Clase 1, 17 de agosto de 2021
Cromatografía líquida
Una muestra se encuentra un analito y la matriz.
Ejemplo: en un medicamento el analito es el
principio activo (puede ser más de uno), mientras
que la matriz corresponde a sus excipientes.
Hay que recordar que no todos los procesos
cromatográficos son coloreados. Por lo tanto, en
compuestos incoloros y que emitan en
determinada longitud de onda, se puede hacer
uso de un revelado UV, por ejemplo.
Reactivo cromogénico: este reacciona con el
analito en cuestión para formar un complejo
coloreado. Sirve para hacer un proceso de
revelado.
Esta se compone de:
Fase móvil: la muestra que puede ser un líquido, un
gas o un fluido súper crítico, se desplaza en esta
fase.
Fluido super critico: es un gas que está bajo
condiciones extremas que generan que tenga un
comportamiento como si fuese un líquido.
Fase estacionaria: la fase móvil pasa a través de
esta con la que es inmiscible. Esta se fija a una
columna o soporte sólido.
Inmiscible: que no puede ser mezclado
Cuando la fase móvil interactúa con la fase
estacionaría se conocerá el concepto de
afinidad, aplicable a la interacción de la mezcla
de analitos con la fase móvil. En las mezclas de
analitos puede haber unos más o menos afines
con la fase móvil.
Por lo tanto, la sustancia de interés se adhiere a la
fase estacionaria y se mueve con la fase móvil,
viajando a una distancia que es inversamente
proporcional a la afinidad por la fase estacionaria.
Lo anterior depende igualmente del tipo de
cromatografía, con excepción de la
cromatografía gaseosa, donde la interacción se
da principalmente con la fase estacionaria
debido a que la fase móvil es un gas inerte.
En este proceso hay un tiempo y una distancia
recorrida.
Cromatografía preparativa
Se utiliza con fines cualitativos, preparativos o de
limpieza.
Cromatografía en papel
Sirve para realizar análisis cualitativos, es decir
identificación de analitos. Por lo tanto, no se
pueden indicar concentraciones (análisis
cuantitativos).
El disolvente empleado como fase móvil se hace
ascender por capilaridad. La capilaridad es una
propiedad de los líquidos que le confiere la
capacidad de fluir de forma ascendente por la
fase estacionaría (sustrato sólido) en este caso.
Si el solvente y el papel filtro elegido fueron
adecuados a la naturaleza del analito y estos
tienen color propio se verán las manchas de
distinto color separadas.
Generalmente es mejor realizar el proceso
cromatográfico en una fase estacionaria con más
gramaje, siendo de esta forma más lento el
proceso.
Cromatografía en capa fina
Se da de forma ascendente.
Es un procedimiento que se utiliza para separar
moléculas relativamente pequeñas.
La fase estacionaria puede ser: papel, de celulosa
o de un gel de silicato (vidrio molido bien fino)
unido a una superficie sólida (una placa de
aluminio, vidrio, plástico o papel).
Cromatografía en columna
Se da de forma descendente.
Técnica utilizada principalmente para la limpieza
o depuración de la muestra por separación de los
componentes de la mezcla.
La muestra se aplica en la parte superior y se eluye
con los solventes (fase móvil) agregados por
gravedad o forzados por presión externa.
Las muestras se recolectan en fracciones en
donde se deja un recipiente bajo el equipo para
recibir las gotas de la muestra, en estas fracciones
se encuentra la muestra separada y gracias a
otros análisis se puede ver cuáles son los
componentes que las conforman.

Se puede realizar en una pipeta pasteur dejando

algodón o lana de vidrio en el interior. En el caso
del algodón se debe tener cuidado con la
naturaleza de este (hidrofóbico o hidrofílico).

Las fases estacionarias más comunes son sílica gel

(SiO2) y alúmina (Al2O3).

Los tipos de fases vendidas son por ejemplo “Sílica

gel 60” o “Sílica gel 230-400”. Para el ultimo tipo se
requiere forzar con presión para que descienda el
solvente.

El valor se refiere al número de agujeros por unidad

de área (Mersh) que tiene el filtro. Entonces
mientras más grande es el valor las partículas que
pasan a través de él tendrán un tamaño menor.

La alúmina se vende en tres formas: ácida, neutra

y básica. De esta forma al haber una modificación
del pH, puede haber un cambio en la polaridad.
Clase 2, 23 de agosto de 2021

Cromatografía Gaseosa
La cromatografía gaseosa puede ser usada como Gas detector: la presencia de este en la
método de identificación y cuantificación. cromatografía depende del tipo de detector
implicado. Al igual que el gas portador, este tiene
Esta técnica puede ser utilizada para compuestos
un control de flujo.
con apreciable grado de volatilidad (bajo 350 a
400°C). Por lo tanto, son compuestos con un peso
moléculas bajo.

El compuesto a analizar debe ser rápidamente

volatilizado y no transformado durante su análisis
(esto no es función de los puntos de ebullición, sino
que también del tamaño de la molécula y la
polaridad).

Algunos compuestos de origen farmacéutico son
térmicamente sensibles y se degradan con la
temperatura.
Tipos de cromatografía gaseosa
Gas – sólido
Gas – líquido (más utilizada): se basa en la
distribución del analito entre una fase móvil
gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la
superficie de un sólido inerte.
El líquido es altamente viscoso casi como un sólido.
Recordatorio
La fase estacionaria permite que los analitos
presentes en la fase móvil, pueda interaccionar
con esta.
A mayor interacción más tardan en salir y
viceversa. Lo anterior se ve descrito por el tiempo
de retención (TR).
El tiempo de retención se define como el tiempo
transcurrido entre la inyección de la muestra y la
aparición de la respuesta máxima.
Equipo (cromatógrafo de gases)
Gas portador: este tiene un control de flujo.
Inyector: es donde entra la muestra y se mezcla
con el gas portador.
Columna cromatográfica: se encuentra en un
horno.
Horno: provee temperatura para favorecer la
volatilidad de los compuestos.
Micro – jeringa: tienen la capacidad de transferir
volúmenes muy pequeños, por ejemplo,10 µm. El
volumen de esta depende de si se inyecta gas o
líquido.
Gas portador (fase móvil)
El gas potador cumple dos propósitos:
• Transportar los componentes de la muestra.
• Crea una matriz adecuada para el detector.
La matriz adecuada se crea cuando el detector y
el gas portador no interactúan, por lo tanto, este
gas debe cumplir con ciertas condiciones:
• Debe ser inerte para evitar interacciones
(tanto con la muestra como con la fase
estacionaria).
Un gas que es poco probable que sea utilizado
es el oxígeno diatómico, pues es un gas
oxidante, que puede comenzar a oxidar la
fase estacionaria.
• Debe ser capaz de minimizar la difusión
gaseosa, es decir que debe empujar los
analitos de forma uniforme a través de la
columna.
• Debe ser fácilmente disponible y puro.
• Debe ser adecuado al detector a utilizar.
Tipos de gases empleados: Helio, Argón,
Nitrógeno, metano, dióxido de carbono, entre
otros.
En estos se encuentran gases nobles, los cuales no
tienden a reaccionar con otros compuestos, son
inertes.

Detector: no es único, hay distintos tipos.


Regulador
En el cilindro de gas se encuentra un regulador
llamado manómetro que es capaz de medir la
presión dentro del cilindro.
A temperaturas altas la septa elimina ciertos
componentes de su estructura que pueden
volverse volátiles y pasar como analito a la
columna cromatográfica. Esto se puede evitar en
cierto grado gracias a la purga de la septa.

Normalmente el color del cilindro debe ser alusivo
a su contenido (gas implicado).
Generalmente la regulación de la presión de hace
a dos niveles:
Regulador de baja presión: indica el flujo de salida,
que normalmente es bajo.
En el interior de la jeringa el analito puede venir en
forma gaseosa o compuestos disueltos en algún
disolvente.
El disolvente nunca puede ser agua, sino metanol
(a pesar de que es muy polar), acetona, hexano,
cloroformo, entre otros. Los mejores solventes son
los apolares.

Regulador de alta presión: indica la cantidad de La cantidad que se suele ingresar al sistema es 1
gas presente en el cilindro. µm, es en la cámara de vaporización donde los
compuestos se transforman en gases, de tal forma
Puede haber un tercer un regulador con igual o
que cuando los compuestos pasan a la columna
menor escala que el regulador de baja presión el
ya sean gases.
cual regulará el gas que entra al equipo, y un
cuarto regulador (en el interior del equipo) el cual
regula el flujo real de gas que entra al equipo. Split y splitless
A veces pasa que la cantidad de muestra suele
Las presiones de entrada varían entre 10 y 25 psi
ser elevada para la sensibilidad del detector, por
(25 a 150 mL/min en columnas de relleno y de 1 a
ello hay 2 modalidades de inyección:
25 mL/min en columnas capilares).
Split vent Open: esta permite que de todas las
El gas contenido en el cilindro y su grado de
moléculas que ingresan a la en la cámara de
pureza (se ve reflejado en el porcentaje), afectan
vaporización, solo algunas ingresen a la columna
significativamente el precio de este.
y otras salgan por la válvula de Split, esto depende
de la concentración de la muestra.
Inyector
En este compartimento la muestra es volatilizada
debido a la alta temperatura a la cual se
encuentra el inyector.

Por lo tanto, el cromatógrafo de gases no sólo

analiza gases desde su origen sino también
compuestos que sean altamente volatilizables.

En la cámara de vaporización la micro – jeringa

traspasa una septa, esta sirve para aislar el sistema
permitiendo que solamente entre la jeringa Splitles: no hay Split.
además posee un punto que sirve de guía para la
aguja. Estas son fungibles, es decir que se consume
con el uso.
¿Por qué se utiliza tan poco volumen de líquido en
la cromatografía de gas?

Porque al momento de evaporar este se multiplica

muchas veces su volumen al estado gaseoso, por
ejemplo, un microlitro de líquido se transforma 500
microlitros de vapor.
Clase 3, 24 de agosto de 2021

Cromatografía Gaseosa
Para poder realizar el proceso cromatográfico se
requiere programar el horno para calentar la
columna.
Si el horno está frío se espera que en los primeros
metros de columna los compuestos se vuelvan a
condensar al tener menor temperatura que el
inyector, por lo tanto, la temperatura del horno
mantiene la volatilidad de los compuestos.
Normalmente recibe los compuestos volatilizados
con una temperatura media de
aproximadamente 40°C, esta temperatura se
puede incrementar con la finalidad de que los
compuestos que son más volatines pasen más
rápido.
Por lo tanto, la separación ocurre por afinidad
(interacción), peso molecular y punto de
ebullición.
temperatura los componentes que vienen de la
cámara de volatilización se pueden condensar.
Por otro lado, el tener una temperatura definida y
no sujeta a variabilidad como lo es la
“temperatura ambiente”, contribuye a que la
cromatografía sea reproducible.
En general los programas de temperatura son
diversos y se pueden construir en base a las dos
herramientas mencionadas anteriormente, por
ejemplo, un constituido por sólo una rampa de
temperatura.
El programa de temperatura puede ser
extrapolado al cromatograma para identificar la
separación de los componentes durante la
cromatografía, en función de los cambios de
temperatura, de esta forma se pueden hacer
modificaciones para obtener mejores resultados.

