PREPARACIÓN DE MEDIO PDA Y LA INOCULACIÓN DE LA MUESTRA DE
HONGOS
Resumen
Los hongos pueden crecer en ambientes húmedos y con suficientes nutrientes. En la
práctica de Microbiología, emplearemos agares con características adecuadas para el crecimiento de estos organismos, como el agar PDA. En esta práctica, se inocularon una serie de placas de Petri con medio PDA con hongos que crecieron en algunos alimentos o frutas. Posteriormente se observó el crecimiento de hongos sobre este medio, este lapso es más prolongado que el de las bacterias. Además, aprenderemos como se aplican las tinciones de lactofenol para poder observar la estructura de los hongos y sus esporas, esto con el fin de identificar el tipo de hongo y sus características morfológicas, en este caso en particular solo reconoceremos el tipo de hongo por sus características macroscópicas, motivo por el cual debemos esperar una semana para observar su crecimiento. Cabe señalar que los objetivos de la práctica es conocer las características macro morfológicas de colonias fúngicas de distintos tipos de hongos ya sea en: color, superficie, borde, consistencia, aspecto y desarrollo. Así mismo debemos atender las explicaciones y sugerencias de nuestro docente antes de realizar las prácticas de laboratorio de microbiología en nuestros domicilios en el aislamiento de hongos.
Introducción
El material biológico con el que se trabajará durante la práctica no representa un riesgo
potencial para el estudiante, ya que las especies de hongos que se cultivaran en las placas Petri son cepas no patógenas para seres humanos. Sin embargo, en futuras prácticas se aislarán hongos o microorganismos a partir de diferentes sitios (cuerpos de agua, ambiente, suelo, etc.), cuyos estilos de vida pueden ser diversos, por lo que se mantendrán estrictas normas de seguridad para evitar riesgos por ingesta, inhalación o contacto directo.
Los hongos no son plantas ni animales, aunque se parezcan en algunas de sus
características tanto a las unas como a los otros. A las plantas, por ser organismos sedentarios que se encuentran fijos a un sustrato y, mientras están vivos, no cesan de crecer. A los animales, pues, aunque las células de los hongos poseen pared como las de las plantas, las paredes celulares fúngicas son ricas en quitina, la misma sustancia que hace duro el esqueleto externo de los insectos. Los hongos se diferencian mucho de las plantas y de los animales, razón por la cual pertenecen a otro reino llamado Fungí. Han jugado y juegan un papel muy importante en distintas áreas, como la medicina, la industria y la alimentación. El medio de cultivo es una sustancia o solución que permite el desarrollo de microorganismos, mientras que el cultivo es el producto del crecimiento de un organismo. Los medios utilizados en micología deben contener los nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo y reproducción de los hongos (carbono, nitrógeno, vitaminas, oligoelementos, etc.) y un pH ligeramente ácido (6 – 6.3) para facilitar su crecimiento e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos.
En esta práctica analizaremos muestras de hongos procedentes de cualquiera de estos
alimentos, tales como la naranja, café o pan, el éxito de esta práctica está en la observación del detalle en la morfología de los tipos de hongos, en seguir en orden correcto del experimento, en el cuidado y manejo adecuado de cada material y reactivo.
