PRODUCCION DE ENTOMOPATOGENOS Y CONTROL DE CALIDAD DE

ENTOMOPATOGENOS
1
Nelly Yazmin Agudelo Rozo -1611303; 2Dayron Eliecer Almeyda Pimienta-1611323;
3
Daniela Andrea Vargas Ortega-1611329

1
nellyyazminar@ufps.edu.co; 2daironeliecerap@ufps.edu.co;
3
danielaandreavo@ufps.edu.co

Universidad Francisco de Paula Santander, Facultad de Ciencias Agrarias y del

Ambiente, Ingeniería Biotecnológica, 06 de Mayo del 2019

RESUMEN

El reconocimiento de entomopatógenos nos ayuda a conocer su potencial hacia agentes de

control biológico y contribuyen a esclarecer las relaciones evolutivas con otros organismos.
La utilización de microorganismos benéficos como hongos o bacterias entomopatógenos,
involucran una serie de procesos para su producción masiva, desde la preparación de
materiales y medios de cultivo, así como técnicas de laboratorio que permitan analizar
algunos parámetros de calidad de inoculantes biológicos, de asepsia para evitar
contaminantes, cuyo objetivo principal es la obtención de material que, una vez aplicado en
campo, actúe directamente como el estado más infectivo del microorganismo o posibilite la
formación de ese estado en el campo. Es por esto que se debe conocer sus estructuras
microscópicas y macroscópicas, para después realizar un aislamiento y caracterización en
cultivo puro para llevar a cabo su producción masiva en el laboratorio.

Palabras clave: entomopatógenos, control biológico, técnicas, producción.

ABSTRACT

The recognition of entomopathogens helps us to know their potential towards biological

control agents and help to clarify the evolutionary relationships with other organisms. The
use of beneficial microorganisms such as fungi or entomopathogenic bacteria, involves a
series of processes for their mass production, from the preparation of materials and culture
media, as well as aseptic techniques to avoid contaminants, whose main objective is to
obtain material that, Once applied in the field, act directly as the most infective state of the
microorganism or enable the formation of that state in the field. This is why you must know
their microscopic and macroscopic structures, and then perform isolation and
characterization in pure culture to carry out their mass production in the laboratory.

Keywords: entomopathogens, biological control, techniques, production.

INTRODUCCIÓN

Existen organismos capaces de producir enfermedades de los insectos. Esto ha sido

aprovechado en el control de organismos plagas mediante microorganismos como
bacterias, hongos y nematodos, además de virus, a los cuales se les denomina entonces,
entomopatógenos (Patiño, Villamizar & Arizmendy (s.f)).

La utilización de microorganismos benéficos como hongos entomopatógenos, involucra

una serie de procesos para su producción masiva, desde la preparación del materiales y
medios de cultivo, así como técnicas de asepsia para evitar contaminantes, cuyo objetivo
principal es la obtención de material que, una vez aplicado en campo, actúe directamente
como el estado más infectivo del microorganismo o posibilite la formación de ese estado en
el campo (Gómez, Zapata, Torres & Tenorio (2014)).

En el desarrollo del control biológico, que para Tellez-Jurado et al. (2009) se define como
una práctica agrícola en constante crecimiento que busca la destrucción total o parcial de
patógenos e insectos plaga frecuentemente mediante el uso de sus enemigos naturales, los
hongos entomopatógenos según Samson et al. (1998), son los primeros agentes biológicos
en ser utilizados para el control de plagas, porque según Asaff et al. (2002), son capaces de
producir enfermedad y muerte de los insectos. Estos microorganismos infectan a los
artrópodos directamente, a través de la penetración de la cutícula y ejercen múltiples
mecanismos de acción, confiriéndoles una alta capacidad para evitar que el hospedero
desarrolle resistencia. Sin embargo, Meyling y Eilenberg (2007), afirman que para su
utilización como control biológico es necesario prácticas agrícolas en donde se manipule el
ambiente para beneficiar las poblaciones de entomopatógenos, donde el conocimiento de
los aspectos ecológicos del hongo son necesarios, tales como la humedad relativa,
temperatura, patogenicidad, virulencia y hospederos a los que infecta activamente. La
producción de hongos para el control de plagas implica una amplia investigación donde se
involucran disciplinas como la patología, ecología, genética y fisiología, además de
técnicas para la producción masiva, formulación y estrategias de aplicación. Butt et al.
(2001)

La identificación de entomopatógenos es relevante no sólo para conocer la identidad de

organismos con potencial hacia agentes de control biológico, sino también contribuir a
esclarecer las relaciones evolutivas con otros organismos. Una identificación precisa es
también importante para rastrear la dispersión post-liberación de agentes entomopatógenos
y en estudios de ecología de bioinsecticidas para el monitoreo de cepas específicas después
de haber sido liberadas (FINQUITO, 2013). También nos ayuda al reconocimiento en
laboratorio, conocer sus estructuras microscópicas y macroscópicas, para después realizar
un aislamiento y caracterización en cultivo puro para llevar a cabo su producción masiva en
el laboratorio. La calidad se define como un conjunto de propiedades y características de un
producto o servicio que lo hacen apto para satisfacer las necesidades para lo cual fue creado
(Patiño et al., s.f).

