomará una muestra de
los signos del hongo que se presenten ende cada fruta y se depositará en el centro del
agar de PDA (Papa Dextrosa Agar) y . Dicho medio de cultivo se incubóará a 25°C
durante 8 días.

Por otro lado, se realizaráó un aislamiento indirecto del signo del hongo presente en la
muestra de naranja, en el cual se tomaron 5 explantes y se colocaron en un pedazo de
gasa formando una especie de bolsa, para luego ser esterilizados, sumergiendo dichos
explantes en soluciones de Etanol al 70% durante 30 segundos, Hipoclorito de sodio al
2% durante 30 segundos y por último con agua destilada, realizando tres lavados. Se
dejaron secar por 10 minutos en la cámara de extracción. Con ayuda del mechero se
procedió a esterilizar la aguja micológica con la cual se dispusieron cada uno de los
explantes en el medio de cultivo PDA. Dicho medio de cultivo se incubó a 25°C durante
8 días.

d. Identificación del patógeno:

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Después de incubar el patógeno aislado por medio de los dos métodos mencionados
anteriormente, se obtuvieron 2seleccionarán dos aislamientos que presenten las
características microscópicas especies depropias del género Penicillium spp, pero que
morfológicamente las cuales difieraen en sus características macroscópicas y en el
grado de asepsia del aislamiento, por lo que se decide trabajar con el aislamiento con
menor probabilidad de contaminación en el cultivo, para luego ser incubado en los
frutos de naranja. El patógeno resultante de la naranja es una colonia circular con
anillos concéntricos con aspecto aterciopelado - afelpado, un color blanco en la periferia
de la colonia y un color piel en el centro de ésta el cual según la escala Pantone
concordaba con la designación 7500 U.

Teniendo en cuenta que sólo se realizó un aislamiento de manera adecuada, la docente

Adriana Gonzalez Almario nos proporcionó un aislamiento del género Penicillium spp.
para realizar la comparación con el aislamiento seleccionado por el grupo de trabajo.

e. Obtención de Ccultivos puros de los aislamientos hongos de Penicillium spp.:

Se realizarán cultivos monospóricos, Ppara ello……la obtención del cultivo puro se
cortarán trozos cuadrados del medio del cultivo con micelio de cada uno de los hongos
de aproximadamente 1 cm2. Dicho cuadrado debe ser tomado de la parte del punto de
origen de la colonia con mayor frecuencia, para esto se debe esterilizar el bisturí. En un
tubo de ensayo con 10ml de agua esteril, se sumerge el trozo de micelio y esporas. Se
agita para que se desprendan las esporas. En una caja de petri con agua (AA)
depositar 10 𝛍l en 5 puntos distantes entre sí. Revisar bajo microscopio y ubicar una
espora que sea distante de las demás. Es importante marcar dicho sector. Incubar por
24 horas a 25°C. Por último, localizar la espora germinada y cortar dicha zona con
bisturí esteril. Se debe transferir este corte a un medio de cultivo nuevo e incubar a
25°C por 7 días (Ortiz et. al., 2011).

f. Pre-Ensayo:
Para verificar la susceptibilidad del fruto de naranja ante los patógenos aislados, se
realizará un pre-ensayo, en el cual los frutos de naranja se desinfectaran en una
solución de hipoclorito de sodio al 3% durante 3 minutos (Pelayo, 2012), luego se
colocaran en 3 minutos de agua destilada estéril y se secarán con toallas de papel
estériles, para luego proceder a inocular los frutos mediante el uso de un punzón
desinfectado de acero, para provocar cuatro heridas a lo largo del ecuador de la fruta
de aproximadamente 3 mm de profundidad (López, 2013). Los tratamientos se
definirán como , 1un fruto con inoculación del aislamiento 1 de Penicillium spp. (1) y
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otro1 con inoculación con el aislamiento 2 de Penicillium spp. (2);, fitopatógenos

previamente aislados y obtenidos en el laboratorio, además de otro1 fruto inoculado con
agua destilada estéril para usar como tratamiento control de la misma manera. En las
heridas se inocularáan 10 µ𝛍l de suspensión de conidios de los hongos, con una
concentración de 1 x 10^5 conidios/mL.

g. Inoculación en frutos sanos:

