técnicas histológicas

Generalidades de las técnicas utilizadas en histología

Histología (histos = tejidos; logía = ciencia), también llamada de anatomía microscópica,
es el estudio científico de las estructuras microscópicas de los tejidos y órganos del
cuerpo.

La mayor parte de los contenidos se puede formular en términos de la microscopia

óptica.

Anteriormente, se realizaba una interpretación más detallada de la microanatomia con un

microscopio electrónico (ME) - tanto con el microscopio electrónico de transmisión
(MET) como con el microscopio electrónico de barrido (MEB).

Hoy, el microscopio de fuerza atómica (MFA) también puede proporcionar imágenes de

alta resolución que son mejores que las obtenidas a través del MET.

Microscopio electrónico Microscopio de Fuerza Atómica

PREPARACIÓN DEL T EJ IDO
Tinción con hematoxilina y eosina con jación en formalina
El corte de rutina teñido con HEMATOXILINA y EOSINA (H&E) es la muestra que se
utiliza con mayor frecuencia.

El grupo de preparados que se entrega el estudiante junto con el microscopio óptico

contiene por lo general muestras fijadas en formalina, incluidas en parafina y coloreadas
con hematoxilina y eosina (H&E).

As veces se utilizan otras técnicas de tinción para mostrar componentes específico de las
células y los tejidos.

El primer paso en la preparación de una muestra de tejido u órgano es la fijación

para conservar la esctructura.

La fijación, obtenida mediante una sustancia química o una mezcla de sustancias

químicas, conserva de forma permanente la estructura del tejido para tratamientos
posteriores.

Las muestras deben sumergirse en el fijador inmediatamente después de extraerse del

organismo. La fijación se utiliza para:

• Abolir el metabolismo celular

• Impedir la degradación enzimática de las células y tejidos por autólisis (autodigestión)
• Destruir microorganismos patógenos tales como bacterias, hongos o virus
• Endurecer el tejido como resultado de la formación de enlaces cruzados o de la
desnaturalización de moléculas proteicas
La fijación más común es la formalina (formol 10%), una solución acuosa en diluciones
variadas y en combinación con otras sustancias químicas y amortiguadoras (buffers).

El formaldehído reacciona con los grupos amino de las proteínas.

Debido a que el no altera su estructura tridimensional de forma significativa.

La muestra debe quedar en mínimo 24 horas en el fijador.

En el segundo paso, la muestra se dispone para su inclusión en parafina con el

fin de permitir su corte.

Para examinar una muestra se requiere de su infiltración con un medio de inclusión

que permita realizar corte muy delgados, por lo general en el rango de 5 a 15 micrón (1
micrón equivale a una milésima parte de un milímetro [mm]).

Después de la fijación la muestra se lava y se deshidrata en una serie de soluciones

alcohólicas de concentración creciente hasta alcanzar alcohol al 100%.

En el paso siguiente, el aclarado, se utilizan solventes orgánicos tales como el xileno o

tolueno que son miscibles tanto en alcohol como en parafinas, para extraer el alcohol
antes de la infiltración de la muestra con la parafina fundida.

Cuando la parafina fundida se ha enfriado y endurecido, se empareja para formar un

bloque de tamaño adecuado. Este bloque se coloca en una máquina cortadora especial,
el micrótomo que lo corta en rebanadas finas como una cuchilla de acero.

Los cortes obtenidos se montan sobre portaobjetos de vidrio utilizando un medio de

montaje (pineno o resinas de acrílico como adhesivo.
En el tercer paso, la muestra se tiñe para permitir su examen

Debido a que los cortes en parafina son incoloros, la muestra todavía no está lista para
su examen bajo el microscopio óptico.

Para colorear o teñir los cortes histológicos, la parafina debe disolverse y extraerse, con
xileno o tolueno y los tejidos deben rehidratarse mediante el uso se una serie de
soluciones de alcohol de concentración decreciente.

Después, el tejido sobre el portaobjetos se tiñe con hematoxilina en agua.

Debido que el colorante de contraste, la eosina, es más soluble en alcohol que en

agua, se vuelve a deshidratar la muestra a través de una serie de soluciones alcoholicas
de concentracion creciente y después se tiñe con eosina en alcohol.

Después de la tinción, la muestra se pasa por xileno o tolueno y se coloca en medio

de montaje no acuoso antes de cubrirla con un cubreobjetos para obtener un preparado
permanente.

Otros jadores

La formalina no preserva todos los componentes de las células y los tejidos.

Las muestras fijadas en formalina son convenientes porque muestran las características
estructurales generales, y no es específica para dilucidar la composición química de los
elementos celulares.

Además, muchos componentes se pierden durante la preparación de la muestra.

Para retener estos componentes y estructuras, se deben utilizar otras técnicas de

fijación.

Estas técnicas se fundamentan en un conocimiento de la química involucrada. Por

ejemplo, los alcoholes y solventes orgánicos que se usan en preparados de rutina
diluyen los lípidos neutros.

