FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

LABORATORIO DE GENÉTICA

CÁTEDRA DE GENÉTICA BÁSICA

GUÍA DE PRÁCTICAS PRIMER SEMESTRE

PRÁCTICA N° 1
TEMA: Técnicas e instrumentos en diagnóstico genético

AUTOR: Dra. Carmen A. Salvador Pinos

Mtr. María Eugenia Sánchez
Msc. Juan Carlos Jácome
Práctica N° 1
Tema Técnicas e instrumentos en diagnóstico genético
Propósito/ objetivo Describir las técnicas genéticas utilizadas para diagnóstico
general clínico
Resultados de Comprende los procesos de cada una de las técnicas genéticas
aprendizaje 1
Resultados de Describe con responsabilidad la utilización de las técnicas
aprendizaje 2 genéticas
Comprende las técnicas genéticas que requiere emplear
Resultados de
dependiendo del diagnóstico que desea realizar (cromosómico,
aprendizaje 3
genético, genómico).
Material on-line Links, Biblioteca Virtual
Material que
Kit de extracción de ADN, pipetas y puntas, tubos de
provee la cátedra o
recolección de sangre.
el laboratorio

A) Procedimiento en el laboratorio presencial (solo si aplica), en adelante cada

vez que se referencie al “protocolo” se utiliza el del siguiente link:
https://assets.thermofisher.com/TFS-
Assets/LSG/manuals/purelink_genomic_man.pdf

Paso Procedimiento
Muestra El protocolo necesita de ciertas cantidades de muestras para
iniciar, por lo que hay que asegurarse de tener la cantidad de
muestra solicitada en el protocolo:

• Células y tejidos: 5x106, 25mg tejido

• Sangre 5-10ul de sangre nucleada
• Bacteria 2x109
• Levadura 5x107

En este caso usaremos muestras sanguíneas.

Lisado La lisis que muestra en el protocolo es diferente en función de las
muestras que usemos, debido a la naturaleza de las células que
hay que romper. Por ejemplo, el proceso de lisis para bacterias
gran negativas y levaduras es más fuerte que el usado para células
sanguíneas, ya que tienen paredes celulares resistentes.

El proceso de lisis indicado aquí es para muestras sanguíneas

frescas:

1. Coloque un baño de agua o un bloque de calor a 55 ° C. A un

tubo de microcentrífuga estéril, agregue ≤200 μL de muestra
de sangre fresca (si usa <200 μL de muestra de sangre, ajuste
el volumen de muestra a 200 μL con PBS). Para procesar
muestras de sangre >200 μL y ≤1 mL, aumente todos los
volúmenes de reactivo en consecuencia.
2. Añada 20 μL de proteinasa K a la muestra.
 3. Añada 20 μL de RNasa a la muestra, mezcle bien con un
vórtex breve e incube a temperatura ambiente durante 2
minutos.
4. Añada 200 μL de Genomic Lysis/Binding Buffer y mezcle
bien con vórtex para obtener una solución homogénea.
5. Incubar a 55 ° C durante 10 minutos para promover la
digestión de proteínas.
6. Añada 200 μL de etanol al 96-100% al lisado. Mezclar bien
agitando en vórtex durante 5 segundos para producir una
solución homogénea.
Fijación A partir de aquí todo el procedimiento es igual para cualquier tipo
de muestra

1. Extraiga del paquete una columna de centrifugado y colocar

en un tubo de recolección.
2. Cargar ~640ul del lisado en la columna
3. Centrifugar la columna a 10000g x 1 min
4. Descartar el tubo de recolección y colocar uno nuevo

Lavado En algunos kits se tiene que preparar los reactivos antes de usar.
En este caso se debe preparar el PureLink® Genomic Wash
Buffer 1 y PureLink® Genomic Wash Buffer 2, añadiendo etanol
al 96–100% a de acuerdo con las instrucciones que están en la
ETIQUETA. Ahora se puede proseguir con el lavado.

