DIFERENCIACION DE GENEROS Y GRUPOS BACTERIANOS

DE INTERES MEDICO

1.- INTRODUCCION

La clasificación y nomenclatura que seguirá esta manual es en general la

establecida en los volúmenes 1 y 2 de la nueva edición del manual de Bergey de
Bacteriología Sistemática (4,5), que agrupa a las bacterias en las Divisiones
Gracilicutes, Firmicutes, Tenericutes y Mendosicutes del Reino Procariote. En
algunos grupos bacterianos se considera los criterios de otros autores.

Esta práctica se limitará a presentar los principales géneros de interés en

Bacteriología Médica, siguiendo los criterios de Cowan y Steel (2) y Baron y
Finegold (1), quienes forman 2 grupos: Bacterias Gram positivas y Bacterias Gram.
negativas.

Estos autores empleando pruebas sencillas logran una identificación básica de la

familia, el género o el grupo bacteriano. Tablas 1 y 2. Diagrama 1.

Además de las pruebas convencionales de identificación contempladas en las

tablas 1 y 2 y diagrama 1, se incluyen dos pruebas auxiliares no tintoreales para la
diferenciación entre las bacterias Gram positivas y las Gram negativas. Las pruebas
son las del hidróxido de potasio y la susceptibilidad a la vancomicina. La primera se
basa en que las paredes celulares de las bacterias Gram negativas son degradadas
por el hidróxido liberando un material cromosomal viscoso y la segunda en que la
mayoría de las bacterias Gram positivas son susceptibles a la vancomicina (1).

La identificación a nivel de especie se realizara en practicas posteriores al tratar por

separado los distintos grupos bacterianos de interés medico.

2.- PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACION

En base apruebas sencillas, el alumno identificará a nivel presuntivo los diversos
géneros y grupos bacterianos de interés medico.

3.- LISTA DE REQUERIMIENTOS

3.1 Reactivos

NOMBRE DEL REACTIVO CONC. CANTIDAD

Colorantes para la técnica de tinción de Ziehl-Nelson
Colorantes para la técnica de tinción de Shaeffer y Fulton
Reactivo para la prueba de catalasa
Reactivo para la prueba de oxidasa
Reactivo para la prueba de hidróxido de potasio
Cepas bacterianas
Colorantes para la técnica de tinción de Gram
Sensidiscos de vancomicina de 5 ug.
Placas con gelosa de cerebro y corazón
Placas con gelosa sangre de borrego al 4.5%
Tubos con medio para movilidad
Tubos con caldo glucosa en base rojo de fenol
Tubos o /f con glucosa en base de Hugh y Leifson sin sello de aceite
mineral
Tubos o/f con glucosa en base de Hugf y Leifson con sello de aceite
mineral

3.2 Equipos de laboratorio

3.2.1 Microscopio
3.2.2 Asa de platino
3.2.3 Mechero Bunsen
3.2.4 Estufa de cultivo
3.2.5 Autoclave

3.3 Materiales de laboratorio

NUM. CANTIDAD DESCRIPCION

1 3 Portaobjetos

2 3 Cubreobjetos
4.- TECNICA O PROCEDIMIENTO
4.1 Muestreo y muestra

4.1.1 Utilice las cepas proporcionadas en la práctica.

Las cepas por identificar se proporcionarán en tubos numerados conteniendo

gelosa de cerebro y corazón, comprenderán dos cepas Gram positivas incluyendo
un bacilo ácido alcohol resistente (BAAR) y dos cepas Gram. Negativas. Cada cepa
se trabajara bajo los siguientes procedimientos: Bacterioscopía, cultivo e
identificación, prueba en portaobjetos y prueba en placa.

4.2 Preparación del sistema de medición

4.3 Técnicas

BACTERIOSCOPIA

4.2.1 Prepara tres frotis delgados de cada cepa y fijarlos al calor.

4.2.2 Teñir un frotis con la técnica de Gram., otro con la técnica de Ziehl-Neelsen y
el restante con la técnica de Shaeffer y Fulton. Las técnicas de coloración Se
describen en el apéndice de este manual.
4.2.3 Observar con el objetivo de inversión el frotis teñido por la técnica de Gram
e informar: la morfología microscópica y la afinidad tintorial, con atención al tamaño,
la forma, los extremos, la presencia o ausencia de pleomorfismo y si la coloración
es homogénea o irregular.
4.2.4 En el frotis teñido por la técnica de Ziehl- Neelsen, buscar con el objetivo de
inmersión la presencia de bacilos acido alcohol resistentes los cuales se tiñen de
color rojo.
4.2.5 En el frotis teñido por la técnica de Shaeffer y Fulton, observar si hay esporas,
las cuales se tiñen de color verde e informan el tamaño la forma la posición y si hay
deformación del soma bacteriano.

CULTIVO E IDENTIFICACION

4.2.6 Sembrar por estría cruzada, cada una de las cepas en gelosa de cerebro
y corazón e incubar en aerobiosis a 37°C de 24 a 48 horas.
4.2.7 Sembrar por estría cruzada, cada una de las cepas en gelosa sangre de
Borrego y depositar sobre la estría inicial un sensidisco de vancomicina.