Programa de temperatura
Tipos de columnas
Empacadas

Este tipo de columnas resulta ser similar a la

Hay dos herramientas que se ocupan en el
programa de temperatura:
Isoterma: representa una temperatura constante,
siendo la longitud del vector el tiempo en que esta
se mantiene.
Rampa de temperatura: es una pendiente positiva
que indica un aumento gradual de la temperatura
en función del tiempo (°C/m).
cromatografía preparativa en columna, en la cual
se rellenaba con algún tipo de fase estacionaria.
Lo anterior era un problema debido a que al tener
un diámetro mayor la columna empacada era
poco selectiva, se producían grietas en la fase y se
veía afectada la difusión debido a que ciertos
componentes tendían a juntarse a pesar de su
volatilización, por lo tanto, no había una
separación efectiva.
Capilares
Se fabrican a partir de sílice especialmente pura,
recubiertas con una capa de poliamida para
darle flexibilidad y enrollarse con un diámetro de
unos pocos centímetros.

No hay un programa de temperatura que sea

exclusivo y que separe todos los componentes de
la mezcla, sino que se va probando en base a
información de investigaciones anteriores.

Tipos de control de temperatura

Cuando se realiza un programa de temperatura
por lo general se comienza con un isoterma de 35
o 40°C, esto debido a que bajo de esta
Las columnas de pared recubierta (WCOT, Wall
Coated Open Tubular). Son tubos capilares donde
la pared interna se ha recubierto con una finísima
capa de fase estacionaria. Las columnas WCOT se
fabrican a partir de sílice fundida, conocidas
como columnas tubulares abiertas de sílice
fundida o FSOT.
Las columnas de soporte recubierto (SCOT, Suport
Coated Open Tubular) tienen en su parte interna
una fina capa de material adsorbente como el
empleado en las columnas de relleno (tierra de
diatomeas) donde se ha adherido la fase
estacionaria.
Las columnas PLOT (tubular abierta de capa
porosa) se usan para la separación de solutos muy
volátiles (principalmente gases) sin necesidad de
un enfriamiento criogénico o por debajo de la
temperatura ambiente del horno.
La cantidad de columna capilar contenida en
una columna cromatográfica puede llegar a ser
100 metros, depende de la aplicación que se le dé
va a ir cambiando la longitud de esta.
En la columna capilar es donde ocurre la
separación de los componentes de una muestra
para su posterior identificación por separado.
Los compuestos son separados de acuerdo con su
volatilidad y su interacción con la fase
estacionaría.
Son tres capas: poliamida, sílice fundida (sólida) y
la fase estacionaria (variable).
Las columnas FSOT (columnas tubulares abiertas
de sílice fundida) tienen diámetros internos
variables, entre 250 y 320 um para columnas
normales y 150 – 200 um para columnas de alta
resolución.
Estas últimas requieren menor cantidad de analito
y un detector más sensible, al eluir menor cantidad
de gas.
En estas columnas existe un problema debido a la
absorción del analito sobre la superficie de la sílice
fundida, adsorción debida a la presencia de
grupos silanol (Si-OH), los cuales interaccionan
fuertemente con moléculas polares orgánicas. Lo
anterior ocurría antiguamente debido a que la
tecnología no permitía cubrir completamente el
interior con la fase estacionaria dando paso a
interacciones irreversibles con la sílice fundida.
Este inconveniente se solucionó con química
Orgánica donde se utilizó la inactivación de la
sílice fundido por siliración por dimetilclorosilano,
después con un reactivo de griner se creó la
estructura que se observa, esto se conoce como
polidimetilciclohexano.
A pesar de lo anterior, ocurre un efecto memoria
que es donde compuestos quedan retenidos
generando errores cromatografía.
Todas las columnas tienen en la parte exterior una
placa metálica, esto dice el diámetro externo
interno, el relleno, temperatura máxima
programable (TMP) y temperatura isoterma
(menor a la TMP).
La fase estacionaria
Las características que debe tener esta fase
estacionaria líquido inmovilizada son:
• Debe tener características de reparto y factor
de selectividad de acuerdo con el analito. El
coeficiente de reparto tiene que ver con
cuánto está en la superficie y cuánto sigue su
recorrido, en cambio, factor de selectividad es
que tan selectiva es la fase estacionaria para
poder interactuar con los analitos de mejor o
menor forma.
• Debe tener una baja volatilidad (mayor que la
máxima temperatura alcanzada en el horno),
es necesario para que no se volatilicé la fase
estacionaria en el horno, así evitando que la
columna sea desechable, aunque sí existe
sangramiento de esta.
• Baja reactividad, es importante que no
interaccione permanentemente con los
analitos.
• Estabilidad térmica, esto evita la
descomposición o sangrado durante la
elusión.
Algunas de las fases estacionarias utilizadas
actualmente:

Ejemplos de fases estacionarias:
La primera representa una fase estacionaria
extremista mientras que la segunda es una
combinación de dos fases estacionarias, la
ventaja de esta última es que permite separar
compuestos apolares y relativamente polares, por
lo que otorga más diversidad.
Detector
Los detectores son los encargados de detectar la
presencia del analito en la medida que va
eluyendo desde la columna hacia este. Hay varios
tipos de detectores.
Eluir: los componentes de la mezcla, fijados en una
columna que contiene la fase estacionaria, se
separan por el paso de un eluyente de tal forma
que estos salen.
Características:
• Debe ser sensible es decir que pueda
determinar con precisión cuándo sale el
analito y cuando sale solamente el gas
portador.
• Debe tener respuesta lineal al analito con un
rango amplio de órdenes de magnitud, es
decir que aumenta en forma proporcional la
respuesta.
• Tiempo de respuesta a corto, no debe tardar
en identificar cada compuesto.
• Intervalo de temperatura de trabajo, ésta
debe ser amplia, no todos trabajan con
temperatura.
• Debe ser estable y reproducible, es decir las
mediciones no deben ir fluctuando entre dos
usos.
• Debe ser fiable de manejo sencillo.
• Debe poseer respuesta semejante para todos
los analitos.
• Debe poseer respuesta selectiva y altamente
predecible, es decir que haya una
selectividad en el detector para ciertos
compuestos.
• Existen detectores destructivos y no
destructivos (TCD, detector infrarrojo IR, ECD,
PID).
Tipos de detectores
• Detector de ionización de llama (FID, Flame
Ionization detector).
• Detector de conductividad térmica (TCD,
Thermical Conductivity Detector)
• Detector termoiónico (TID, Thermolic Detector)
• Detector de captura de electrones (ECD,
Electron – Capture Detector)
• Detector de emisión atómica (AED, Atomic
Emisión Detector)
• Detector fotométrico de llama (PFD),
empleado en compuestos como pesticidas e
hidrocarburos que contengan fosforo o azufre.
• Detector de fotoionización (PID)
• Detector de masas (MS, Mass Spectromer
Detector)
El más versátil es el detector de masas.
Gas makeup o gas auxiliar
El gas auxiliar es el gas que ayuda a reducir el
volumen muerto que se genera entre la parte final
de la columna y el director, el gas a usar depende
del detector.
En palabras más simples este gas transporta los
analitos desde el volumen pequeño al punto de
detección, para que esto se produzca
eficazmente.
Otro factor importante es que el gas debe ser
inerte, con el propósito de que no reaccione con
el detector.
Detector de ionización de llama FID
Es un detector destructivo.
Este tiene un gas auxiliar qué es nitrógeno, además
en la columna posee un gas transportador (ej.
Helio), además hay otros 2 gases los cuales son
hidrógeno y oxígeno que ayuda a la combustión
del hidrógeno, de esta forma se genera una
especie de llama y cuando llegan los compuestos
de las columnas al detector el gas auxiliar los
ayuda a llegar a la llama. En este caso el nitrógeno
es un gas incombustible que no reacciona con la Detecta moléculas orgánicas que en su estructura
llama. posea nitrógeno o fósforo, su principio es muy
similar detector FID, en este caso la llama calienta
En el detector FID los compuestos son pirolizados
una especie de piedra, este genera una
generando electrones en forma de nube, esto
propiedad electrónica que se altera a medida
genera una corriente que es amplificada para ser
que la llama cambia, gracias a esto se genera una
detectada. La ionización es proporcional a la
señal química.
cantidad de estructuras que se analizan, en
donde son fundamentales los enlaces carbono e
hidrógeno.

Las temperaturas de trabajo van entre 275 a

325°C, y las cantidades detectables van entre 0.1
– 0.5 pg para fosforo y 0.5 – 1 pg para nitrógeno.

Temperatura de trabajo tiene que ser de 225 a
325° Celsius, sin embargo, este detector es muy
específico pues solamente puede detectar
algunos compuestos, esto se debe a que no se
van a combustionar bien, la misma molécula
puede presentar diferentes señales si es que ésta
tiene sustituyentes como cloro u otros elementos.
Los parámetros que afectan a este detector son:
• El flujo de gas (hidrógeno, aire, helio o
nitrógeno)
• La estructura de los compuestos
• Temperatura del detector
• Fuente de la corriente

No dan señales los grupos carbonilo, alcohol, Estos parámetros se deben controlar para generar
halógeno o amina y tampoco responden gases no que el detector esté en condiciones óptimas.
inflamables como el CO2, SO2, agua, óxidos de
nitrógeno y compuestos sulfurados. Lo anterior
debido a que si no tienen la propiedad de
combustionarse frente a hidrogeno y oxígeno, no
serán detectados.

Mientras más sustituidos, la señal decrecerá.

Un hidrocarburo alifático se combustiona y

detecta muy específicamente.