1. Añada 500 μL de Genomic Wash Buffer 1 preparado con

etanol
2. Centrifugar la columna a temperatura ambiente a 10.000 × g
durante 1 minuto.
3. Deseche el tubo de recolección y coloque la columna de
centrifugado en un tubo de recolección nuevo.
4. Añada 500 μL de Genomic Wash Buffer 2 preparado con
etanol a la columna.
5. Centrifugue la columna a velocidad máxima durante 3
minutos a temperatura ambiente. Deseche el tubo de
recolección
6. Colocar la columna en un tubo de 1.5ml
Elución 1. Agregue de 25 a 100 μL de tampón de elución genómico
2. Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto.
Centrifugue la columna a velocidad máxima durante 1
minuto a temperatura ambiente. EL TUBO CONTIENE
ADN PURIFICADO.
3. Para recuperar más ADN, realice un segundo paso de elución
utilizando el mismo volumen de tampón de elución que la
primera elución en otro tubo de microcentrífuga estéril de 1.5
ml. (OPCIONAL).
Almacenamiento • Almacene el ADN purificado a –20 ° C
• Para evitar la congelación y descongelación repetidas del
ADN, almacene el ADN purificado a 4 ° C para su uso
inmediato o tome alícuotas del ADN.
 B) Procedimiento para practica de laboratorio en línea

1. Ver los videos

PCR: https://www.youtube.com/watch?v=mslMRgxbdOA
Electroforesis https://www.youtube.com/watch?v=U1g2qt3juZw
Sanger https://www.youtube.com/watch?v=1JfHNedZUxU&t=109s
Secuenciacion por síntesis https://www.youtube.com/watch?v=BimurK8vlYc
Micromatriz https://www.youtube.com/watch?v=16V1q4nctdg

2. Explicación en clase sobre técnicas genéticas y la aplicación de las mismas en

Ciencias de la Salud
3. Resolver ejercicios sobre paternidad

A.- Ruta para el estudio

1.1.Lee los links enviados
1.2.Observa los videos enviados
1.3.Interactúa con el docente en la clase
1.4.El docente evalúa lo leído y observado a través preguntas.
1.5.Se expone la clase virtual presencial. Preguntas de los alumnos durante la clase.
1.6.Explicar los deberes para realizarlos en casa y subirlos on-line.

Requisitos teóricos

1. Extracción de ácidos nucleicos:

El primer paso en cualquier análisis genético molecular es la extracción y purificación

de ácidos nucleicos como el ADN. El ácido desoxirribonucleico (ADN) es una
macromolécula que está constituida por: un grupo fosfato, un monosacárido del tipo
pentosa (la desoxirribosa), y una base nitrogenada cíclica, que puede ser una purina
[adenina (A) o guanina (G)] o una pirimidina [citocina (C) o timina (T)]. El ADN forma
los genes que son la base de la herencia. Los métodos de extracción más utilizados a
partir de muestras de sangre consisten en lisar las células sanguíneas a través de choque
hipotónico y en presencia de detergentes para purificar el ADN. También tratamientos
con proteinasas son útiles para eliminar contaminantes proteicos. Finalmente se puede
separar el ADN por precipitación y solubilidad diferencial en diferentes solventes o
basados en su afinidad a distintos tipos de matrices (columnas de purificación). Los
métodos utilizados dependerán del tipo de muestras, tomando en cuenta de que tipos
de célula se extraerá el ADN o si es ADN libre. A partir de aquí, el ADN purificado,
es utilizado para varias técnicas de diagnóstico molecular como PCR, qPCR,
electroforesis o secuenciación.

Técnicas actuales post-extracción

1. PCR (Reacción en la cadena de la polimerasa)

La reacción en cadena de la polimerasa es la amplificación in vitro de secuencias

específicas de ácido nucleico. Esta reacción se somete repetidamente a un ciclo de
cambios de temperatura lo que permite la amplificación.
Los procesos de PCR y la enzima ADN polimerasa fueron nombrados por la revista
Science como la "Molécula del año" de 1989 porque probablemente tenían la mayor
influencia en la historia (Guyer y Koshland, 1989). La ciencia dijo que la PCR estaba
"revolucionando los enfoques que los investigadores están tomando para muchos
problemas en biología".

Los pasos básicos de la PCR son (1) la desnaturalización por calentamiento (94°C–
98°C) de una molécula de ADN molde a copiar, (2) la hibridación (50°C–65°C) de
pares de oligonucleótidos de secuencias específicas (cebadores, típicamente de 10 a 14
nt de longitud) elegidos para ser homólogo a las secuencias dentro de la molécula de
ADN molde y (3) la extensión (72°C) por la ADN polimerasa de los cebadores para
copiar la molécula de ADN plantilla. Estos tres pasos se repiten muchas veces (durante
muchos ciclos) para amplificar la plantilla de ADN. Si en cada ciclo se hace una copia
de cada una de las cadenas de la plantilla, el número de moléculas de ADN producidas
se duplica en cada ciclo. Debido a esta duplicación, al final de 20 ciclos, se hacen más
de un millón de copias de la plantilla de ADN.

