Aislamiento del agente causal de la mazorca negra Phytophthora palmivora en el

cultivo de cacao Theobroma cacao aplicando los postulados de Koch

TRABAJO PRESENTADO POR:

José Norvey Mateus García

Karen Dayana Mateus Rojas

María de los Ángeles Navarro Holguín

Nolberto Cañas Correa

PRESENTADO A:

Profesor Wilson Bohórquez Santana

FITOPATOLOGÍA

UNIVERSIDAD DE LA SALLE

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

PROGRAMA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

PROYECTO UTOPÍA

YOPAL/CASANARE

2017
Objetivos

Objetivo general

 Aislamiento del agente causal de la mazorca negra Phytophthora palmivora en el

cultivo de cacao (T. cacao) aplicando los postulados de koch.

Objetivos específicos

 Obtener en campo el posible agente (Phytophthora palmivora) causante de la

enfermedad mazorca negra en el cultivo de cacao de la Universidad de la Salle.
 Preparar el medio de cultivo para la siembra y aislamiento del Oomycete
Phytophthora palmivora.
 Sembrar el agente causal en medios de cultivos y purificarlo si es necesario.
 Seleccionar en campo las mazorcas a inocular.
 Aislar nuevamente en laboratorio el agente causal al dar fin con los postulados de
Koch.

Justificación

El objetivo de realizar el aislamiento por medio de los postulados de koch, es conocer

las características macro morfológicas, como: color, superficie, borde, consistencia,
aspecto y desarrollo del agente patógeno; así mismo conocer sus signos y síntomas
que genera en el hospedero; finalmente se corrobora si el agente causal de la
enfermedad seleccionada sea del patógeno identificado. Es importante conocer de
forma descriptiva la morfología, el mecanismo de acción y el ciclo de vida del agente
a la hora de implementar un control fitosanitario, para que este sea mucho más
eficiente y acorde a la estructura patogénica (Ponce, 2015). El patógeno seleccionado
para el aislamiento e identificación es Phytophthora palmivora, hongo oomycete
causante de la enfermedad mazorca negra en el cultivo de cacao. Esta enfermedad es
el causante del 10 al 20% de las perdidas en producción después de la moniliasis
 (Moniliophthora roreri), siendo la enfermedad más importante en un 80% de los
países productores de cacao (Barrera y Hurtado, 2016).

Materiales y método

1. Medio de cultivo

Para preparar el medio de cultivo agar-zanahoria, se procede a cortar y pesar 40 g de

zanahoria, licuar la zanahoria en 250 ml de agua destilada se filtra con un tamiz y clarificar,
luego el producto ya clarificado lo incorporo en un vaso de precipitados. Se utilizará un
Erlenmeyer de 1000 ml para pesar en una balanza analítica 8 gr de agar que se agregaran a
250 ml de agua destilada y se disolverá en una plancha disolvente a 60 °C por 38 minutos,
seguidamente se adicionaran los 250 ml de la solución del vaso de precipitados en los 250
ml de la solución de la mezcla en el Erlenmeyer y ponerla en la plancha disolvente a 60 °C,
mezclar la solución de 500 ml y someter a esterilización por autoclavado y servir 25 ml de la
solución por cada caja Petri. Procedimiento de Guest, D.etal. en 2004, y J. I. PÁEZ, 1993.

2. Aislamiento e inoculación del agente patógeno phytophthora palmivora

inicialmente se realizará en campo la selección del fruto que presente los síntomas
característicos de la enfermedad (inicia sobre la superficie de la mazorca con una mancha
descolorida, sobre la que posteriormente se desarrolla una lesión marrón o negra con límites
bien definidos. En mazorcas mayores a tres meses de edad, las infecciones inician
principalmente en la base o pedúnculo de la mazorca (Suárez & Hernández, 2010)). Se
cortará con tijera de poda punta delgada desinfectada con una solución de yodo al 5 % para
llevar a laboratorio en donde se realizara un lavado con agua destilada y seguidamente una
desinfección con alcohol etílico al 70 % durante un minuto, seguidamente se realizará un
secado con toallas de papel auto clavado para proceder a realizar cortes (de 1 cm
aproximadamente) con un bisturí en forma circular tomando parte del tejido afectado y sano
para colocar con pinzas 3 cortes en cada medio de cultivo, los cuales se someterán por
observación durante 5 a 10 días dependiendo de su crecimiento en el medio; teniendo ya el
patógeno que presenta los síntomas de la enfermedad (P. palmivora) aislado se procederá a
inocular los frutos que se seleccionaran en campo.

Al tener el cultivo puro se precede a realizar la inoculación en campo de la siguiente manera:

se toman los frutos seleccionados a los cuales se les hará un circulo con plastilina en donde
se le aplicará con una jeringa una gota de 0.1 ml de una suspensión de zoosporas (en
concentración de 1 x 106) en cada uno de los extremos de la mazorca, causando una herida
de 1mm para facilitar el ingreso del patógeno al huésped. La concentración de zoosporas se
obtendrá a partir del método Neubauer que se basa en aplicar unas gotas de agua sobre el
hongo presente en la caja Petri, rasparla suavemente y filtrarla finalmente a través de una
gasa estéril que permita el paso únicamente de las zoosporas, seguidamente agregar esta
solución en un volumen de agua conocido para obtener la solución madre, para proceder a
contar empleando el microscopio los conidios de cuatro cuadriculas de las esquinas y la del
centro para finalmente multiplicar por 50. 000 el número de conidios contadas y así obtener
la concentración. Para obtener la concentración del inoculo deseada se utilizará la siguiente
formula V1 x C1 = V2 x C2.