Detector de nitrógeno – fosforo

(NDP)
Detector destructivo, ya que pasa por un proceso
de combustión.
Clase 4, 30 de agosto de 2021
Cromatografía Gaseosa
No se pueden acoplar dos detectores
destructivos, pues solo detectará en el paso del
primero y en el segundo ya no.
Detector de captura de electrones
(ECD)
Es un detector no destructivo. Cuando un detector
es no destructivo, se pueden acoplar dos
detectores, por ejemplo, primero se puede
colocar un detector de captura de electrones y
luego un FID, de esta forma en un mismo análisis se
pueden identificar dos familias distintas de
compuestos.
Este posee un gas auxiliar o makeup el cual es
nitrógeno o 95:5 (argón/metano), que ayuda a
movilizar los compuestos hasta el punto de
detección.
Este detecto se caracteriza e identifica por la
presencia de una placa en su interior que indica
una “fuente radioactiva (63Ni)”, la fuente
radioactiva produce partículas β (electrón) que
está constantemente siendo irradiada desde un
campo a otro.
Los electrones ionizan el gas portador y se produce
una ráfaga de electrones y se obtiene una
corriente constante. Especies orgánicas en el gas
capturan parte de los electrones, disminuyendo
por tanto la intensidad de la corriente.
En otras palabras, ante esta nube electrónica los
compuestos con grupo electronegativos como:
halógenos, peróxidos, quinonas y grupos nitro,
grupos que contienen átomos de halógeno (cloro,
bromo, yodo), oxígeno y nitrógeno, absorberán el
flujo de electrones. Por lo tanto, lo que el detector
percibe es la variación de la incidencia
electrónica, la cual se ve alterada por la presencia
de las moléculas electronegativas.
Todos los compuestos que pasan afectan de
alguna forma la nube electrónica.
Se puede decir que este detector es lo contrario al
FID, pues se ve limitado en la detección de
alcoholes, amina e hidrocarburos (no dan señal)
porque no poseen grupos electronegativos en su
estructura.
Por lo tanto, a este tipo de detector se les clasifica
como detectores específicos, pues fueron
creados para detectar ciertas familias de
compuestos que cumplan con ciertas
características.
Detector de masas (MS)
Es un detector destructivo.
La complejidad de este sistema reside en su
programa de encendido pues se debe tener un
vacío muy alto antes de comenzar a trabajar,
obtener aquel vacío puede tardar hasta 3 días,
luego de eso se calibra y se comienza el análisis.
De la misma forma el programa de apagado es
complejo.
El encendido y apagado de este aparato se
deben programar debido a que este está
auxiliado por dos formas de realizar el vacío: una
bomba externa y una bomba turbo – molecular
que succionan aire del sistema. La bomba turbo –
molecular no se puede apagar bruscamente
porque sus aspas que se encuentran inclinadas,
por efecto de la inercia se doblan.
Por lo tanto, estos equipos deben estar
conectados a sistemas de respaldo de energía,
tales como un UPS en caso de que el suministro
eléctrico falle.
Para que el equipo preparar el equipo debe haber
una bomba de vacío, luego de este proceso se
permite el paso de moléculas resultantes de la
separación cromatográfica; en el interior del
detector se encuentra un filamento (pieza de
metal incandescente) que también genera una
nube electrónica que es capaz de fragmentar las
moléculas orgánicas.
Aquella ruptura va a depender de la energía de
incidencia del filamento, normalmente se ocupan
70 electronvolt (ev), bajo este valor no ocurre
fraccionamiento de la molécula.
Cuando un detector de masa es ocupado para
determinar el peso molecular de un compuesto,
este debe estar puro (no ligado a un proceso de
separación) y la energía de incidencia del
filamento debe ser menor debido a que no se
quiere fragmentar la molécula, sino que pase
completa.
Luego de la fragmentación, la molécula pasa a un
estado iónico debido a la perdida de electrones.
La presencia de las placas cargadas alrededor del
filamento tiene como función repeler las cargas
que son producto de la fragmentación.
Luego los fragmentos comienzan a viajar en el
sistema, el vacío debe existir para que estos viajen
libres sin chocar con átomos de oxígeno, dióxido
de carbono, nitrógeno etc. Este no es un vacío
absoluto, sino un alto vacío, por lo tanto, no se
puede evitar la presencia de compuestos que
deriven del aire.
Los magnetos o cuadrupolos se encienden y
apagan en forma punzante provocando una
segunda aceleración de los compuestos
(separación de los fragmentos), pero en este caso
la masa de los compuestos afectará de tal modo
que los compuestos con menor masa serán
mayormente desviados.
fraccionamiento. Dado lo anterior el registro de
estos patrones pueden ser útiles para la
identificación de patrones obtenidos.
El detector es versátil pues identifica compuestos
como: hidrocarburos, halogenados, nitrogenados,
etc. Así como también no hay un requisito de que
sean inflamables o no inflamables.
El detector de masas requiere de calibración, esto
se realiza internamente a través de un gas de
calibración que tiene la característica de
fragmentarse aproximadamente en cinco partes,
dando un peso molecular muy alto y uno muy
bajo.
Hay detectores de masas independientes del
cromatógrafo de gases, pero tienen como
restricción de que cuando se sitúa la molécula
esta debe ser pura, pues se obtendrá el espectro
sin antes poder separar, de lo contrario se
obtendrá un espectro con una mezcla de
compuesto en donde no se pueden identificar.
Al hacer uso de un detector de masas
independiente, la muestra pura debe ser alojada
mucho antes del filamento, de forma que a este
llegue el compuesto en forma de gas.
La razón por la cual para una molécula
determinada aparecen fragmentos en distintos
valores de abundancia en el espectro es debido
a que no sólo hay una molécula del compuesto
viajando por el detector, lo que quiere decir que
parte de esas moléculas se fragmentaran
obteniendo un peso molecular distinto, mientras
que otras no se fragmentaran y conservaran el
peso molecular original.
Comúnmente hasta los compuestos que se llega a
detectan con el detector de masas, son los
esteroles que tienen un peso molecular más o
menos alto, pero pese a esto son analizables por
cromatografía gaseosa ya que aún son
potencialmente volátiles. Para las proteínas, por
ejemplo, no se ocupa este tipo de detector pues
son macromoléculas más grandes y complejas.

Los compuestos que van cargados positivamente,

de acuerdo con la masa carga, empiezan a
separarse produciendo que el detector de masa
los pueda detectar según su masa.

Se asume que si se mantiene la energía de

ionización (ej. 70 ev) constante, para el mismo
compuesto debería tener el mismo patrón de
fraccionamiento, de esta forma estos son
reproducibles y dan paso a la creación de
bibliotecas de espectros según los patrones de
Clase 5, 06 de septiembre de 2021
Cromatografía líquida
Generalidades
Desde el punto de vista genérico es una de las
técnicas más favorables y utilizadas para el área
farmacéutica. Siempre y cuando esté enfocado
en el análisis del fármaco.
La cromatografía líquida de alta eficiencia
simplificando en las siglas HPLC, antiguamente se
le denominaba cromatografía líquida de alta
presión con las mismas siglas HPLC.
¿Para qué se utiliza esta técnica?
Se utiliza principalmente para separar compuestos
de mezclas líquidas, en el caso de la muestra de
la cromatografía líquida el 99,99% de los casos los
analitos que entran al proceso están en forma
líquida.
La cromatografía líquida no está pensada para
implementar gases, esto lo diferencia
principalmente de la técnica de cromatografía
gaseosa, en donde los analistas principalmente
tienen liposolubles disueltos en solventes apolares,
en cambio en la cromatografía líquida
instrumental los analitos están disueltos en un
medio acuoso o similar a este, por tanto, los
analitos tienden a ser hidrosolubles.
Entonces la cromatografía líquida se basa en la
mezcla de sustancias en solución acuosa, dónde
está depende de las diferentes interacciones
químicas de las sustancias con la respectiva
columna cromatográfica.
Historia
Esta técnica se comenzó a desarrollar posterior a
la cromatografía gaseosa, por tanto, cuando se
analizaban sustancias de cromatografía gaseosa
posteriormente aparecía el mismo análisis, pero en
cromatografía líquida, esto era lo que ocurría
principalmente en los años 80.
Lo anterior se debe a que cuando se analizaba
con el detector de masas llegaba la muestra con
una carga muy elevada lo que complicaba el
análisis.
Principio de separación
Interacción se genera principalmente por: peso
molecular, tamaño y afinidad con la fase
estacionaria.
Esta técnica se caracteriza poseer una fase móvil
líquida, esta permite movilizar los compuestos de
la muestra.
Tipos de cromatografía líquida
Es fundamental fijarse en estas técnicas de
cromatografía, pues suele darse el caso que a
partir del análisis preparativo se realice un mal
análisis instrumental, pues las interacciones
químicas no son compartidas.
Cromatografía de exclusión molecular:
Esta se destaca por separar los componentes
según su tamaño, estas muestras son comparadas
con estándares de pesos moleculares.
Cromatografía de intercambio iónico:
Se basa en el intercambio iónico en función de
resinas, es muy utilizada en el análisis de
compuestos con cargas.
Cromatografía de partición
A partir de esta técnica se introducen 2 nuevos
conceptos: fase normal y fase reversa.
• Fase normal: su fase estacionaria (polar)
corresponde a placa fina, columna o papel,
en este caso la fase móvil generalmente es un
líquido apolar.
• Fase reversa: es lo opuesto a la fase normal.
Desde el punto de vista instrumental la
cromatografía por fase reversa es la más común,
esto destaca porque su fase estacionaria es un
compuesto apolar y su fase móvil polar (agua,
alcohol, etanol, acetonitrilo). Normalmente los
componentes que se van a separar están en un
medio acuoso.
Cromatografía en papel, placa fina y columna.
Polaridad y peso molecular
La polaridad y el peso molecular son 2 factores
importantes en términos de cromatografía líquida.