Para conservar los lípidos neutros se deben utilizar cortes por congelación de tejidos
fijados en formalina y colorantes que se disuelvan en grasas.

Para conservar las estructuras de la membrana, se utilizan fijadores especiales con

metales pesados, como permanganato y osmio, que se unen a los fosfolipídos.
Otras técnicas de tinción

La hematoxilina y la eosina se utilizan principalmente para poner en evidencia

las características estructurales.

La tinción con H&E no permite ver de forma adecuada ciertos componentes

estructurales de los cortes histológicos tales como elastina, fibras reticulares, membrana
basales y lípidos.

Cuando se desea estudiar estos componentes, se pueden utilizar otros procedimientos

de tinción.

Estos procedimientos incluyen el uso de orceína y fucsina (resorcina) para material

elástico y la impregnación argénica para fibras reticulares y las membranas
basales.

Pese que no siempre se comprende el fundamento químico de muchas técnicas de

tinción, estos procedimientos sirven.

Es más importante saber los que el método permite observar que conocer su
funcionamiento.

Fibras elásticas
HIST OQUÍMICA Y CIT OQUÍMICA
LOS PROCEDIMIENTOS QUÍMICOS ESPECÍFICOS PUEDEN PROVEER INFORMACIÓN
ACERCA DE LA FUNCIÓN DE LAS CÉLULAS Y DE LOS COMPONENTES
EXTRACELULARES DE LOS TEJIDOS.

Los procedimientos histoquímicos y citoquimicos pueden tener su fundamento en la

unión específica de un colorante, en el uso de anticuerpos marcados con un
colorante fluorescente con un componente celular en particular o en la anctividade
enzimática inherente de un elemento constitutivo de la célula.

Además, muchas macromoléculas presentes en las células pueden detectarse mediante la

autorradiografia, en la cual precursores moleculares marcados radiactivamente se
incorporan en las células y en el tejidos antes de la fijación.

Composición química de las muestras histológicas

La composición química de un tejido listo para una tinción de rutina difiere de la

del tejido vivo.

Los componentes que perduran después de la fijación son principalmente moléculas

grandes que no se disuelven con facilidad, en especial después de aplicar el fijador.

Estas moléculas, en particular las que reaccionan con otras moléculas semejantes para
formar complejos macromoleculares, son las que suelen conservarse en un corte
histológico.

Ejemplos de complejos macromolecualres grandes:

• Nucleoproteínas, formadas a partir de ácidos nucleicos unidos a proteínas;

• Proteínas intracelulares del citoesqueleto, en complejo con proteínas asociadas;
• Proteínas extracelulares, en grandes aglomeraciones insolubles, unidas a moléculas
similares mediante enlaces cruzados de moléculas vecinas, como ocurre en las

formación de las fibras de colágeno;

• Complejos de fosfolípidos y proteínas (o hidratos de carbono) en las membranas.

Estas moléculas constituyen la estructura de las células y los tejidos; es decir, son los
elementos morfógenos hísticos. Son la base de la organización del tejido que se
observa con el microscopio.

En muchos casos, un elemento estructural también es un elemento funcional. Por

ejemplo, las proteínas que forman los filamentos contráctiles de las células musculares,
son los componentes estructurales visibles y además participan del proceso de
contracción (funcional). El ARN del citoplasma es estructural y es también el
participante activo en las síntesis de proteínas (funcional).

Muchos de los componentes de los tejidos se pierden durante la preparación de

rutina de los cortes teñidos con H&E.

Las proteínas pequeñas y los ácidos nucleicos pequeños, como los ARN de transferencia,
en general se pierden durante la preparación del tejido.

También pueden perderse otras moléculas grandes, por ejemplo, al ser hidrolizadas
como consecuencia del pH desfavorable de las soluciones fijadoras.

Ejemplos de moléculas que se pierden durante la fijación de rutina en fijadores

acuosos:

• Glucógeno (hidrato de carbono intracelular común en el hígado y las células

musculares
• Proteuglucanos y glucosaminoglucanos (hidratos de carbono complejos extracelulares
que se encuentran en el tejido conjuntivo).

Sin embargos, estas moléculas pueden conservarse utilizando fijadores no acuosos para
el glucógeno o añadiendo agentes ligadores especiales a la solución fijadora que
preserven las moléculas extracelulares que contienen hidratos de carbono.

Los componentes solubles, iones y moléculas pequeñas también se pierden

durante la preparación de muestras de parafina.

Metabolitos intermedios, glucosa, sodio, cloro y sustancias similares se pierden durante

la preparación de muestras de rutina en parafina teñidas con H&E.
Estos iones y pequeñas moléculas no constituyen los elementos morfógenos del tejido;
participan de un proceso de síntesis o reacciones celulares.

Cuando pueden conservarse utilizando técnicas específicas, aportan información muy

valiosa sobre el metabolismo celular, transporte activo y otros procesos vitales de las
células.

El agua, una molécula muy versátil, participa en estas reacciones y procesos y

contribuye a estabilizar la estructura macromolecular a través de enlaces de hidrógeno.