MATERIALES Y METODOS

Producción de Entomopatogenos
En esta primera parte se realizó la observación macroscópica de los cultivos
entomopatogenos, observando el crecimiento de las colonias tanto de hongos como
bacterias; y una observación microscópica mediante Tinción de Gram y Tinción de Esporas
para bacterias y Tinción Simple con Azul de Lactofenol para hongos.

Bacterias

Seguido de la observación macro y microscópica se realizaron diluciones seriadas de 10−1 a

10−7 a partir de la dilución 100 que contenía 90ml de solución salina y las colonias del
cultivo entomopatogeno (Bacillus thuringiensis), esto se hizo con el fin de saber la
concentración del inoculo a trabajar. Dicho inoculo se sembró en cajas de Petri con Agar
Nutritivo mediante la Técnica de Microgota por duplicado desde las diluciones de 10−5 a
10−7 (sembrando 50µl en cada caja).

Para la producción de Bacillus thuringiensis, se extrajeron 20ml de la solución madre (100 ¿

y se pasaron a un biorreactor ya listo para la producción de este entomopatogeno, el cual
contenía en su composición: (Melaza 2g/l, K2HPO4 0,2%, KH2PO4 0,7%, MgSO4.7H20
0,2% y Caseína Hidrolizada 0,05%) y se procede a incubar durante 24h.

Para la recolección del producto, al día siguiente de haberse inoculado el biorreactor se

agita el caldo para homogenizar las células y se toma una muestra de 30ml en un frasco
vacío y se refrigera para realizar el recuento obtenido y determinar su pureza.

Hongos

Seguido de la observación macro y microscópica se realizaron diluciones seriadas de 10−1 a

10−4 a partir de la dilución 100 que contenía 40ml de solución salina y las colonias del
cultivo entomopatogeno (Purpurecillium lilacinum); a partir de la dilución 100 se realiza
conteo en la cámara de Nuebauer para determinar la concentración del inoculo.

Para la producción de Purpurecillium lilacinum, se extrajeron 10ml de la solución madre (

100 ¿ y se pasaron a un frasco de vidrio ya listo para la producción de este entomopatogeno,
el cual contenía en su composición: (Arroz 100g, Agua 60ml y 5 gotas de Ácido Láctico) y
se procedió a incubar durante 7 días.

Control de calidad de Entomopatogenos

Bacterias

Para determinar la concentración del producto se tomó 1ml de la solución de Bacillus

thuringiensis del biorreactor y se realizaron diluciones seriadas hasta 10−6 . Se tomaron
diluciones de 10−3 a 10−6 y se sembró por Técnica de Microgota por duplicado sobre Agar
Nutritivo.

Se incubó por 24h y se reportó la formación de colonias como UFC/ml de producto. Para
la pureza, se observó sobre las cajas el crecimiento de otros microrganismo y se contaron,
(reporte como UFC/ml de producto)
Hongos

Para determinar la concentración del producto se pesaron 10gr del producto de

Purpurecillium lilacinum y se llevaron a un frasco con 90ml de solución salina y se
realizaron diluciones seriadas hasta 10−5 y se realiza conteo en la cámara de Nuebauer para
determinar la concentración del inoculo.

Para la pureza, se tomaron 100 µl de la dilución 10−1 y se sembraron (en superficie) en dos
Cajas de Petri con Agar PDA y se procedió a incubar de 3-5 días, para los resultados se
realizó recuento UFC/gr de producto.

En la prueba de viabilidad, se tomaron 100 µl de la dilución 10−1 y se sembraron (en

superficie) en dos Cajas de Petri con Agar PDA y se procedió a incubar durante 12 días.
Transcurrido los 12 días se realizó una tinción simple con Azul de Lactofenol, cortando el
agar donde hubo un mayor crecimiento (1 cm2 ¿ y se lleva al microscopio con un objetivo de
40x para observar el crecimiento de las partes reproductivas del hongo. Para los resultados
se realizó recuento de conidios germinados y conidios no germinados.