Se expresa cuáles son los tamaños moleculares
analizados por cada tipo de cromatografía
líquida y además la polaridad de la fase
estacionaria.
La cromatografía de partición, la cual es una de
las más utilizadas, analiza tamaños moleculares
más altos que la cromatografía gaseosa, sin
embargo, no puede llegar a grandes tamaños
moleculares como otras cromatografías líquidas,
pero es importante destacar que esto se basa en
la separación por afinidad química entre la fase
estacionaria y la fase móvil.
Desde el punto de vista iónico, la cromatografía
de partición puede analizar tantos compuestos
apolares (en fase reversa) como polares (en fase
normal).
Cromatografía de partición
Dentro de la cromatografía de partición se
encuentra la fase reversa y fase normal.
En la fase reversa en la fase estacionaria es apolar
y la fase móvil es polar, por tanto, aquellos
compuestos analizados que sean polares eludirán
primero, pues lo polar interacciona con lo polar,
de esta manera con la fase estacionaria
interaccionarán los compuestos que son apolares.
En la fase normal la fase estacionaria es polar y la
fase móvil es apolar, por tanto, los compuestos
apolares son los que saldrán de la columna
primero, pues no generan una gran interacción
con la fase estacionaria.
Proceso cromatográfico de la
cromatografía líquida
Esquema general de cómo es el proceso de este
tipo de cromatografía.
El ingreso de la muestra puede ser vía inyección
manual o auto-sampler.
Se tiene un reservorio de solvente que
corresponde a la fase móvil y una bomba de
empuje, esto toma al solvente y lo empuja para
mezclarlo con la muestra en el sitio de inyección,
luego de esto se pasa al proceso cromatográfico
donde se realiza la separación y posteriormente
pasa hacer analizada por los diversos detectores.
Hay que resaltar que la columna es fundamental
para el proceso de la separación, por tanto, es
importante escoger correctamente este aparato.
En la actualidad existen diverso software para el
análisis de los datos de este tipo de
cromatografías.
En los aparatos actuales la columna de
cromatografía se encuentra al interior del equipo
pues éste requiere de un horno para mantener
una temperatura constante, pues este factor
altera la efectividad de la cromatografía.
Normalmente en los equipos de cromatografía se
observan cañerías de acero y plásticas, estos son
utilizadas para presiones altas y bajas
respectivamente.
Tuberías
Tuberías de alta presión:
Las tuberías de acero se utilizan para soportar las
altas presiones, se suelen utilizar también tuberías
de acero inoxidable. Normalmente se utilizan unas
tuberías denominadas peek las cuales son
coloreados.
Las tuberías de acero se suelen encontrar desde la
bomba de empuje hasta el aparato de auto-
sampler, su ubicación en el aparato está antes y
después de la columna de cromatografía como
se observa destacado en el dibujo.
Tuberías de baja presión:
Las tuberías de baja presión se suelen encontrar
antes de la entrada a la bomba de empuje, y en
la salida al detector, estas están diseñadas con
polímeros altamente resistentes como el teflón,
plástico y en algunos casos peek.
A diferencia de la cromatografía gaseosa la
cromatografía líquida se generan una gran
cantidad de residuos los cuales son almacenados
en contenedores especiales.
Fase móvil
Corresponde a la fase que va a transportar a los
analitos por el proceso cromatográfico, este
consiste en una mezcla de solventes que puede
cumplir diversas funciones, por tanto, difiere de la
cromatografía gaseosa, pues esta cromatografía
líquida presenta un solvente no inerte.
Algunas funciones:
• Polaridades diferenciales, normalmente se
tienen contenedores con más de una fase
móvil, de manera que durante el proceso de
la cromatografía se pueden mezclar estas
fases para obtener diversas polaridades.
• Fuerza iónica, normalmente es entregada por
un compuesto denominado acetonitrilo.
• Control del pH a partir de soluciones buffer,
esto permite que no se altere el pH de la
muestra durante el análisis, de esta manera
podemos mantener la característica iónica de
las moléculas.
Los contenedores de los líquidos buffer contienen
filtros que impiden el paso de las impurezas que se
puedan generar durante el almacenamiento. Es
importante filtrar esta sustancia, pues puede
generar hongos en la fase móvil.
Criterios para la elección de un
solvente para el proceso
cromatográfico
• Disponibilidad comercial.
• Debe ser puro y estable, mientras más pura es
el reactivo al mismo tiempo es más caro.
• Debe disolver la muestra.
• Debe ser miscible con otros solventes para
formar mezclas útiles.
• No debe degradar la fase estacionaria.
• Debe poseer baja viscosidad.
• Debe ser compatible con el detector utilizado,
es decir no de ser detectado por este.
• Transparencia óptica, debido a que a ciertas
longitudes de onda los solventes comerciales
suelen absorber algunos compuestos, esto
podría generar un apantallamiento de la
muestra.
• Filtración y desgasificación de los solventes,
para generar la desgasificación se utiliza un
aparato de ultrasonido que elimina las
burbujas.
Gradiente del solvente
Corresponde a la combinación de distintos tipos
de fase móvil en diversas proporciones, esto
genera polaridades diferenciales, que a su vez
permite el favorecimiento del transporte de
algunos compuestos durante la cromatografía.
Como se aprecia en el diagrama, en el primer
experimento se utilizan 6 solventes diferentes los
cuales permiten separar la muestra de manera
adecuada, pero requiere de mucho tiempo, esto
provoca que se genere un mayor gasto de fase
móvil.
En el caso del segundo análisis con 6 solvente
diferentes se separa la muestra en un tiempo muy
corto, pero en este caso hay un problema en la
separación de la muestra, pues es un proceso muy
poco resolutivo.

Inyector
El inyector corresponde a la parte por donde entra
la muestra a la columna. Este de inyector se
diferencia de la cromatografía gaseosa, pues el
componente que se inyecta es distinto, incluso se
inyecta mucho más volumen, también este
inyector no está sujeto a temperatura, no requiere
de una septa para ingresar la muestra y la jeringa
utilizada es de mayor tamaño.

Características:

• Para ingresar la muestra se requiere un filtro

con forma de peonza, esta puede ser de
diversos materiales.
• Al no necesitar una septa las puntas de las
agujas son de carácter plano.
• Mientras mayor cantidad de analito sean
inyectados, más respuestas serán registradas.
Clase 6, 07 de septiembre de 2021

Cromatografía líquida
Bombas de HPLC
La bomba de cromatógrafos de líquidos HPLC
cumple la función de impulsar a los solventes junto
a la muestra en los procesos cromatográficos.
Estas bombas deben ser muy eficaces pues deben
producir presiones estables hasta 6000 psi lo que
equivale aproximadamente a 408 atmósferas.
Al ser estas presiones muy altas explican la
utilización de conectores de acero inoxidable.
¿Por qué la presión debe ser tan alta?
Porque permite el paso de la muestra por medio
de la columna cromatografía, esto es debido a
que el tamaño de las partículas de la fase
estacionaria es muy pequeño, lo que en cierta
parte impide el movimiento de la muestra junto al
solvente.
Otra característica que tiene esta bomba es que
deben mantener el flujo libre de pulsaciones, es
decir no pueden estar dando flujos aleatorios, este
debe ser constante, también debe generar
caudales de flujo muy bajos incluso más bajo que
0,1 y 10 mL/min, a partir de esto se requiere que la
bomba pueda regular flujos muy altos y bajos.
Utilizar flujos bajos conviene normalmente cuando
no se está utilizando el HPLC, pues el momento de
apagar el aparato es necesario que siga teniendo
un flujo de solvente, de esta manera se impide el
daño o secamiento de la columna.
el flujo el tiempo de retención de los compuestos
no será siempre igual, generando un proceso de
cromatográfico no reproducible.
Los aparatos más modernos de HPLC incorporan
mejoras para poder trabajar a presiones más altas
y, por lo tanto, poder utilizar partículas de tamaño
más pequeño en las columnas (<2 micrómetros).
En estos determinados casos el HPLC modifica su
nombre a UPLC, esto es debido a que estos
sistemas pueden llegar a trabajar con 1000
atmósferas.
¿Por qué el tamaño de las partículas que se
utilizan en la UPLC es tan pequeño?
Esto permite la mejora de la separación, mientras
más pequeña es la partícula de la fase
estacionaria aumenta la superficie de
especificidad y por tanto se genera mayor
contacto entre el analito y las partículas de la fase
estacionaria.
Conexión de cañerías en la
cromatografía HPLC
Normalmente es conectar cañerías o cortarlas,
para lo cual se necesita un aparato denominado
cortador de tubos, si el corte no es regular se
pueden generar flujos turbulentos.

La bomba también debe permitir un control y

reproducibilidad del flujo de solvente.

Los componentes de este aparato deben ser

altamente resistentes a la corrosión, esto es
fundamental pues la fase móvil posee buffers,
sales, acetonitrilos, una fuerza iónica elevada,
entre otros factores, los cuales pueden generar la
corrosión del sistema.

Tipos de bombas para HPLC Un flujo turbulento puede generar problemas en la

separación del analito, también puede provocar
Funcionamiento existen 2 tipos de bomba para la la pérdida de presión o una fluctuación en esta.
cromatografía HPLC, es decir la bomba mecánica
y neumática, y esto tiene que ver con la forma en Una ventaja que tiene este tipo de cromatografía
que impulsa el líquido a través del sistema. ante la cromatografía de gases es que las fugas
son observables.
La presión de la bomba es variable según el
modelo y fabricante, pero su rendimiento se mide
en su habilidad para generar un flujo constante y
reproducible, esto es fundamental pues si se varía
 Tipos de columna HPLC
Normalmente se utilizan columnas de diversos
diámetros y longitudes, cómo se presenta la
imagen aquellas columnas marcadas son las que
más predominan en este tipo de cromatografías.
En la actualidad también se utilizan unas columnas
denominadas columnas capilares los cuales
requieren una gran presión debido a que poseen
un tamaño muy pequeño en términos de diámetro
y en las partículas que componen a la fase
estacionaria, también poseen un flujo no
exagerado, pues es necesario pasar el solvente
por un tamaño muy pequeño de manera efectiva.
Las columnas guardianes o pre – columnas son
conectados antes de la columna cromatográfica,
su función es actuar como un filtro, así permitiendo
utilizar muestras o flujos que pueden contener
impurezas, de esta manera se puede aumentar la
vida útil de la columna.
Las columnas monolíticas poseen un relleno de
tipo esponja de una estructura única, sin embargo,
estás han sido dejado de lado.
Problemas de difusión en columnas
empacadas
Antiguamente la columna cromatográfica debía
ser empacada por el analista, lo que ocasiona
que comúnmente se generarán difusiones y flujos
turbulentos por ende la separación era poco
efectiva, además se perdía la característica de
reproducibilidad del análisis.
Diámetro interno de la columna HPLC
El diámetro interno de una columna HPLC es un
aspecto crítico que determina la cantidad de la
muestra que se puede cargar a la columna y
también influye en su sensibilidad y el flujo que
puede pasar a través de ella.
Las columnas de diámetro interno mayor a 10 mm
utilizan normalmente la purificación de
compuestos para su utilización posterior, esto se
denomina cromatografía preparativa. En palabras
más simples en este tipo de cromatografías se
utilizan tamaño de partículas cuantiosas lo que
permite la inyección de una mayor cantidad de
muestras para su separación, normalmente se
utilizan intervalos de tiempo para separar los
residuos en diferentes frascos de esta manera se
separan los componentes de una muestra, esto
normalmente se utiliza para el análisis de
compuestos naturales.
Estas columnas con el diámetro interno menor
entre 4 y 5 mm se utilizan en el análisis cuantitativo,
donde hay más sensibilidad, menos consumo de
disolventes y también aumenta la resolución. Estas
columnas son denominadas columnas de rango
analítico y normalmente están asociados a un
detector UV-VIS.
Existen otro tipo de columnas, como las de tipo
capilar, con un diámetro inferior a 0,3 mm, estas
son utilizadas normalmente en la espectrometría
de masas.
En resumen, dependiendo del tamaño de
partícula se generará diferentes requerimientos de
presión, de esto también dependerá la
separación con mejor o peor resolución de
compuestos.
Medida de las partículas
La mayoría de los HPLC tradicionales se realizan
con una fase estacionaria unida al exterior de
partículas esféricas de sílice, es decir la fase
estacionaria está envolviendo a las esferas de
sílice.
Estas partículas pueden poseer diferentes
medidas, siendo las de 5 micrómetros de diámetro
las más utilizadas.
Las partículas más pequeñas ofrecen una mayor
superficie una mejor separación, pero la presión
que se requiere para obtener una velocidad lineal
óptima aumenta la forma inversamente
proporcional al cubo del diámetro de la partícula.
Esto quiere decir que disminuir la medida de las
partículas a la mitad, aumentaría la resolución de
la columna, pero a su vez, aumentaría la presión
necesaria en un factor de 8.