Se recolectarán 12 frutos de árboles de naranja valencia de una finca ubicada en la
vereda Consuelo, finca los Mangos, en Granada Meta, visiblemente sanos, sin heridas,
los cuales se desinfectaráan en una solución de hipoclorito de sodio al 3% durante 3
minutos (Pelayo, 2012), luego se colocaráan en 3 minutos de agua estéril y se secarán
con toallas de papel estériles, para luego proceder a inocular los frutos mediante el uso
de un punzón desinfectado de acero, para provocar cuatro heridas a lo largo del
ecuador de la fruta de aproximadamente 3 mm de profundidad (López, 2013), 4cuatro
frutos con inoculación de Penicillium spp. (1) y otros 4cuatro con inoculación de
Penicillium spp. (2), fitopatógenos previamente aislados y obtenidos en el laboratorio,
además de 4 cuatro frutos con agua estéril para usar como tratamiento control. En las
heridas se inocularan 10 µ𝛍l de suspensión de conidios de los hongos, con una
concentración de 10^5 conidios/mL. Luego se guardarán en cajas de plástico en
condición de cámara húmeda, para mantener una HR (humedad relativa) > 95% y 20°C
por 7 días.

h. Diseño experimental:
Para el análisis de los datos, se tiene un diseño experimental completamente al azar
(DCA) en el cual dónde los tres tratamientos corresponderán son a la inoculación de
los 2 aislamientos de Penicillium spp (1) y (2). y a un tratamiento control con agua
destilada estéril., en los frutos aparentemente sanos de naranja valencia. El
experimento se realizará con dos réplicas de dos frutos cada una y con cuatro heridas
por fruto. Las unidades experimentales serán las frutas de naranja. Se realizará un
análisis de varianza ANOVA y pruebas de homogeneidad y normalidad para los datos,
para así aplicar la prueba de comparaciones múltiples de Ttukey con una significancia
p< 0,05 (Vilanova, 2014), para conocer si hay diferencias significativas en los
tratamientos usados. Los datos sSe analizarán conen el programa estadístico R.

Tratamiento Réplicas
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Penicillium spp. (1)

Penicillium spp. (2)

Agua estéril

i. Incidencia y severidad del patógeno:

Los datos de incidencia y severidad corresponden al valor medio de las dos réplicas
con dos frutos cada una, usando la ecuación de Incidencia de severidad de la
enfermedad:
ISE=(Σclase x Número de frutos/Total de los frutos x Número mayor de laclase) x 100

Se tomarán datos a los 4, 5, 6 y 7 días después de la inoculación (Ballester, 2008).

Se tomaráa como escala de severidad la propuesta por Lopez (2013), según área
afectada por el patógeno:

Imagen 1. Evolución de la infección en frutos cítricos inoculados con P. digitatum,

Tomado de López, 2013.
Las mediciones del área afectada se haránrealizarán con el programa Image J., con el
fin de medir el área afectada después de la inoculación del patógeno. (Cano et. al.,
2020)
Faltó incluir la medición del área bajo la curva del progreso de la enfermedad, cómo
calcularían el periodo de incubación y de latencia.

j. Aislamiento del hongo en frutos previamente inoculados:

Por último se realizará de nuevo el aislamiento de los hongos fitopatógenosdel
fitopatógenoen cada uno de los frutos vistos en los frutos de cada tratamiento para
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observar si son los mismos que se inocularon, por los medios antes descritos de
aislamiento directo e indirecto y cultivos puros por transferencia de hifas.

Cronograma

Discusión
Las especies reportadas, que pueden generar síntomas macroscópicos de pudrición con
tonos verdes y azules corresponden a P. digitatum y P. italicum respectivamente. El género
Penicillium está subdividido en grupos o subgéneros de acuerdo a la morfología de los
conidios aunque también se tiene en cuenta la velocidad de crecimiento (Carrillo, 2003).
Los conidios son esféricos o elipsoidales, unicelulares, hialinos que en masa se ven de color
verde, verde azulado, verde aceituna o gris. La pared de los conidios es lisa o rugosa según
las especies (Webster J. 1986). Según literatura y las características morfológicas
macroscópicas, el aislamiento que nos proporcionó la docente, corresponde a la especie
Penicillium digitatum (Lopez, 2013). Por otro lado, el aislamiento del hongo que realizó el
grupo de trabajo para el experimento corresponde a una especie perteneciente al género
Penicillium spp., sin embargo aún no es posible su identificación. Teniendo en cuenta lo
anteriormente mencionado, se podría esperar que el aislamiento que contiene la especie de
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Penicillium digitatum tenga una mayor severidad y un mayor progreso de la enfermedad

dado que esta especie tiene una cantidad mayor de reportes causando estos síntomas a
nivel nacional e internacional (Lopez, 2013).

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