2. Electroforesis para analizar resultados de PCR

La electroforesis en gel de agarosa ha demostrado ser una forma eficiente y efectiva de
separar los ácidos nucleicos. La alta resistencia del gel de agarosa permite el manejo
de geles de bajo porcentaje para la separación de grandes fragmentos de ADN.
El uso de electroforesis en gel de agarosa revolucionó la separación del ADN. Antes
de la adopción de geles de agarosa, el ADN se separaba principalmente mediante
centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, que solo proporcionaba una
aproximación del tamaño. Para separar el ADN usando electroforesis en gel de agarosa,
el ADN se carga en pozos prefabricados en el gel y se aplica una corriente.
La molécula de ADN (y ARN) está cargada negativamente, por lo tanto, cuando se
coloca en un campo eléctrico, los fragmentos de ADN migrarán al ánodo cargado
positivamente. Debido a que el ADN tiene una relación masa / carga uniforme, las
moléculas de ADN están separadas por tamaño dentro de un gel de agarosa en un patrón
tal que la distancia recorrida es inversamente proporcional al registro de su peso
molecular. Una vez que la corrida es finalizada, se coloca el gel bajo luz UV y se
visualiza

Una "línea" de ADN bien definida en un gel se llama banda. Cada banda contiene un
gran número de fragmentos de ADN del mismo tamaño que han viajado juntos a la
misma posición. Un fragmento único de ADN (o incluso un pequeño grupo de
fragmentos de ADN) no sería visible por sí mismo en un gel.
Al comparar una banda en una muestra con el marcador de peso molecular, podemos
determinar su tamaño aproximado.

3. PCR en tiempo real

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real es la capacidad de
monitorear el progreso de la PCR a medida que ocurre (es decir, en tiempo real). Por
lo tanto, los datos se recopilan durante todo el proceso de PCR, en lugar de al final de
la PCR. Esto revoluciona por completo la forma en que uno aborda la cuantificación
basada en PCR de ADN y ARN. En la PCR en tiempo real (qPCR), las reacciones se
caracterizan por el punto en el tiempo durante el ciclo cuando se detecta por primera
vez la amplificación de un objetivo en lugar de la cantidad de objetivo acumulada
después de un número fijo de ciclos. Esto se logra incorporando una molécula
fluorescente que se asocia al ADN amplificado, donde el incremento de esta
fluorescencia es la proporcional al incremento de la cantidad de moléculas de ADN
amplificadas en la reacción.

Para la amplificación por PCR en tiempo real además de los reactivos que se emplean
en la PCR punto final, es necesario emplear un fluoróforo. Los fluoróforos utilizados
para seguir la amplificación del ADN durante la PCR en tiempo real pueden ser de dos
tipos: a) fluoróforos con afinidad por el ADN y b) sondas específicas para fragmentos
del ADN, es decir, que sólo emiten fluorescencia cuando se ha amplificado un
fragmento del ADN de interés
a) Fluoróforos con afinidad por el ADN
Estos fluoróforos emiten fluorescencia cuando se unen al ADN. La intensidad
de la fluorescencia se incrementa proporcionalmente a la concentración del
ADN de doble cadena.
b) Sondas especificas
Los sistemas de detección específicos para una secuencia de interés se pueden
dividir en tres tipos: a) sondas de hidrólisis, b) sondas de hibridación y c)
sondas de horquilla. Consisten en la transferencia de energía entre dos
fluoróforos: un donador (reportero) y un aceptor (apagador o quencher), los

4. Micromatrices

Las micromatrices o microarrays permiten el análisis en paralelo de más de cien mil

biomoléculas en volúmenes de reacción muy pequeños. Una de sus aplicaciones es la
detección de mutaciones causantes de enfermedad o mutaciones que predisponen a
enfermedad para diagnóstico. Sobre la superficie de una placa de cristal se sintetizan
en un orden determinado miles de oligonucleótidos (fragmentos cortos de DNA, 20-50
nucleótidos) que contienen todas las mutaciones conocidas de un gen o todas las
variaciones posibles en la región codificante del gen. El DNA de los pacientes y
controles sanos se amplifica y se marca con fluorescencia utilizando PCR, y luego se
añade a la micromatriz. La fluorescencia en una posición determinada indica que el
DNA se ha unido al oligonucleótido.
 5. Secuenciación
La secuenciación del DNA consiste en determinar el orden exacto de los nucleótidos
(bases, G, A, T y C) a lo largo de un segmento de DNA. De esta secuencia se deduce
la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada.