Tipos de fase estacionaria en la

cromatografía líquida
No existe un solo tipo de fase estacionaria para la
cromatografía líquida.

A continuación, se muestran tipos de fase reversa,

que se caracterizan por ser apolares.

• Alkylamine La tabla muestra los solventes y aplicaciones que

• Octodecyl (C18)
• Octyl (C8)
• Phentyl (C6)
• Butyl (C4)
• Cyanopropyl (CN)
• Methyl
También se presentan componentes de fase
normal que se caracterizan por ser polares.
• Silica
• Cyanopropyl (CN)
• Aminopropyl (NH2)
• Diol
Se puede apreciar que hay componentes que se
repiten en ambas tablas, esto se debe que hay
algunas fases estacionarias que se pueden usar en
ambos modos. Dentro del rango de las fases
estacionarias habrá algunas que pasean mayor o
menor grados de polaridad o apolaridad.
En la fase reversa una de las fases estacionarias
más utilizadas es octodecyl (C18).
se pueden utilizar en las respectivas fases
estacionarias.
La elección de la columna cromatográfica se
basa en la información generada por
cromatografías previamente hechas en otros
estudios.
Elusión en una columna de fase
reversa y una columna de fase normal
En la fase normal aquellos compuestos que van a
ser más polares van a eluir al final y aquellos que
sean más apolares van a eluir primero, en cambio,
en la fase reversa los compuestos más polares van
a eluir primero y aquellos que sean más apolares
van eluir al final.
Esto principalmente se basa en la interacción con
la fase estacionaria y la fase móvil.

Se muestra como luce una C18, este
hidrocarburo se encuentra dispuesto sobre la
sílice que posee una forma amorfa.
Detección
Existen detectores universales que dependen de
la medición de alguna propiedad que es común
para todos los compuestos. El detector funciona
midiendo la diferencia de esta propiedad entre la
fase móvil conteniendo la muestra y sin la muestra.
Los detectores específicos miden alguna
propiedad que no es común a todos los
compuestos, como su capacidad de absorber la
luz a una longitud de onda específica, conducir la
electricidad a emitir fluorescencia.
Detectores que modifican la fase móvil, requieren
modificar la composición de la fase móvil luego de
la elusión desde la columna, agregando reactivo
o evaporándola completamente.
Este punto es específico para los HPLC unido a los
detectores de masa, pues se busca que la fase
móvil interfiera lo menos posible en la detección
de masas.
Técnicas hifenadas: corresponde a técnicas
donde un instrumento analítico independiente es
acoplado al sistema cromatográfico para permitir
la detección. Un ejemplo de esto es la técnica
HPLC acoplado al detector de masas.
Los detectores para la cromatografía líquida son
muy variados:
Detector de arreglo de diodos
Es un director muy empleado en la cromatografía
líquida y este tiene la virtud de poder realizar
medidas simultáneas de observancia en diferentes
longitudes de onda en sólo una inyección de la
muestra. Esto es muy ventajoso debido a que
muchos compuestos absorben más de una
longitud de onda en el espectro UV-VIS.
En el fondo el detector de diodos generaba ruidos
constantes que permite identificar compuestos a
variados longitudes de onda.
A continuación, se presenta como luce el
resultado de un arreglo de diodos:
Los resultados se presentan en forma
bidimensional en donde hay una interrelación
entre el tiempo y las longitudes de onda, pero
como se pueden medir varias longitudes de
donde a la vez se utiliza un modelo de 3
dimensiones. Para analizar los compuestos a la vez
se escoge una sola longitud de onda, de manera
que se escoge una característica común que
comparten los compuestos.
La absorbancia que se observa en el resultado
cromatográfico, la cual choca con la pared del
modelo tridimensional se debe a que los
componentes llegan a una región de
denominado transferencia óptica es en esta zona
donde los solventes comienzan a ser detectados.
Por tanto, se suele escoger flores 250 nanómetros
para evitar el problema de detección de solvente.
Las lámparas utilizadas para el detector de diodos
son de deuterio para rangos de 190-370 nm y de
tungsteno para rango visible de 320-1000 nm.
Entonces se puede entender que hay lámparas
para la región UV y para la región visible.
A través de una celda de flujos atraviesan las
emisiones generadas por las lámparas de deuterio
y tungsteno, esta celda debe ser de cuarzo, esto
es fundamental pues el cristal absorbe regiones de
los rayos UV.
Detector UV-VIS
Corresponde a uno de los detectores más
empleados en los equipos HPLC, y funciona bajo
el mismo principio del espectrofotómetro, pero
con lecturas continuas a medida que van
eluyendo los analitos.
El detector UV-VIS puede ser multicanal es decir se
pueden escoger ciertas longitudes de onda para
ser medidas, de manera que a diferencia del
detector de diodos no se pueden medir en rangos.
La gran mayoría de los compuestos orgánicos
(solventes) absorben en el rango de 180 a 210 nm,
y en este rango de la mayoría de las fases móviles
tienen fuertes señales también, por lo que la
cuantificación debe realizarse en un rango donde
el solvente sea invisible para el detector.
A continuación, se observa una diferencia en la
absorbancia en una longitud de onda de 290 nm,
en donde se observa un punto segmentado que
representa un puntaje en control, es decir donde
se presenta la detección del solvente, esto se
puede dar cuando el solvente es cambiado en un
momento dado generando que sea visible a la
longitud de onda utilizada. Cuando no se utilizan
blancos para controlar estos casos se pueden
producir errores considerables en los resultados de
la cromatografía, de aquí viene la importancia de
la transparencia óptica.

Criterios para seleccionar el método y

la columna adecuada
Primero hay que fijarse en el compuesto si es de
alto peso molecular o de bajo peso molecular, si
se diera el caso de que fuera de bajo peso
molecular hay que fijarse si el compuesto es
ionizable o no ionizable, suponiendo que el
compuesto fuera no ionizable luego hay que
fijarse si es polar o no polar, entonces se descubre
que el compuesto es polar por tanto la
cromatografía que se utilizará es mediante fase
reversa.

Línea continua representa lo preferente mientras

que la línea segmentada lo alternativo.
Clase 7, 13 de septiembre de 2021
Cromatografía líquida
Resultado del proceso cromatográfico
Independiente del detector utilizado en el proceso
cromatográfico se obtiene como resultado una
señal analítica.
Luego de que el detector detecta la molécula
analizada éste envía una señal a un aparato
denominado integrador, esta señal presentada en
forma gráfica observable en equipos de
computación, entonces este resultado se conoce
como cromatograma.
Existen diversos tipos de cromatogramas,
dependiendo de los aparatos utilizados en la
cromatografía, puede haber variaciones de
tiempo que generan diferentes separaciones.
Sobre cada señal se observa un número que
estará relacionado con una molécula en
particular.
Información adquirida de un
cromatograma
Tiempo de retención
Según el tipo de detector, varia el tiempo en que
se comienza a analizar la muestra. Existen
detectores que parten adjuntando información
desde el momento cero, pero en otros hasta el 44
aparecen información que se debe omitir, tal es el
caso del detector de masas que no lo hacen del
tiempo cero.
El tiempo de retención está definido por 3 puntos:
• Punto de salida de la molécula
• Punto donde termina la salida de la molécula
• Tiempo de retención medio (t)
El tiempo de retención medio se utiliza para el
análisis.
El tiempo de retención está dado por el valor
medio del tiempo, pues es donde se concentra la
mayor abundancia de la molécula.
¿Por qué la señal analítica posee forma de ola?
Esto ocurre porque en el análisis de los compuestos
hay una gran cantidad de moléculas, lo que
genera variaciones o distanciamiento en la señal
por la aparición de isótopos de la molécula.
Intensidad (poco utilizado)
A lo largo del eje Y se encuentra la señal, este
dependerá del tipo de detector utilizado, pues no
todos utilizan la misma unidad de medición.
Mientras más alta sí a la altura podría ser mayor la
concentración de una molécula, esto se
denomina peak cromatográfico.
Existen detectores que no toleran la señal del aire
o el frente solvente por lo que se define un tiempo
que debe transcurrir antes de que el detector sea
activado, normalmente esto es aplicado para el
detector de masas.

Entender esto es fundamental para evitar la

destrucción del detector.

Área bajo la curva (más utilizado)

Es un parámetro utilizado para hacer una

transformación de los datos cualitativos a
Cuando hay una gran cantidad de componentes
cuantitativos, al calcular el área de la curva se
en una mezcla analizada resulta inviable calcular
puede relacionar con una concentración
la resolución de cada uno, sino que la detección
específica de la molécula, esto es permitido
va a ser a través de lo observable.
gracias a técnicas de calibración.
Ejemplo: cola de la novia o taiging
Número de platos teóricos (N)
Es una medida de la eficiencia de la columna.

Su fórmula es: 𝑁 = 16(𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑐𝑖𝑜𝑛/𝑊)2

W corresponde al ancho de la señal del

cromatograma.

Este concepto nació a partir de las columnas de

destilación fraccionada, las cuales pasen unos
obstáculos denominados platos estos aparatos
permiten la condensación del vapor del solvente
permitiendo que las sustancias más ligeras
atraviesen la columna.
Este concepto está relacionado estrechamente
con la capacidad y eficiencia de la columna.
Ejemplo: peak anchos
Esto ocurre cuando hay una interacción excesiva
entre el analito y la fase estacionaria, esto es
evitable si la columna seleccionada se adecúa a
los compuestos analizados en términos de
polaridad.

En estos casos el área de la curva calculada en

Cromatograma tipo realidad no representa la concentración del
analito.

Ejemplo: peak agudo

Este es el peak ideal

En el segundo peak cromatográfico se observan

dos señales.

Resolución
Cuando se habla de resolución se refiere a qué
tan bien resuelto está el peak cromatográfico.