Fundamentos químicos de la tinción

Colorantes ácidos y básicos

La hematoxilina y la eosina (H&E) son los colorantes de uso más frecuente en la

histología

Un colorante ácido, como la eosina, tiene una carga neta negativa en su parte
coloreada y se la describe con la fórmula general [Na+ anilina-].

Un colorante básico, tiene una carga neta positiva en su parte coloreada y se lo

describe con la fórmula [anilina+ Cl-].

La hematoxilina nos es exactamente un colorante básico, pero tiene propiedades muy

semejantes a las de los colorantes básicos.

Los colorantes básicos reaccionan con los componentes aniónicos de las células
y de los tejidos (componentes que tienen una carga neta negativa).

Los componentes aniónicos incluyen el grupo fosfato de los ácidos nucleicos, los
grupos sulfato de los glucosaminoglucanos y los grupos carboxilo de las proteínas.

La capacidad de estos grupos aniónicos de reaccionar con una anilina o

colorante básico se denomina BASOFILIA.

Los componentes del tejido que se tiñen con la hematoxilina también exhiben basofilia.
Como ya se mencionó, la
hematoxilina nos es un colorante
básico. Se usa con un mordiente (es
decir, un intermediario entre el
componente del tejido y la anilina). El
mordiente hace con que la tinción se
parezca a un colorante básico.

La hematoxilina se presta para

aquellos procedimientos tintoriales en
los que a ella se sigue soluciones
acuosas de colorantes ácidos.

Los colorantes ácidos reaccionan con los grupos catiónicos en las células y los
tejidos; en particular, con los grupos amino ionizados de las proteínas.

La reacción de los grupos catiónicos con un colorante ácido recibe el nombre de

acidofilia.

Si bien el enlace electrostático es el factor principal en la unión primaria de un

colorante ácido con el tejido, no es el único; debido a ello, los colorantes ácidos a
veces se utilizan combinados para teñir selectivamente distintos componentes de los
teñidos.

Por ejemplo, en la técnica de teñido de Mallory, se utilizan três colorantes acidos:

anilina azul, fuscina ácida y naranja G.
Estos colorantes tienen en forma selectiva el
colágeno, el citoplasma en general y los
eritrócito, respectivamente.

La fuscina ácida también tiñen los núcleos.

En otras técnicas con anilinas ácidas múltiples,

la hematoxilina se utiliza para teñir primero los
núcleos y luego se aplican los colorantes ácidos
para teñir selectivamente el citoplasma y las
fibras extracelulares.
Una cantidad limitada de sustancias dentro de las células y en la matriz
extracelular presenta basofilia.

Entre estas sustancias incluyen:

• Heterocromatina y nucléolos del núcleo (principalmente por los grupos fosfato ionizados
en los ácidos nucleicos de ambos),
• Componentes citoplasmáticos como el ergastoplasma (también por los grupos fosfato
ionizados en el ARN ribosómico) y
• Materiales extracelulares como los hidratos de carbono complejos de la matriz del
cartílago (por los grupos sulfato ionizados).

La tinción con colorantes ácidos es menos específica, pero más sustancias

dentro de las células y en la matriz extracelular presentan acidofilia.

Entre estas sustancias se incluyen:

• La mayor parte de los filamentos citoplasmáticos, en especial los de las células

musculares;
• La mayoría de los componentes membranoso intracelulares y la mayor parte del
citoplasma no especializado, y
• La mayor parte de las fibras extracelulares (principalmente a causa de grupos
amino ionizados).
MICROSCOPIA

Microscopia óptica

Un microscopio, ya que sea simple (una sola lente) o compuesto (lentes múltiples), es un
instrumento que amplifica una imagen y permite ver más detalles de lo que es posible a
simple vista.

El poder de resolución es la capacidad de una lente de microscopio o sistema

óptico para obtener imágenes separadas de objetos que están muy cerca unos de
otros.

La resolución depende no sólo del sistema óptico, sino también de la longitud de onda
de luz y de otros factores como el espesor de la muestra, la calidad de fijación y la
intensidad de la tinción.

El microscopio más utilizado por la mayor parte de los estudiantes e

investigadores es el microscopio de campo claro.

Los componentes del microscopio de campo claro son los siguientes:

• Fuente luminosa para iluminación de la muestra (una lámpara en la base del
microscopio,
• Lente condensador para enfocar el haz de luz a la altura de la muestra,
• Platina sobre la que se coloca el portaobjetos,
• Lente objetivo para recoger la luz que ha atravesado la muestra y
• Lente ocular (o un par de lentes oculares en los microscopios binoculares, de uso
más común) a través de la cual se puede examinar discretamente la imagen formada
por la lente de objetivo.
Examen de un preparado histológico con el microscopio óptico

Toda muestra de preparado para su examen por microscopia óptica debe cortarse en
rebanadas muy finas.

Por tanto, una muestra tridimensional de tejido se obtienen cortes bidimensionales.

Al examinar un corte dado a través de una

naranja, es importante ser capaz de
reconstruir mentalmente la organización de la
estructura y de sus componentes.