• Sanger
El DNA que se va a secuenciar se desnaturaliza y se mezcla con un cebador
(complementario a un sitio en una de las hebras), polimerasa de DNA y los cuatro
nucleótidos (dNTPs). También se añaden pequeñas cantidades de los cuatro
terminadores de la síntesis (ddNTPs) marcados cada uno con un fluoróforo distinto.
Cada vez que uno de ellos se incorpora previene la incorporación de otros nucleótidos
a la cadena. De esa manera se genera un conjunto de fragmentos de DNA marcados
con fluorescencia que difieren en tamaño solo en un nucleótido. Los fragmentos se
separan mediante electroforesis en un capilar de un analizador automático. Cuando los
fragmentos van migrando por el capilar pasan por un rayo láser que los hace florecer.
Un detector de fluorescencia graba el orden del color de las bandas que luego se traduce
en la secuencia. Finalmente, la secuencia de los fragmentos del gen de pacientes se
compara con la secuencia normal para determinar la presencia de mutaciones.
• NGS
El ADN polimerasa cataliza la incorporación de desoxirribonucleótidos trifosfatos
(dNTP) marcados fluorescentemente en una cadena molde de ADN durante los
ciclos secuenciales de síntesis de ADN. Durante todo el ciclo, en el punto de
incorporación, los nucleótidos se identifican por excitación de fluoróforo. La
diferencia fundamental es que, en lugar de secuenciar un solo fragmento de ADN,
la NGS extiende este proceso a través de millones de fragmentos en una
paralelización masiva. Mas del 90% de los datos de secuenciación del mundo son
generados por la secuenciación por síntesis química (SBS) de Illumina. Se realiza
por los siguientes pasos:

1. Preparación de la biblioteca
La biblioteca de secuenciación se prepara por fragmentación aleatoria de la muestra
de ADN o ADNc, seguido de unión de adaptador. Alternativamente, la
"etiquetación" combina la fragmentación y las reacciones de ligadura en un solo
paso que aumenta en gran medida la eficiencia del proceso de preparación de la
biblioteca. Los fragmentos adaptados se amplifican por PCR y se purifican en gel.
2. Generación de clusters
Para la generación de clúster, la biblioteca se carga en una celda de flujo donde
los fragmentos se capturan en oligos unidos a la superficie, complementarios a los
adaptadores de la biblioteca. Cada fragmento se amplifica luego en clones de
clusters distintos a través de la amplificación del puente. Cuando se completa la
generación de clúster, las plantillas están listas para la secuencia.
3. Secuenciación
Se utiliza un método basado en termociclador reversible que detecta bases
individuales ya que están incorporados en hebras de plantilla de ADN. Como los
cuatro dNTP reversibles vinculados al termociclador están presentes durante cada
ciclo de secuenciación, la competencia natural minimiza el sesgo de la
incorporación y reduce en gran medida las tasas de error en bruto en comparación
con otras tecnologías.
4. Análisis de datos
Durante el análisis y la alineación de datos, las lecturas de la secuenciación
recientemente identificadas se alinean con un genoma de referencia. Después del
alineamiento, es posible encontrar muchas variaciones de análisis, como el
polimorfismo de nucleótido único (SNP) o la identificación por inserción /
eliminación (indel), el recuento de lectura para los métodos de ARN, el análisis
filogenético o metagenómico, entre otros.
 Referencias
Pei Yun Lee, John Costumbrado, and Yong Hoon Kim (2012). Agarose Gel
Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments
Aguilera P, Ruiz M , Rocha M, Pineda B y Chánez M. PCR en tiempo real
F. Claverie Martín, E. Ramos Trujillo, F.J. (2008) González Paredes. Técnicas para el
diagnóstico molecular de enfermedades hereditarias
Guía de prácticas de laboratorio. Cátedra de Genética 2013-3014
Torrades, Sandra. Terapia génica, una nueva estrategia terapéutica (2001)

PRÁCTICA Nº 1
TEMA: Técnicas e instrumentos en diagnóstico genético

Apellidos:__________________________Nombres:___________________________
Paralelo: ________ Mesa Nº. ____ Fecha: ___________
Calificación:_______________

Analice los siguientes gráficos

EJERCICIO 1 (4pts)
Utilice el grafico para colocar el peso de las bandas en la columna correspondiente
de la tabla

Mues MIR MIR MI MIR MIR MIR MIR MIR MIR MIR MIR MI
tra U2 U4 RU U16 U20 U23 U24 U26 U27 U31 U39 RU
10 40
Peso 320 650
bp 520

1 pto
¿Por qué es importante conocer el tamaño de la banda? 2 pto

EJERCICIO 2 (2ptos)

¿Qué ADN corresponde a la escena del crimen? Sospechoso #1, #2 o #3?

Señale las bandas que se comparten entre el padre y el niño. ¿Seleccione quién
es positivo para la prueba de paternidad?