Acá se puede observar la fórmula para calcular la

resolución:

Co-elución
Este término corresponde a cuando 2 compuestos
eluyen al mismo tiempo de retención.
Hay ocasiones es que las señales de los
compuestos no se pueden distinguir, esto ocurre
por la isomería de los compuestos, generalmente
esto se da cuando la columna no es capaz de
separar compuestos isomericos de manera
correcta.
Otro problema importante es el cálculo del área
bajo la curva, normalmente se dibuja una línea
divisoria entre ambos peak cromatográficos. Tal es
el caso del segundo ejemplo en la figura.
Cuando resulta prácticamente imposible de
separar los compuestos se reportan como A y B o
1 y 2, expresando la concentración calculada
como perteneciente a ambos.
Interferencias o ruido
El ruido instrumental consiste en todo lo que
detecta el detector cuando no sale alguna señal
importante, estas señales detectadas pueden ser:
• Sangrado de la septa
• Sangrado de la columna
• Impureza de algunos solventes
Para evitar este problema, es de vital importancia
inyectar un blanco antes de realizar un análisis, un
blanco corresponde a todos los solventes en que
está disuelto un analito, pero sin el analito.
En la cromatografía gaseosa el ruido suele
aumentar en los puntos de mayor temperatura.
Ejemplos de cromatograma
Se observa un cromatograma realizado con un
detector de masas; en el tiempo entre 0 y 4
corresponde al solvent delate o solvent cat.
Hay que recordar que cuando los peak están casi
al nivel del ruido, conviene no considerarlos pues
pueden ser impurezas del solvente.
Métodos de identificación
• Tiempo de retención y uso estándares: si se
quiere saber que efectivamente hay un
compuesto específico en la mezcla, es
necesario comparar con un compuesto puro,
si los tiempos de retención de ambos fuesen
similares es muy probable que se tenga el
compuesto buscado. La ventaja de este
método es que es cuantitativo.
• En el caso de la espectrometría de masas se
puede utilizar una biblioteca de espectros, en
donde es posible estudiar los patrones de
rompimiento definidos, pero esto es solamente
en un método cualitativo.
Métodos de cuantificación
Métodos de cuantificación generalmente se
basan en el área bajo la curva que por lo general
es lo que más se utiliza, pero también se puede
utilizar la altura del peak.
Clase 8, 14 de septiembre de 2021

Cromatografía: métodos de cuantificación

Para determinar la concentración de una o varias determinado intervalo de trabajo
sustancias se debe utilizar un compuesto puro que (concentraciones).
posea las mismas o características muy parecidas
En el procedimiento se compara una propiedad
a la sustancia a cuantificar.
del analito con la de estándares de
Este compuesto se llama “estándar” y posee una concentración conocida del mismo analito (o de
concentración conocida, a menos que sólo se algún otro con propiedades muy similares a éste).
quiera ocupar como referencia para identificar un
compuesto.

Las vías de cuantificación pueden ser:

• Curvas de calibración.

Estas por lo general se realizan con el mismo

compuesto a identificar.

• Adición de estándar (sustancia no existente en

la muestra o compuesto con isotopos también
llamados estándares subrogados).

Se trata de compuestos que contienen la

molécula que se busca, pero tienen una identidad
diferente, la razón por la que no se ocupa como
estándar la misma molécula buscada es porque
no se podría cuantificar al no saber cuánto de la
molécula había antes y después de colocar el
estándar.
Ejemplos en laboratorio
1. Si se requiere hacer un análisis cualitativo de
una sustancia que se presume que posee
cafeína, y no se tiene un estándar para ello, la
solución sería realizar una extracción de
cafeína desde café y pasarlo por el proceso
de cromatografía, luego se hace lo mismo con
la sustancia en cuestión y se comparan los
tiempos de retención.
2. Si un niño consume una dosis x de
paracetamol por error y se requiere un análisis
cuantitativo para conocer la concentración
que ingirió, se deberá tener un estándar de
paracetamol puro.
Curva de calibración
Una curva de calibración es la representación
gráfica de una señal que se mide en función de la
concentración de un analito.
Mide la capacidad de un método analítico para
obtener resultados que sean directamente
proporcionales a la concentración de un
compuesto en una muestra, dentro de un
Se establece una relación lineal entre la respuesta
del equipo y la concentración, por lo tanto, en
función de los puntos obtenidos se trazada una
recta de la cual se asume que define
fidedignamente el comportamiento. El R2
(coeficiente de determinación) al ser cercano a 1
verifica lo anterior, concluyendo que la curva es lo
suficientemente representativa en el rango
estudiado (no se puede predecir el resto del
comportamiento).
Por otro lado, también se obtiene 𝑦 = 𝑚 × 𝑥 + 𝑏
(ecuación de la recta).
Respecto a la ecuación de la recta:
y: área
m: pendiente
x: concentración
b: Intercepto (ordenada al origen)
Por lo tanto, al despejar x la ecuación de la recta
permite obtener la concentración:
𝑦−𝑏
[𝑥] =
𝑚
Es importante entender que la curva de
calibración es una inferencia del comportamiento
de los datos y que no necesariamente es como tal
el comportamiento de estos, salvo que el
coeficiente de determinación (R2) sea 1.
 En resumen: Ejercicio
La etapa de calibración analítica se realiza Mediante una aplicación o calculadora:
mediante un modelo de línea recta que consiste
en encontrar la recta de calibrado que mejor
ajuste a una serie de “n” puntos experimentales.

Donde cada punto se encuentra definido por una

variable “x” (variable independiente,
generalmente concentración del analito de
interés) y una variable “y” (variable dependiente,
generalmente respuesta instrumental).

A partir de la curva de calibración (conjunto de

El área es adimensional.
concentraciones que describen el intervalo en el
cual se deberá cuantificar el compuesto por a) Obtenga una curva de calibración con los
analizar) y a fin de asegurar que la recta datos.
encontrada en los puntos experimentales se ajuste
correctamente al modelo matemático de la 1600
ecuación, se calculan los valores de la ordenada 1400 y = 3,21x - 491,65
al origen (b), la pendiente (m) y el coeficiente de 1200 R² = 0,9947
determinación (R2). 1000
800
Métodos de los mínimos cuadrados 600
400
Por tener una buena exactitud y confiabilidad
200
estadística, el método más empleado para
0
encontrar los parámetros de la curva de calibrado
0 200 400 600 800
es el método de los mínimos cuadrados.

Este método busca que la recta del calibrado
haga que la suma de los cuadrados entre las
distancias verticales de cada punto experimental
y la recta de calibrado sea mínima o tienda a
cero. A la distancia vertical entre cada punto
experimental y la recta de calibrado se le conoce
como residual.
En forma grafica se representa como:
b) Determine la concentración de la muestra.
𝑦−𝑏
[𝑥] =
𝑚
1268,4 + 491,65
[𝑥] = = 548,302181 𝑚𝑔/𝐿
3,21
El área de la muestra se encuentra en el intervalo
entre el patrón 1 y 4, en el caso de no ser así no se
debe calcular la concentración de la muestra
pues se encontraría fuera del rango de calibración
y como se señaló antes, no se puede predecir el
resto del comportamiento de la curva.

La solución a esto puede ser diluir la muestra de tal

forma que si el valor de área calza dentro del
intervalo, sería posible calcular su concentración.
Se debe considerar que en este caso luego de
calcular la concentración, se debe multiplicar esta
por el factor de dilución.

Ejemplo de lo anterior:

En otras palabras, el residual significa que de los
puntos experimentales obtenidos se mide la
distancia vertical que hay entre el punto
experimental y el trazado.
Si se tiene una “muestra 2” con área 4528,2 se
deberá tomar un alícuota de 1 mL y llevarla a un
volumen final de 10 mL, por lo tanto, el coeficiente
de dilución sería 10. Luego se inyecta la dilución en
el HPLC, supondremos que tuvo un área de 452,4
la cual se encuentra dentro de la curva de
calibración, dado esto ya se puede calcular la
concentración de la muestra 2.
452,4 + 491,65
[𝑥] = = 294,096573 𝑚𝑔/𝐿
3,21

La anterior concentración corresponde a la

concentración de la muestra diluida, y esta se
debe multiplicar por el factor de dilución para
obtener la concentración de la muestra original, la
cual es:
[𝑥] = 2940,96573 𝑚𝑔/𝐿

Calibración simple (SPC, single point

calibration)
Esta calibración se utiliza asumiendo que existe
una linealidad en el rango en el que se encuentra
la concentración de una muestra.

En este procedimiento se compara la

concentración de une estándar de
concentración conocida y la muestra de
concentración desconocida.

Ejemplo:

Determinación de la concentración utilizando

SPC.

Concentración
n-C16 71,34441
n-C18 95,4555
n-C20 60,55123
n-C22 158,25794
n-C24 181,71681
IS 100 µg/mL

Al tener un compuesto (estándar que cumple la

condición de ser de la naturaleza de los
compuestos que se quieren determinar) con
identidad conocida, se pueden calcular las
concentraciones restantes usando la siguiente
relación lineal:
100 × 𝑦
[𝑥] =
4753
Clase 9, 20 de septiembre de 2021
Cromatografía: métodos de cuantificación
Validación de métodos
Linealidad del sistema de medición
La linealidad de la curva de calibración es un
requerimiento fundamental en la práctica del
análisis químico cuando se realizan curvas de
calibración.
En general la linealidad no se cuantifica, pero se
observa por simple inspección o mediante
pruebas significativas de no linealidad. La no
linealidad se elimina mediante la selección de un
intervalo de operación más restringido.
Se podría decir que en el origen (0,0) de la gráfica
al no haber una concentración la señal tiende a
cero, sin embargo, esto no es así debido a la
presencia de ruido instrumental que puede
generar señales. Por lo que las curvas de
calibración no comienzan en el origen sino en un
valor superior al umbral del ruido.
Existen dos formas para poder determinar el
umbral de ruido: limite de detección o limite de
cuantificación. El objetivo de esto es que
estadísticamente se pueda afirmar que lo que se
observe por sobre el umbral de ruido establecido
sea el analito.
Como ya se dijo, no se puede predecir el
comportamiento de lo que está fuera del rango
valido o rango lineal, aun cuando se haya
obtenido un R2 > 0,9. Así mismo fuera del rango no
es posible aplicar la ecuación de la recta para
calcular la concentración, ya que puede estar
involucrada otra función matemática
(exponencial, logarítmica, etc.).
Sensibilidad
La sensibilidad de método mide su capacidad
para discriminar entre pequeñas diferencias en la
concentración del analito.
Los factores que limitan la sensibilidad son:
• La pendiente de la curva de calibración
• La precisión del sistema de medida
Es importante señales que para determinar la
pendiente de la curva se considera únicamente el
intervalo lineal de la misma puesto que cuando la
curva pierde su linealidad la pendiente también es
diferente.
Por otra parte, es importante mencionar que, al
igual que la linealidad, también la pendiente de la
curva puede ser distinta para matrices diferentes;
esto significa que la pendiente de la curva
depende de todas las condiciones de medida y
que estas deben ser igual (o al menos similares)
para los estándares y la muestra problema.
Problema:
Si se tienen dos curvas de calibración que difieren
en su pendiente:
a) Según la apariencia de la curva ¿Qué método
es más sensible?
El grafico de la derecha es más sensible, pues el
cambio de señal en un rango, por ejemplo, de 1-5
es mucho más significativo que en la gráfica de la
izquierda.
En conclusión, en valores muy cercanos una alta
sensibilidad permite distinguir un cambio en la
respuesta.
Límite de detección (LD) corresponde al valor del promedio del blanco más
5, 6 o 10 veces la desviación estándar del mismo
En general este término se define como la mínima
(esta última es la más común).
concentración del analito detectable por el
método. Es importante hacer notar que ni LD ni el LC
representan niveles a los cuales sea imposible la
Su determinación es importante (particularmente
cuantificación del analito; el significado es que el
en análisis de trazas) pero los problemas asociados
LC representa la mínima concentración del analito
con ella son diversos; estos problemas han sido
que puede ser determinada con un aceptable
drásticamente estudiados y varios criterios de
nivel de incertidumbre.
decisión han sido propuestos.