Seguidamente se cubrirá de nuevo reemplazando la bolsa a la cual se le agregaran 10 ml de

agua destilada con el fin de obtener una humedad relativa constante. Se realizará un ligero
corte en la bolsa por arriba del nivel del agua para evitar que se llene en caso de ingresar agua
por precipitación. La inoculación se realizará después de las tres de la tarde y evitar la
incidencia de luz directa en lo más posible sobre la aplicación, pasado tres días se retirará la
plastilina haciendo que vaya al fondo de la bolsa, la cual no se retirara durante el tiempo del
ensayo. Las lecciones se medirán en lo posible diariamente (Enríquez, G. & Soria, J. 1984)
durante 5 a 10 dias para la observacion de los sintomas y avance en el huesped (Pérez et al.,
2010), (Carranza Menéndez, 2015), (Galindo, J. 1986). Finalmente se espera a que se
presenten los sintomas nuevamente en el huesped seleccionado, para llevar, aislar y purificar
en laboratorio nuevamente.

La selección del huesped en campo para la inoculacion se realizara, seleccionando un clon

resistente a Moliophthora roreri con motivo de disminuir el riesgo de contaminacion por otro
agente causal como el nombrado ya que es uno de los mas limitantes en la produccion de
cacao colombiana y cubriendo totalmente con bolsas transparentes las mazorcas a inocular
para evitar la contaminacion cruzada del patogeno P. palmivora. En la linea productiva de
SAF se cuenta con dos clones resistentes a la M. roreri Caucacia 43 (CAU 43) y Imperial
Collage Selection 95 (ICS 95), se ubicaran los clones en un lugar alejado del foco de la
enfermedad, para ser inoculados haciendo al menos 3 repeticiones y un testigo para cada uno
de ellos (Botello, 2015).

Cronograma de actividades

Cronograma de actividades
Descripción Fecha
Cubrir las mazorcas seleccionadas para la inoculación con bolsa 25-09-2017
transparente
Identificación en campo de los clones a inocular 25-09-2017
Preparar el medio de cultivo. 27-09-2017
Observar y recolectar en campo la mazorca que presente la 28-09-2017
enfermedad, reflejando los síntomas causados por el agente según
describe literatura.
Aislar en un medio de cultivo el agente causal. 28-09-2017
Inoculación del agente causal a mazorcas sanas. 10-10-2017
Nuevamente preparación del medio de cultivo 20-10-2017
Aislar nuevamente en un cultivo puro. 21-10-2017
Observación del desarrollo de p. palmivora en el medio de cultivo Del 22 al 30 de
octubre de 2017

Bibliografías

 Barrera, J. L., & Hurtado, N. J. (2016). Enfermedades en el cultivo de cacao.

Revista el Agro.
 Botello, D. H. (2015). Caracterización de cultivares de cacao (Theobroma
cacao L) por su respuesta de defensa a Moniliophthora roreri y su
 polimorfismo de SSRs. Universidad Nacional de Colombia Facultad de
Ciencias Agrarias, 36.
 Carranza Menéndez, G. M. (2015). Identificación específica del agente causal
de la mazorca negra (Phytohthora spp.) en cacao en la zona central del litorial.
Universidad técnica estatal de Quevedo, 1-75.
 Castellanos, G., Jara, C. E., & Mosquera, G. (2011). Guías prácticas de
laboratorio para el manejo de patógenos del frijol.
 Enríquez, G. A., & Soria, J. A. (1984). Mejoramiento genético para resistencia
a cinco enfermedades del cacao. Serie 9. CATIE. Turrialba, Costa Rica, 5.
 Galindo, J. (1986). Efecto de poda sanitaria y prácticas culturales sobre el
combate de mazorca negra y moniliais del cacao. Memorias del Seminario
Taller de Fitopatología. Informe Técnico, (81).
 Guest, D., Drenth, A., Rusli, M. H., Seman, R. I. A., Martínez, L.,
GerardoGuest, D, & Aya, H. M. L. (2004). Diversity and management of
Phytophthora in Southeast Asia (No. L-0969). Bayer.
 J. I. PÁEZ, D. B. (1993). Identificación de Phytophthora palmivora Butler en
los jardines de la Exposición Universal de Sevilla (EXPO-92) . boletin de
sanidad vegetal de plagas, 3.
 Martínez, G., Sarria, G. A., Torres, G. A., Varón, F., Romero, H. M., & Sánz,
J. I. (2010). Avances en la investigación de Phytophthora palmivora, el agente
causal de la pudrición del cogollo de la palma de aceite en Colombia. Revista
Palmas, 31(1), 55-63.
 Pérez, M. I., Peñaranda, L. F., & Herazo, M. M. (2010). Impacto, manejo y
control de enfermedades causadas por Phytophthora palmivora en diferentes
cultivos. Universidad de Pamplona, ESP. 71 p.
 Ponce Domínguez, R. A. (2015). Manejo de enfermedades en el cultivo de
cacao (Theobroma cacao L.), considerando parámetros epidemiológicos que
permitan reducir el uso de fungicidas’ (Bachelor's thesis, Quevedo: UTEQ).
 Purwantara, A., McMahon, P., Susilo, A. W., Sukamto, S., Mulia, S., Nurlaila,
. . . Guest, D. (2015). Testing local cocoa selections in Sulawesi: (ii) resistance
 to stem canker and pod rot (black pod) caused by Phytophthora palmivora.
ELSEVIER, 2.

 Suárez, Y. J., & Hernández, F. A. (2010). MANEJO DE LAS

ENFERMEDADES DEL CACAO (Theobroma cacao L) EN COLOMBIA,
CON ÉNFASIS EN MONILIA (Moniliophthora roreri). Corpoica, 26-36.