Clasificación de los métodos de separación en

cromatografía
Las distintas técnicas cromatográficas se pueden dividir según distintos parámetros a
considerar

SEGÚN CÓMO ESTÉ DISPUESTA LA FASE ESTACIONARIA:

CROMATOGRAFÍA PLANA

La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales
técnicas son:

Cromatografía en papel

En la cromatografía sobre papel, las interacciones del soluto con el papel hacen que los
compuestos se desplacen a velocidades diferentes.

Una pequeña mancha de disolución que contiene la muestra se aplica sobre una tira de papel
cromatográfico a una distancia aproximada de un centímetro de la base. La muestra es
adsorbida en el papel. Esto significa que la muestra entra en contacto con el papel y puede
establecer interacciones. El papel es sumergido en un disolvente adecuado (etanol o agua) e
introducido en un contenedor cerrado. A medida que el disolvente asciende por el papel,
encuentra la muestra que empieza a viajar por el papel con el disolvente. Los diferentes
compuestos de la muestra recorren distancias diferentes dependiendo de la fuerza de sus
interacciones químicas con el papel. La cromatografía en papel requiere algún tiempo,
habitualmente se necesitan varias horas para completarse.

El cromatograma final puede ser comparado con otros de mezclas conocidas a fin de
identificar los componentes de la muestra. La cromatografía en papel de dos dimensiones
consiste en desarrollar el cromatograma en un disolvente, girar el papel 90º y desarrollar el
cromatograma en un disolvente diferente. Es útil para separar mezclas complejas de
compuestos similares.

Actualmente, la cromatografía en papel se utiliza poco y ha sido ampliamente reemplazada

por la cromatografía en capa fina. No obstante, todavía se utiliza como una poderosa
herramienta pedagógica.

Cromatografía en capa fina

La fase estacionaria es una capa uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa,
la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. En cromatografía en capa fina se
utiliza una placa cromatográfica inmersa verticalmente ; La placa cromatográfica consiste
en una fase estacionaria polar (comúnmente se utiliza sílica gel) adherida a una superficie
sólida . Para realizar la CCF, se debe apoyar la placa cromatográfica sobre algún
recipiente o cámara que contenga la fase líquida de aproximadamente 1 cm (la distancia
entre el principio de la placa y la muestra que se desea analizar).

Los productos a examinar se disolverán, cuando sea posible, en un disolvente orgánico

que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore después de
la aplicación, lo más común es usar acetona. Frecuentemente se emplean disoluciones al
1 %, de manera que al aplicar 2 ml resulta en la carga 20 mg de producto sólido. Muchos
reactivos de revelado llegan a detectar 0.1 mg de material; por esto con esta carga puede
llegarse a observar un 5 % de impurezas.

Existen una gran variedad de micro pipetas y micro jeringuillas para realizar el proceso de
siembra de la muestra a analizar. También pueden usarse tubos capilares. El proceso de
siembra se realiza tocando con la punta del capilar (micro pipeta, etc) sobre la placa
preparada. Dejando una distancia al borde inferior de un centímetro aproximadamente. El
punto de aplicación de la muestra se denomina toque.

Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la
placa solo quedará la muestra a analizar. se anota en el cuaderno la identidad del eluyente
y la relación de los dos, o más que se hayan utilizado.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna. Según el fluido empleado como fase
móvil se distinguen:

Cromatografía de líquidos

Es una técnica de separación y no debe confundirse con una técnica cuantitativa o

cualitativa de análisis. Es una de las técnicas analíticas ampliamente utilizadas, la cual
permite separar físicamente los distintos componentes de una solución por la adsorción
selectiva de los constituyentes de una mezcla. En toda cromatografía existe un contacto
entre dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una móvil (fase móvil) que
fluye permanente durante el análisis, y que en este caso es un líquido o mezcla de varios
líquidos. La fase estacionaria por su parte puede ser alúmina, sílice o resinas de
intercambio iónico que se encuentran disponibles en el mercado. Los intercambiadores
iónicos son matrices sólidas que contienen sitios activos (también llamados grupos
ionogénicos) con carga electrostática (positiva o negativa). De esta forma, la muestra
queda retenida sobre el soporte sólido por afinidad electrostática. Dependiendo de la
relación carga/tamaño unos constituyentes de la mezcla serán retenidos con mayor fuerza
sobre el soporte sólido que otros, es decir serán adsorbidos, lo que provocará su
separación. Las sustancias que permanecen más tiempo libres en la fase senil, avanzan
más rápidamente con el fluir de la misma y las que quedan más unidas a la fase
estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarán más en salir o fluir. Éste es el
principio fundamental de la cromatografía. Un ejemplo notable es la cromatografía de
intercambio iónico. Las columnas más utilizadas son las de sílice.

é== Métodos de cromatografía líquida ==

Método Abreviatura Mecanismo predominante

Líquido, sólido o
LSC Adsorción sobre la superficie
de adsorción

Reparto entre fases líquidas, una móvil y la otra

Líquido LLC
estacionaria.

Fase enlazada BPC Reparto y / o adsorción entre las fases móvil y enlazada.

Uso de la estructura de ligantes inmovilizados para unir

Afinidad --
bioselectivamente la proteína deseada.

Cromatografía de gases

Es una técnica cromatográfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza

de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de
gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no interactúa con
las moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la
columna.

Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC): la cromatografía gas-sólido (GSC) y la

cromatografía gas-líquido (GLC), siendo esta última la que se utiliza más ampliamente, y
que se puede llamar simplemente cromatografía de gases (GC). En la GSC la fase
estacionaria es sólida y la retención de los analitos en ella se produce mediante el proceso
de adsorción. Precisamente este proceso de adsorción, que no es lineal, es el que ha
provocado que este tipo de cromatografía tenga aplicación limitada, ya que la retención del
analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elución con colas. Su
única aplicación es la separación de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC
utiliza como fase estacionaria moléculas de líquido inmovilizadas sobre la superficie de un
sólido inerte.
La GC se lleva a cabo en un cromatógrafo de liquidos. Éste consta de diversos
componentes como el gas portador, el sistema de inyección de muestra, la columna
(generalmente dentro de un horno), y el detector.

Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC)

Es una técnica híbrida entre la cromatografía de gases (GC) y la HPLC, que combina
lo mejor de ambas técnicas. Esta técnica es importante porque permite la separación
de mezclas en las que no es adecuada la aplicación de la GC ni de la HPLC. En
concreto, se aplica a compuestos no volátiles o térmicamente inestables que no
pueden ser separados mediante GC, o aquellos que contienen grupos funcionales que
imposibilitan su detección en HPLC.

Fase
Tipos Fase estacionaria
móvil

Cromatografía en
Líquido Papel de celulosa.
papel

Cromatografía en
Líquido Gel de sílice o alúmina.
capa fina

Columnas capilares de sílice fundida, columnas

Cromatografía de
Gas empacadas con tierras diatomeas hechas de tubos de
gases
vidrio o metal.

Cromatografía
Líquido
líquida Empaques de siloxano de octilo o siloxano de octadecilo.
(polar)
en fase reversa

Cromatografía Líquido
Empaques de sílice, alúmina o un soporte al que se unen
líquida (menos
químicamente grupos polares (ciano, amino, etc).
en fase normal polar)

Cromatografía
líquida Líquido
Resinas de intercambio iónico.
de intercambio (polar)
iónico

Cromatografía
Empaques de pequeñas partículas de sílice o polímeros
líquida Líquido
con red de poros uniforme.
de exclusión
 Cromatografía
líquida Líquido Partículas finamente divididas de sílice o de alúmina.
de adsorción

Cromatografía de Columnas abiertas de sílice fundida con recubrimientos

fluidos Líquido internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de
supercríticos enlaces cruzados.