4.2.8 Incubar en aerobiosis a 37°C de 24 a 48 horas observar la capacidad de

desarrollo sobre la gelosa sangre y la sensibilidad ala vancomicina. Cualquier
amplitud de la zona de inhibición es indicativa de una bacteria Gram positiva las
bacterias Gram negativas son generalmente resistentes a la vancomicina y
susceptibles a la colistina o polimixina B a 10 μg (1) las bacterias Gram negativas no
fermentadoras, Legionella y Haemophilus son incapaces de crecer en gelosa
sangre (1).
4.2.9 Sembrar cada una de las cepas por picadura hasta unos 5 mm antes del
fondo del tubo conteniendo el medio de movilidad incubar en aerobiosis a 37°C de
24 a 48 horas y observar el crecimiento difuso alrededor de la picadura en las
bacterias móviles (2).
4.2.10 Sembrar por la técnica de asa suspendida cada una de las cepas en el
medio de glucosa en base rojo de fenol. Incubar en aerobiosis a 37°C de 24 a 48
horas y observar la fermentación de la glucosa manifiesta por el cambio del
indicador a un color amarillo.
4.2.11 Sembrar cada una de las cepas por picadura profunda hasta unos 5 mm
antes del fondo del tubo, conteniendo el medio O/F de glucosa en base de Hugh y
Leifson con sello y sin sello de aceite mineral incubar en aerobiosis a 37°C de 24 a
48 horas. Observar la utilización de la glucosa por la vía fermentativa (producción
de ácidos en varios tubos) u oxidación (producción de ácidos en el tercio superior
del tubo sin sello). La producción de ácidos se manifiesta por el cambio del
indicador a un color amarillo (3).

4.2.12 Prueba de hidróxido de potasio. Depositar una gota de hidróxido de potasio

al 3% sobre un portaobjetos, tomar una colonia con el asa y emulsionarla con la
agitación continua por 60 segundos separa suavemente el asa del porta objetos
hasta observar la formación de un hilo viscoso en la prueba positiva (1).

4.2.13 Prueba de la catalasa. Debido a la actividad de catalasa contenida en los

eritrocitos, se recomienda que la prueba se realice a partir de un cultivo en medio
libres de sangre; la prueba se puede realizar sobre el crecimiento en placa o en
tubo de gelosa, con una suspensión fina en tubo o en portaobjetos.

PRUEBA EN PORTA OBJETOS

4.2.14 A partir de la gelosa de cerebro y corazón tomar una asa o palillo de madera
estéril una colonia y depositarla sobre un porta objetos limpio y seco
inmediatamente agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3 % sobre la parte
en que se deposito la colonia observar la formación de burbujas de gas en la
prueba positiva (1)

PRUEBA EN PLACA
4.2.15 Depositar unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre el crecimiento
obtenido en las placas de gelosa de cerebro y corazón y observar si hay
efervescencia si esta se presenta la prueba será positiva (2).

PRUEBA DE OXIDASA PRUEBA EN PAPEL FILTRO (MÉTODO DE KOVACS).

4.2.16 En el interior de una caja de petri, depositar un circulo o tira de papel filtro e
impregnarlo con varias gotas de reactivo de oxidasa recientemente preparado
tomar con una asa una pequeña porción de la colonia y frotarla sobre el papel
inpregnado.
Observar en la prueba positiva el desarrollo de un color azul o púrpura en los
primero 10 segundos (1).

PRUEBA EN PLACA

4.2.17 Depositar unas gotas del reactivo de oxidasa sobre el crecimiento obtenido
en las placas de gelosa en cerebro y corazón observar si la colonia tiende a
cambiar a color azul o púrpura en la prueba positiva. (2)

Si se requiere continuar el estudio de las cepas, las pruebas de catalasa y oxidasa

no se deben realizar sobre el cultivo.

4.3 Uso del sistema de Medición

5.- PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

5.1 RESULTADOS

5.1.1Ordenar los resultados de acuerdo con las tablas 1 y 2. Diagrama 1

5.1.2 Comparar con cada una de las tablas y concluir tentativamente a que familia,
género o grupo corresponde cada una de las cepas problema.
5.1.3 Discutir los resultados de las pruebas y concluir.

6 PRACTICABILIDAD
6.1 El analista debe ser un estudiante de Química Clínica con supervisión del maestro.
7 BIBLIOGRAFIA

1 Baron,E.J & S.M. Finegold. 1990. Bailey & Scott´s Diagnostic Microbiology, P 100-
126 8th ed The C.V Mosby Co.,St. Luis, Missouri, U.S.A.

2 Cowan St 1974. Cowan & Steel´s Manual of indentification of medical bacteria,

2nd. Ed. Cambridge University Press. London, Egland. P. 152.

3 Macfaddin,J.F 1980. Biochemical tests for identification of medical bacteria 2nd. Ed

The Williams & Wilkins Co,Baltimore.p.260-268.

4Murray, R.G.E 1984. The Higher Taxa, or A place for Everything. p 33- 34.

5 Murray, R.G.E 1986. The Higher Taxa, or A place for Everything. p 995-998. In
N.R