Por ultimo para la prueba de virulencia se hizo la recolección de 10 hormigas adultas y se

desinfectaron con NaCl por (3 minutos) y se enjuagan con agua destilada estéril. En cada
frasco de compota estéril, se colocó cada hormiga con un algodón humedecido con agua
azucarada. A partir de la primera dilución 10−1 se tomó 1ml y se inoculo cada hormiga para
un total de cinco de ellas. Las hormigas restantes se inocularon con 1ml de agua destilada
estéril como control. Se observaron diariamente y se anotó el comportamiento de cada una
de ellas, registrando el día en que van muriendo. Cada hormiga que murió fue llevada a
condiciones de cámara húmeda por 7 días para evaluar la micosis.
RESULTADOS

Producción de Entomopatogenos

Caracterización macroscópica y microscópica de Bacillus thuringiensis

Macroscópica.
- Color: Cremoso
- Forma: Irregular
- Elevación: Plana
- Borde: Ondulado
- Superficie: Lisa
- Detalle Óptico: Opaco

Microscópica.
- Gram positivos en cadena, diplobacilos y solos
- Forma: Bacilos
- Ordenamiento: Solos, diplos o cadenas.
- - Frotis: Húmedo
- Tinción: Gram
- Objetivo: 40x

Caracterización macroscópica y microscópica de Purpurecillium lilacinum

Macroscópica.
- Color: Rosado.
- Textura: Aterciopelado
- Reverso: Veishe-Cremoso
 CONIDIOS

CONIDIOFORO

HIFAS

Concentración del Inoculo - Bacillus thuringiensis

16 colonias
25 colonias
41 colonias en total
= 20,5* 20(factor de dilución) * 104
2
= 4,1 * 106 UFC/ml

4 colonias
3 colonias
7 colonias en total
= 3,5* 20(factor de dilución) * 105
2
= 7 * 106 UFC/ml
 10−6 : 0 colonias; ˂ 106 UFC/ml CE

10−7 : 0 colonias; ˂ 107 UFC/ml CE

Concentración del Inoculo - Purpurecillium lilacinum

C1= 51 conidios
C2= 42 conidios
C3= 42 conidios 204 conidios
C4= 36 conidios
C5= 33 conidios

C=N*K*D
N= Cantidad de conidios contados en los 5 cuadrantes
K= Constante de la cámara (5 *104 )

D= Inverso de la dilución- Dilución trabajada: 10−2

C= 204 conidios * (5 *104 ) * (102)

C= 1020 * 106 conidios/ml

Producción de Purpurecillium lilacinum

CRECIMIENTO DEL HONGO

ENTOMOPATOGENO EN EL
MEDIO DE CULTIVO PARA
LA PRODUCCION DE ESTE.

Control de calidad de Entomopatogenos

Concentración del Producto y evaluación de Pureza - Bacillus thuringiensis

0 colonias
1 colonia
1* 20(factor de dilución) * 106

= 20 *106 UFC/ml

10−5 : 0 colonias; ˂ 105 UFC/ml CE

 0 colonias
1 colonia
1* 20(factor de dilución) * 104

= 20 *104 UFC/ml

5 colonias
4 colonias
9 colonias en total
= 4,5* 20(factor de dilución) * 103
2
= 90 * 103 UFC/ml

Concentración del Producto, evaluación de Pureza, viabilidad y virulencia -

Purpurecillium lilacinum
- Concentración
C1= 30 conidios
C2= 46 conidios
C3= 77 conidios 273 conidios

C4= 68 conidios
C5= 52 conidios
C=N*K*D
N= Cantidad de conidios contados en los 5 cuadrantes
K= Constante de la cámara (5 *104 )

D= Inverso de la dilución- Dilución trabajada: 10−3

C= 273 conidios * (5 *104 ) * (103)

C= 1365 * 107 conidios/mg

- Pureza

No se presentó crecimiento de
otro hongo, se observa el
micelio de color rosado,
característico de
Purpurecillium lilacinum

CONIDIOFORO
S

HIFAS CONIDIOS

- Viabilidad

NO SE LOGRO REALIZAR
CONTEO DE CONIDIOS
GERMINADOS Y NO
GERMINADOS, YA QUE EL
HONGO ESTABA MUY
ESPORULADO
 - Virulencia
N° de días Inoculadas Control
1 Vivas Vivas
2 Vivas Vivas
3 Vivas Vivas
4 Vivas Vivas
5 Vivas Vivas
6 Vivas Vivas
7 Vivas Vivas

DISCUSIONES
CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA

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