MATERIALES • Medio de cultivo PDA (gelatina, papa, agua) • Pinzas. • Asas de siembra • Recipientes descartables (reemplazando placas Petri) METODOLOGIA PREPARACIÓN DE MEDIO PDA Se pelará una papa harinosa (tamaño aproximado: puño de mano) y se cortará en cuadritos pequeños para su fácil cocción. Colocarlas en una cacerola pequeña y agregar un vaso de agua, luego hervirlo durante 15 minutos, el termino de cocción lo indicará la turbidez del agua ya que significará la presencia de almidón. Al terminar la cocción se filtrará el líquido contenido de almidón, una vez obtenido esto se mezclará con 5 cucharadas de gelatina diluida en un vaso de agua caliente. Una vez terminada mezcla se distribuirá el medio PDA en envases descartables y estériles (Figura N° 1)
Figura N° 1: Distribución en Placas Petri de Vidrio
INOCULACIÓN DIRECTA - (FRUTA)
Con el asa de siembre en ángulo, coger una pequeña porción de la muestra de fruto u otro alimento (infectado con hongos) y sembrar por puntos, introduciendo suavemente la muestra en el agar papa, incubar a temperatura ambiente. RESULTADOS
Después de la inoculación procedimos a tapar la placa Petri, sellarla con cinta adhesiva y lo cubrimos con un plástico negro. Al pasar 6 días, observamos que el hongo ha crecido (Figura N° 2 y 3) donde se ve el hongo en el centro de color verde y con bordes blancos. Gracias al detalle Macroscópico podemos determinar que el hongo cultivado es un Penicillium digitatum. Este es un hongo mesófilo del género Penicillium que normalmente lo encontramos en el suelo de las zonas productoras de los cítricos. Es la mayor fuente de decaimiento de las frutas en épocas de post-cosecha y es el responsable de las enfermedades de los cítricos conocida como putrefacción verde. En la naturaleza, este hongo necrotrófico patógeno hiere a la superficie de los cítricos creciendo en forma de filamentos y se reproduce asexualmente a través de la producción de conidias.
Figura N°2: Observación de Hongos Cultivados
Figura N°3: Detalle del Penicillium Digitatum
DISCUSIÓN
En el aislamiento realizado se ha obtenido, Peniciliium digitatum, comúnmente
conocidos como moho verde, y este ha sido reportado como patógenos poscosecha de los cítricos (McGuire, 2000; Wild, 1994) y son responsables de pérdidas económicas en todo el mundo (Skouboe et al., 1999). La infección comienza con la penetración de las esporas en las heridas de los frutos en el árbol, durante la cosecha o el transporte (Spotts et al., 1998). Los síntomas aparecen como cambios en la coloración del fruto (Snowdon, 1990), debido al desarrollo del micelio sobre la superficie, seguida por la aparición de una masa de esporas de color verde-olivo (P. digitatum), como manifestación clara de una infección. La pudrición de los frutos por esta causa puede llegar al 40 % de la producción total, por lo que la detección oportuna reviste de importancia. Las condiciones climáticas y de cultivo (variedad en cultivares, aplicación de fertilizantes, tipo de suelo, entre otros) pueden determinar la susceptibilidad de los frutos a las enfermedades, maduración, manejo y almacenamiento (Plaza et al., 2003; Smilanick et al., 2003).
CONCLUSIONES
Los medios de cultivo pueden prepararse a partir de sus componentes o según las recomendaciones dadas en la práctica, cuando este se consigue comercialmente hay varias reglas que se deben guardar para asegurar la buena calidad del medio preparado.
El agua utilizada debe ser destilada o desmineralizada, proveniente de un sistema
adecuado de destilación, su medida debe ser exacta y en ningún momento con aproximaciones que generalmente se traducen en una alteración de la consistencia del medio, especialmente cuando se trata de agares.
Todos los medios de cultivo después de prepararlos y vertidos en la caja de Petri,
deben ser secados, con la finalidad de eliminar el exceso de agua. Para evitar la coalescencia y mezcla de las colonias cuando se hace la siembra.
Los hongos en una ambiente adecuado y con nutrientes necesarios se pueden
reproducir rápidamente.
También se deben sellar con cinta adhesiva para evitar contaminaciones externas. BIBLIOGRAFIA
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Figura N° 4 : Pelado de papa
Figura N° 5: Picado de la papa
Figura N° 6: Hacer hervir la papa picada
Figura N° 7: Preparación PDA con gelatina transparente
Figura N° 8: Distribución en Placas Petri de Vidrio
Figura N° 9: Esterilización del ASA con el mechero de alcohol
Figura N° 10: Raspado de hongo en la Fruta infectada
Figura N° 11: Inoculación de los hongos de fruta en PDA
Figura N° 12: Sellado de Placa Petri y cubierto con bolsa negra
Figura N°13: Detalle del Penicillium Digitatum a los 6 días.