Análisis trazas: análisis de concentraciones muy

bajas.

Aunque ninguno es universal uno de los más Ejemplo:

aceptables es el de la concentración que
correspondería a la medida del “promedio del
blanco + 3s”. El blanco es la señal emitida por el
instrumento con una disolución que contiene las
mismas especies que la muestra problema (pero
sin analito). Para fines de validación se considera
que deben hacerse 10 mediciones de blancos
independientes.

3s: 3 veces su desviación estándar al realizar la La segunda columna muestra los puntos de
medición de estos blancos. calibración.

De esta forma se obtiene cierta certeza analítica Determine los límites de detección y
de que sobre ese valor la señal corresponde a una cuantificación para el ejemplo anterior si:
señal analítica, mientras que bajo este hay altas
probabilidades que se confunda el ruido
instrumental con una señal analítica.

En el caso de la calibración simple no se posee

una curva de calibración, se tiene sólo un punto
dentro de un rango donde se espera que las
concentraciones sean lineales. En base a ese
punto se determina la concentración de los
analitos, el problema es que calcular LD es
prácticamente imposible debido a que el valor
“b” es imposible de obtener.

Por lo anterior, en calibración simple no se hace

uso del limite de detección en base a la
concentración, sino que se debe hacer en base a
Datos obtenidos:
cantidad cullo proceso se denomina cantidad
mínima detectable (MDA). Pendiente → 3,21

Límite de cuantificación (LC) Promedio del blanco → 57,52

Se define como la más pequeña concentración SD → 2,16

del analito que puede ser determinada con un
Respuesta:
nivel de exactitud y precisión aceptables.
LD → 19,93
Dependiendo del convenio utilizado se considera
como la concentración de analito que LC → 24,63
 Ejercicio: laboratorio y resultados para el cliente, en estos
últimos se debe reportar el valor negativo como
Concentración (ppm) Área “Muestra 2 < LD”. Lo mismo sucede con la
10 13582 concentración de la muestra 3. Por lo tanto,
30 35478 cualquier valor < 0,98 está bajo el límite de
70 74126 detección.
100 98527
En el caso de la muestra 4 se debe analizar que el
rango de calibración va de 10-100 y la
concentración obtenida es de 161,7, por lo tanto,
este valor se encuentra fuera del rango valido y se
está prediciendo el comportamiento de la curva
de calibración. Para solucionar esto se realiza una
dilución vista en la clase anterior, sin embargo
luego de diluir x2 se obtiene una concentración de
154,9 la cual se encuentra aún fuera del rango
lineal.

Datos obtenidos:

Pendiente → 943,95

Promedio del blanco → 582

SD → 114,20

Área muestra 1 → 574558

Área muestra 2 → 452

Área muestra 3 → 6021

Resultados de los cálculos:

LD → 0,98

LC → 1,83

Resultado de la concentración de la muestra 1:

Concentración → 54,7 ppm (>LD)

Resultado de la concentración de la muestra 2:

Concentración → -5,7 (<LD)

En este caso sucedió que el área es tan pequeña

que no alcanza a ser mayor que el intercepto, por
lo tanto, es un área muy cercana al ruido
instrumental.

Resultado de la concentración de la muestra 3:

Concentración → 0,2 (<LD)

Resultado de la concentración de la muestra 4:

Concentración → 161,7 (diluida x2)

Al diluir la muestra 4 tiene un área de 78965:

Concentración → 154,9

Los resultados obtenidos de la curva de

calibración pueden ser divididos en resultados de
Clase 10, 21 de septiembre de 2021

Ejercicios
Se inyectan 25 µL de un estándar de Flavonoides Estos valores fueron seleccionados y atribuidos a
las muestras debido a su similitud con los del
1. Determinar la cantidad de cada flavonoide
estándar (no necesariamente tienen que ser
inyectado (mg) si las concentraciones de
exactos).
cada estándar de flavonoide fueron de 2.5, 2.5
y 2.8 ppm respectivamente. 2. Determine la cantidad en mg de cada
flavonoide identificado en la muestra con los
Para resolver esto se usa análisis dimensional y se
estándares anteriores.
debe recordar que 1ppm=1mg/L.
𝑐𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟
2.5𝑚𝑔 1 × 10−6 𝐿 𝑋(𝑚𝑔) = ( ) × Á𝑟𝑒𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐴(𝑚𝑔) = × 25µ𝐿 × = 6,25 × 10−5 𝑚𝑔 Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟
1𝐿 1µ𝐿
6,25 × 10−5 𝑚𝑔
2.5𝑚𝑔 1 × 10−6 𝐿 𝐴(𝑚𝑔) = ( ) × 9242 = 3,76 × 10−6 𝑚𝑔
𝐵(𝑚𝑔) = × 25µ𝐿 × = 6,25 × 10−5 𝑚𝑔 155849
1𝐿 1µ𝐿
6,25 × 10−5 𝑚𝑔
2.8𝑚𝑔 1 × 10−6 𝐿 𝐵(𝑚𝑔) = ( ) × 17564 = 6,8 × 10−6 𝑚𝑔
𝐶(𝑚𝑔) = × 25µ𝐿 × = 7 × 10−5 𝑚𝑔 160882
1𝐿 1µ𝐿
7 × 10−5 𝑚𝑔
De acuerdo con el estándar de flavonoides: 𝐶(𝑚𝑔) = ( ) × 44495 = 2,78 × 10−5 𝑚𝑔
111883
Muestra Área TR
3. Si la muestra trabajada de miel fue de 1.2 g.
A 155849 12,845
Determine la concentración de cada
B 160882 14,55
flavonoide en mg/kg de miel.
C 111883 18,01
Sólo se deben transformar cantidades a
De acuerdo con resultado cromatográfico: concentraciones.

1. Identifique los flavonoides presentes en la 𝑚𝑔 3,76 × 10−6 𝑚𝑔 1000𝑔

𝐴( )= × = 3,1 × 10−3
muestra por su TR. 𝑘𝑔 1,2𝑔 1𝐾𝑔

Muestra Área TR 𝑚𝑔 6,8 × 10−6 𝑚𝑔 1000𝑔

𝐵( ) = × = 5,6 × 10−3
A 9242 12,873 𝑘𝑔 1,2𝑔 1𝐾𝑔
B 17564 14,552 𝑚𝑔 2,78 × 10−5 𝑚𝑔 1000𝑔
C 44495 18,020 𝐶( )= × = 2,3 × 10−2
𝑘𝑔 1,2𝑔 1𝐾𝑔
 HPLC: uso, equipamiento y mantención
Fase móvil: disolvente
En el caso de la cromatografía líquida, la fase
móvil de esta debe ser un disolvente de grado
cromatográfico, actualmente uno de los
distribuidores más importantes en este tipo de
insumos es Merk el cual posee una línea que se
llama “Lichsolv” que consiste en disolventes
preparados para cromatografía liquida y gaseosa.
Estos disolventes cumplen con características para
la mejor mantención de la instrumentación y la
columna cromatográfica.
Dado un tema de eliminación de material
particulado y purificación, normalmente los
disolventes de cromatografía líquida bien pre-
filtrados y sin compuestos que puedan disminuir la
transparencia de estos, respectivamente.
El UV-VIS es un tipo de detección utilizada en
cromatografía líquida, por lo tanto, para estos se
requiere eliminar compuestos que pueden tener
alguna absorción en esos rangos de forma que se
disminuya el ruido y aumente la transparencia del
disolvente. Lo ideal es que el disolvente sea lo más
transparente posible a las longitudes de onda
trabajadas.
Otra característica que se requiere es la
disminución de gases disueltos, para esto se realiza
un pretratamiento que consiste en la
desgasificación de la fase móvil utilizando, por
ejemplo:
• Ultrasonido
• Burbujeo con helio
La función del helio es mezclarse con el nitrógeno
y el dióxido de carbono que están disueltos en el
disolvente, de esta forma arrastrará y disminuirá la
concentración de estos dos gases.
Esto se realiza incluso si se está trabajando con
disolventes comerciales.
Ultrasonido:
La desgasificación por ultrasonido consiste en un
baño de ultrasonido el cual genera que las
moléculas de gases se juntes y puedan salir como
burbujas hacia la superficie.
Normalmente los disolventes entran al
cromatógrafo a través de botellas que
posee algún tipo de ventilación para evitar
que se produzca una presión negativa con
la succión de la bomba.
También se pueden comprar disolventes que ya
están preparados para extraerlos directamente
del mismo recipiente.
Por otro lado, se hace uso de fritas para los filtros
las cuales captan partículas que quedan en
suspensión por el uso continuado del disolvente de
forma que evitan que entren al flujo del equipo.
Desgasificación
Este proceso se realiza esencialmente cuando se
mezclan disolventes diferente tipo en el equipo, lo
cual produce burbujas.
Por lo tanto, unida a la desgasificación previa del
disolvente, también se realiza una desgasificación
en línea que permite eliminar los gases restantes
logrando una menor concentración de las
especies que absorben en el UV-VIS.
La desgasificación en línea se logra a través un
tubo que entra a una cámara de vacío, este tubo
es de carácter impermeable a los líquidos, pero
permeable a los gases. Este proceso es previo a la
entrada de la bomba de succión que se
encuentra antes de la entra del sistema.
Bomba
Como se dijo en clases anteriores, la bomba
consta de unos émbolos que van succionando el
líquido y lo van introduciendo al sistema
presurizado hacia la columna en donde se
produce la separación cromatográfica.
En el sistema existen válvulas
check in y cheack out las cuales
contienen bolitas de zafiro que se
encuentran dentro de una
cámara permitiendo que haya
una única dirección del flujo.
Cuando el flujo llega la bolita abre la válvula para
permitir el paso de este y cuando el líquido viene
de vuelta la válvula se cierra debido a que la
bolita tapa la salida.
La bolita de zafiro es un material bastante
resistente que puede cerrar eficientemente el
orificio de salida.