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Señale las bandas que se comparten entre la víctima, la evidencia y los
sospechosos. Quién es el culpable en la escena del crimen: ¿sospechoso 1 o 2?

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EJERCICIO 3 (1pto)
¿Qué es heterocigosidad? ¿Qué es la pérdida de heterocigosis? Consulta

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EJERCICIO 4 (1pt)

Lea a continuación 3 informes genéticos.

INFORME GENETICO

PACIENTE 1:

ESTUDIO DE MAPEO GENETICO POR ARRAY

Se encontró 51 Mb de material genético con variaciones en el número de copias

cromosómicas (normal: dos copias). Se evidencian alteraciones como ganancia y
perdida de material genético de tamaño inferior a una megabase.

RESUMEN: arr(1p31.1,2q23.3,2q24.1,5q21.1,11p11.2,11q13.1,11q13.4, 12p11.22,

15q14,17q22,19q13.2,20q11.21,Xp22.33,Xq11.1)x2
hmz,arr (2q11.2)X1, (6q26)x1,(14q32.33)x3,(Xp22/33)x3

Atentamente,

Dr. Cesar Paz y Miño Dra. Paola E. Leone

Medico Genetista Bióloga Genetista

INFORME GENÉTICO

PACIENTE2:

ESTUDIO DE MAPEO GENETICO POR ARRAY

Se encontró 50 Mb de material genético con variaciones en el número de copias

cromosómicas (normal: dos copias). Se evidencian alteraciones como ganancia y
perdida de material genético de tamaño inferior a una megabase.
RESUMEN:
arr(3p12.2,3q22.2,4p15.1,6p22.3,7q11.22,11p11.2,12q15,17q21.2,Xp11.4,Xp11.22,
Xq11.1,Xq13.2,Xq22.3)x2
hmz,arr(3p25.2)x3,(6p21.33)x1,(10q26.3)x3,(14q32.33)x3

Atentamente,

Dr. Cesar Paz y Miño Dra. Paola E. Leone

Medico Genetista Bióloga Genetista

INFORME GENETICO

PACIENTE3:

ESTUDIO DE MAPEO GENETICO POR ARRAY

Se encontró 86 Mb de material genético con variaciones en el número de copias

cromosómicas (normal: dos copias). Del resultado cabe resaltar la ganancia de 3p25.3
y sobre todo de 9p24.3 que se interpretaría como una trisomía parcial del brazo corto
del cromosoma 9 lo que explica el fenotipo que presenta la paciente.

RESUMEN:
arr(1q25.1,3p12.2,3p11.2,7q21.3,9p21.3,12q11,12q12,14q21.2,20q11.21,Xq23,Xq
27.3)x2
hmz,arr(3p25.2)x3,(7p14.1)x1,(9p24.3)x3,(14q11.2)x1,(14q32.3)x3,(Xq26.3)x4

Atentamente,

Dr. Cesar Paz y Miño Dra. Paola E. Leone

Medico Genetista Bióloga Genetista

De los 3 informes presentados, qué paciente posee más variación en el número de

copias y por lo tanto más anomalías. ¿Por qué?

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EJERCICIO 5 (1pt)
Un gen muestra el siguiente mapa de restricción para las enzimas EcoRI y HindIII, y
combinadas

Mapa de restricción (arriba EcoRI; abajo HindIII)

Fragmentos combinados EcoRI + HindIII

Dibujar los patrones de los fragmentos de ADN esperados con cada enzima al separar
los fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa. Hacer lo mismo para el caso
de la digestión doble: (1 Kb=1000 pb; 2 Kb=2000 pb; 0.5 Kb = 500 pb; multiplicar
todo por 1000 para trasformar de Kb a pb)
EJERCICIO 6(1pt)

La enfermedad de Hirschsprung (HSCR) es un desorden congénito caracterizado por

la ausencia de células ganglionares a lo largo del tracto gastrointestinal, se sospecha
que el oncogén RET es el principal involucrado. Específicamente un polimorfismo que
se hace visible al someter al gen a digestión con las enzimas de restricción EcoRI y
HindIII. Indique cual es la diferencia entre los dos geles presentados (que bandas y con
qué peso), cuál de las dos enzimas de restricción tiene otro patrón de bandas (EcoRI y
HindIII) y porque en la digestión doble también cambia el patrón de bandas, y de una
posible explicación a esto.

SANO HIRSCHPRUNG (HSCR)

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EJERCICIO 7 (2ptos)

Enumerar las bandas que se observan con su respectivo peso. Confirme los pesos
de HPV 16, 61 y la coinfección.

Ejemplo HPV