En la imagen anterior se muestra una bomba en
paralelo donde se encuentran dos cámaras de
inyección que ingresan líquido para evitar
variaciones de presión, esto significa que habrá 4
válvulas dos de check-in que son las de abajo y
dos de check out.
Estas válvulas requieren de mantención, cada una
de estas puede costar entre 200 a 300 mil pesos.
En el sistema de bombeo se encuentra el pistón el
cual posee un plangere con un sello). El sello
permite que el pistón entre y salga y de esta forma
se aumente la presión sin que el líquido se filtre.
Los sellos tienen una buena compatibilidad
química.
Ante la falla de alguna de estas cosas, por
ejemplo, las bolitas, se experimentan fenómenos
de vaivenes de presión los cuales consisten en una
bajada de la presión, la cual debería ser
constante, producto de la filtración de líquido a
través de la válvula.
Hay que recordar que hay detectores más
sensibles que otros a los cambios de presión.
Gradiente cuaternario
Lo más común en cromatografía es trabajar con
gradientes, para esto se destaca la diferencia
entre la cromatografía isocrática y la
cromatografía en gradiente.
Isocrática: las condiciones cromatográficas
permanecen constantes durante la separación.
En gradiente: las características de la elución se
van modificando durante la separación. En otras
palabras, se cambian las proporciones de la fase
móvil de tal forma que se permite aumentar la
ventana de polaridades.
Esta cromatografía en gradiente es posible
mediante válvulas solenoide que dejan entrar
líquido de una de las fuentes de las que la bomba
está succionando a un volumen fijo.
Aquí se muestra una válvula
solenoide de cuatro entradas,
razón por la cual se denomina
gradiente cuaternario; cada una
de las entradas se encuentra
unida a un disolvente diferente.
Por lo tanto, aunque la bomba esté
constantemente succionando las válvulas se
abren por cierta cantidad de tiempo una de las
entradas a la vez dejando pasar uno de los líquidos
de esta forma se permiten proporciones distintas
de cada líquido que se ven reflejadas en la fase
móvil.
En cuanto a proporciones se observa una mayor
proporción de A y una menor de B
Para lograr que los disolventes entren al sistema se
requiere de un mezclado pues las tuberías por las
que pasan los líquidos hacia la columna no son lo
suficientemente grandes por lo que estos no
alcanzan a homogeneizarse, generando de esta
forma una fase móvil no homogénea que no
cumpliría con el objetivo de obtener una
cromatografía eficiente.
El proceso anterior es realizado por una cámara
de mezclado (o mixter), esta da un volumen
suficiente a la fase móvil previo a que entre al
sistema cromatográfico.
Aquí se observa una cámara de mezclado de
shimatsu la cual es externa, se puede cambiar el
planning de la cámara para obtener diferentes
volúmenes, de esta forma se obtienen diferentes
tiempos de premezclado.
Cuando se hace uso de volúmenes mayores, la
homogenización será mejor, pero el tiempo es
mayor entre el cambio en el software y en la
columna, por ejemplo, si se está a 1 mL por minuto
y utilizando una cámara de mezclado de 2.6 mL
eso significa que va a demorar al menos 2.6
minutos en llegar esta nueva proporción a la
columna.
Tuberías PEEK
En las tuberías actualmente se prefiere utilizar el
PEEK que es un polímero especial que permite
tener una buena compatibilidad química, el único
problema con el PEEK son los disolventes clorados
que no son muy comunes en cromatografía
líquida, pero si se utilizan con algunas columnas. En
general las tuberías son flexibles y se pueden cortar
con facilidad.
En las tuberías PEEK se utilizan conexiones
denominadas finger time en donde se puede abrir
y cerrar con los dedos.
Tuberías de acero inoxidable
Al igual que las tuberías PEEK, las tuberías de acero
inoxidable tienen una buena compatibilidad
química. Además, son más resistentes a la presión
que las tuberías PEEK.
En las tuberías de acero inoxidable se utiliza férulas
las cuales se aprietan y quedan ahí para siempre.
Férulas
Los cortes enacero inoxidable deben ser muy
precisos y realizados con un cortador especial, al
haber un corte ineficiente puede generar
problemas de volúmenes muertos que se quedan
en las uniones
Se observan cortes en tubos de acero inoxidable,
haciendo comparación entre un corte industrial y
uno con lija.
En resumen:
Si se va a tener un equipo siempre de la misma
manera, es mejor usar un precableado con acero
inoxidable, pero si es un equipo al cual se le
realizan cambios de detectores o algún tipo de
movimiento, es mejor otro tipo de cableado.
Tuberías sílice fundida
Estas se ocupan bastante en cromatografía
líquida de volúmenes más pequeños, bajo 1
mL/minuto o aproximadamente 100 um/minuto.
En la imagen anterior se tiene una tubería PEEK
con un recubrimiento interno de vidrio (silica). Estos
tienen una buena compatibilidad química, pero
no es posible cortarlos por lo tanto vienen
preelaborados, y no son flexibles debido a que se
puede quebrar la silica.
Inyección manual
Aquí se presenta la inyección manual y la
inyección automática.
En la inyección manual entra una cantidad de
muestra a un tubo que se conoce como loop que
tiene un volumen preciso, este volumen a través
de un estator (válvula) puede ser arrastrado a la
fase móvil sin una perdida considerable de presión
dentro del sistema.
Normalmente se utilizan el tipo de jeringa
mostrada en la imagen anterior, en las cuales sus
puntas (no pinchan) están sementadas dentro de
la jeringa. Estas jeringas permiten tener un control
del volumen, considerando que lo ideal es
inyectar volúmenes fijos como los del loop pues
cuando se trata de volúmenes por jeringa suele
haber un error importante.
Previo a la inyección es importante realizar una
filtración, por ejemplo, con filtros de pirinola que
corresponden a filtros de jeringa en los cuales se
pone la muestra directamente al vial con filtros de
0,2 um, de esta forma de elimina cualquier
material particulado que pueda generar
problemas en el proceso cromatográfico.
En este sistema de inyección hay una perilla con la
cual se puede mover desde la posición de
inyección lo cual es a través del estator que une
los circuitos de líquido y puede hacer que la fase
móvil arrastre la muestra.
Normalmente se encuentran sistemas que tienen
órdenes de volumen de muestra de 5, 10 o 20
microlitros que se usan normalmente en columnas
analíticas, también se van a encontrar loop
mucho mayores del orden de 100 y 200 microlitros,
incluso se encuentran del orden de mililitros. Lo
anterior depende de los volúmenes de flujo y del
tipo de HPLC que se esté utilizando.
Inyección automática
La inyección automática es bastante parecida a
la inyección manual, considerando algunos
requisitos para que pueda ser más eficiente. En
este proceso se puede inyectar sin necesidad se
que esté el operador presente por lo que se puede
hacer un box de inyecciones, donde va una tras
otras bajo ciertas condiciones preestablecidas.
El sistema de inyección
se hace a través de una
bomba similar a las de
HPLC, pero estas son de
volumen menores lo que
permite inyecciones de
volúmenes variables. El
poder tener volúmenes
variables permite realizar
curvas de calibración con diferentes volúmenes
de la misma solución y no hacer diferentes
soluciones con volúmenes constantes.
Hay sistemas de inyección donde se tiene una
cantidad de muestras que se van a medir siendo
hasta el orden de 60-70 muestras. También hay
sistemas de jaitubjskajsa (no entiendo sus weás)
que son de procesos de mucho más volumen
donde se pueden hacer inyecciones para que el
sistema esté continuamente trabajando semanas
sin parar.
Se tienen sistemas intercambiables donde el
inyector manual va sacando diferentes racks
dentro de un sistema de racks para hacer
inyecciones consecutivas.
Horno columna
Para que el proceso cromatográfico sea lo más
eficiente posible se utiliza algún tipo de control de
temperatura y ahí lo más común es usar hornos
que sólo calientan o que calienta y enfrían, esto
permite mantener una temperatura constante y
que no haya variaciones en los tiempos de
retención producto de las variaciones de
temperatura ambiental.
Estos hornos también permiten acceder a
temperaturas que no son las normales y por lo
tanto hacer cromatografías con temperaturas
distintas a la ambiental.
En el horno se pueden tener diferentes columnas e
incluso válvulas que permiten que las sustancias
puedan entrar, lo cual está controlado por
software, de forma que puedan entrar a las
diferentes columnas a través de estas válvulas y así
evitar estar cambiando de columnas
constantemente.
En esta imagen se puede observar un cambio
importante de la cromatografía en función de la
temperatura; el aumento de temperatura puede
hacer que la cromatografía sea más eficiente en
el tiempo.
Detección UV-VIS
Luego de que se produce la
separación cromatográfica está la
detección UV (arreglos de diodos o
detectores de fluorescencia) usan
celdas de flujo la cual tiene una
entrada y salida, en la entra el líquido
es expuesto a la luz, al
fotomultiplicador, etc. para poder ir
midiendo la absorbancia de la muestra que va
pasando. Dentro de la celda de flujo van a haber
ventanas de cuarzo (se pueden corroer en el
tiempo o romperse por la presión) que posee sellos
internos los cuales se desgastan con el tiempo y
pueden generar filtraciones.
una cierta cantidad de oxígeno que favorezca la
oxidación.
Una de las cosas que se utiliza en la detección de
masas es la bomba de vacío que es la que permite
que la bomba interna turbo molecular lleve al
sistema al vacío que requiere la espectrometría de
masas, el cual es del orden de 10-4 thor de vacío
(presión interna).

La bomba interna turbo molecular requiere de un

vacío previo de 10-2 thor para poder funcionar, y
es la bomba de aceite rotatoria quien lo otorga.
La bomba de aceite motora requiere de aceite
En el detector shimatsu hay un abajada que lleva para lubricarse, esta así mismo se va llenando de
a unos detectores de salida o filtración de líquido los disolventes que se van volatizando durante el
los cuales activan una alarma cortando el flujo del proceso de ionización, por lo tanto, es esencial
sistema evitando problemas mayores. hacer una purga de los disolventes que quedan
en el aceite para evitar que se deterioren las
Para estos detectores se requiere una lampara la
partes internas o que el aceite tenga una corta
cual puede ser de deuterio o wolframio, para
vida.
poder trabajar el UV-VIS
La purga se realiza mediante la apertura de una
La lampara de deuterio llega hasta los 800 nm
válvula especial que se llama gas balas la cual
mientras que la de wolframio llega a los 1000 nm.
permite que los gases que están en el aceite
Estas generan luz en una orientación particular lo puedan salir.
que facilita su instalación.
Desechos líquidos
Detección de masas Una vez que se hizo todo el proceso de
En esta se va a tener un cromatografía, detección, etc. siempre habrá una
equipo que va a utilizar parte del volumen que va a terminar en desechos
una sonada de incluso en la espectrometría de masa que sólo
ionización (sonda esi o ocupa una fracción del volumen. Estos líquidos se
apsi) las cuales permiten deben llevar a un contenedor, lo ideal es utilizar
el cromatógrafo líquido recipientes especializados, por ejemplo,
con una fuente de iones permitiendo que los líquidos entren y no se
que pueda detectar mediante la detección de evaporen, dejando cerrados con una ventilación
masas. controlada, etc.

Dentro del equipo, la

mantención se realiza
esencialmente al cono de
extracción, y el líquido que
entra por la sonda es
vaporizado por esta misma
donde se produce un spray el
cual genera iones
que luego entran
hacia el detector
y sólo los iones que tienen una carga
especifica son absorbidos por el cono de iones.

Uno de los insumos que tiene el detector de masas

es gas (normalmente nitrógeno), comúnmente un
generador de nitrógeno; el volumen de nitrógeno
que se utiliza es bastante alto y no se requiere una
alta pureza de este, pero es importante que tenga