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ONCOLOGIA CARTAS 16: 1237-1242, 2018
La inhibición de la proteína quinasa activada por mitógeno mejora
los efectos antitumorales de la esporamina en células de cáncer de páncreas huma
CUI-JUAN QIAN1,2, YONG-XIAO QI2 , SHENG ZHONG2
1
Departamento de Gastroenterología, Hospital Central de Taizhou, Hospital Universitario de Taizhou;
2
Instituto de Tumores, Facultad de Medicina, Universidad de Taizhou, Taizhou, Zhejiang 318000, PR China
Recibido el 6 de octubre de 2016; Aceptado el 17 de enero de 2018
DOI: 10.3892/ol.2018.8746
Resumen. La esporamina, una proteína de almacenamiento del
tubérculo de la batata, es un inhibidor de la tripsina (TI) de tipo Kunitz
que ha exhibido actividad antitumoral a través de mecanismos poco
definidos en varios tipos de células tumorales. El presente estudio tuvo
como objetivo analizar los efectos combinados de la esporamina y tres
inhibidores de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK),
PD98059, SP600125 y SB203580, en la línea celular de cáncer de
3
páncreas, PANC-1. La actividad de proliferación celular usando
se evaluó
un
ensayo de incorporación de H-timidina y la viabilidad celular se analizó
usando un ensayo MTT. La apoptosis se analizó mediante citometría
de flujo y microscopía de fluorescencia. Los niveles de expresión de
proteínas en las células PANC-1 se determinaron mediante transferencia
Western. Los resultados de este análisis demostraron que la esporamina
indujo un aumento temporal en la fosforilación de MAPK, incluida la
quinasa 1/2 regulada por señal extracelular fosforilada, la proteína
quinasa 1/2 amino-terminal c-Jun fosforilada y la p38-MAPK fosforilada,
en un forma dependiente de la concentración. Sin embargo, el
tratamiento con inhibidores de MAPK promovió la inhibición de la
proliferación y viabilidad celular, y la inducción de apoptosis en células
PANC-1 tratadas con esporamina.
En conclusión, el presente estudio demostró que la inhibición de MAPK
mejoró la actividad antitumoral de la esporamina en las células PANC-1.
Correspondencia a: Profesor Jun Yao, Instituto de Tumores, Escuela
de Medicina, Universidad de Taizhou, 1139 Shifu Road, Jiaojiang,
Taizhou, Zhejiang 318000, PR China
Correo electrónico: yaojuntzu@yeah.net
Abreviaturas: TI, inhibidor de tripsina; CP, cáncer de páncreas;
MAPK, proteína quinasa activada por mitógeno; p38, proteína quinasa activada por mitógeno
p38; ERK, proteína quinasa regulada por señal extracelular; JNK, c-Jun amino-terminal proteína
quinasa; DMEM,
Medio de Eagle modificado por Dulbecco
Palabras clave: esporamina, cáncer de páncreas, cinasa regulada por
señal extracelular 1/2, cinasa janus, cinasa activada por mitógeno p38,
inhibidores de la cinasa activada por mitógeno
, JU-PING ZENG2 , XIAO-YING CHEN2 y JUN YAO2
Introducción
El cáncer de páncreas (CP) se encuentra entre los tipos de tumor sólido
más agresivos y tiene la tasa más alta de mortalidad asociada al cáncer
en todo el mundo (1). A pesar de los avances en las técnicas quirúrgicas,
quimioterapia y radioterapia, la tasa de supervivencia a largo plazo de
los pacientes con CP no ha aumentado significativamente desde 1977
(2). Por lo tanto, se requiere con urgencia más investigación sobre
terapias alternativas para la PC, que tiene menos toxicidades asociadas.
Los inhibidores de tripsina (TI) están ampliamente distribuidos en
plantas y animales, y ciertos tipos de TI han mostrado actividad
antitumoral en varios tipos de células tumorales (3-5). Aunque
actualmente no hay disponibles terapias aprobadas que se dirijan
directamente a la tripsina, se están desarrollando terapias TI novedosas
y más específicas (3-5). La esporamina, una proteína de almacenamiento
del tubérculo de batata, es un TI de tipo Kunitz que ha demostrado
inducir efectos antitumorales in vitro e in vivo (4,5).
Aunque el papel y el mecanismo de la esporamina como agente
antitumoral siguen sin estar claros, la investigación anterior ha indicado
que la esporamina puede mediar en la regulación de vías de señalización
específicas (5). Por ejemplo, se demostró que la esporamina inhibe el
crecimiento celular e induce la apoptosis de las células de cáncer de
lengua humana al regular a la baja la señalización de RAC serina/
treonina-proteína quinasa/glucógeno sintasa quinasa-3 (5). Sin embargo,
hasta donde sabemos, los efectos antitumorales de la esporamina en
PC no se han investigado previamente.
Las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) están
involucradas de manera crítica en las cascadas de señalización que
gobiernan varios procesos críticos, incluida la proliferación celular, la
diferenciación, la apoptosis y la supervivencia (6). Las MAPK son
enzimas conservadas que conectan los receptores de la superficie
celular con sus objetivos reguladores dentro de las células (7). Las
principales MAPK incluyen la proteína quinasa regulada por señal
extracelular (ERK), la proteína quinasa N-terminal c-Jun (JNK) y la
proteína quinasa activada por mitógeno p38 (p38), que se han
identificado como subfamilias de MAPK (8) . Las MAPK se activan constitutivamente
Por lo tanto, las MAPK y sus genes asociados pueden proporcionar
información más detallada sobre el mecanismo detrás de la actividad
antitumoral de la esporamina en las células PC.
El presente estudio investigó los efectos de la esporamina en la
proliferación, viabilidad y apoptosis de las células PC y determinó las
funciones de las MAPK en la actividad antitumoral de la esporamina en
las células PC. Los resultados del presente estudio
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1238 QIAN et al: LA ESPORAMINA INDUCE LA ACTIVACIÓN DE MAPK EN EL CÁNCER DE PÁNCREAS
demostraron que el tratamiento combinado de células PC con
esporamina e inhibidores de MAPK provocó una respuesta superior al
tratamiento con esporamina o inhibidores de MAPK solos. Este
resultado apoya la hipótesis de que un tratamiento combinado de
esporamina e inhibidor de MAPK puede usarse como terapia de PC.
El presente estudio puede proporcionar una nueva estrategia para el
desarrollo de fármacos antitumorales dirigidos a la PC.
materiales y métodos
Línea celular y materiales. La línea celular humana PC PANC-1
(American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE. UU.), se cultivó
en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)
(Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU.) con 10
% de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS; Gibco; Thermo
Fisher Scientific, Inc.), 100 mg/l de estreptomicina y 100 kU/l de
bencilpenicilina a 37ÿC en una incubadora que contiene aire
humidificado y 5% de CO2. La esporamina se purificó a partir de
tubérculos frescos de camote, como se describió anteriormente (5). El
inhibidor específico de fosfoÿERK PD98059, el inhibidor específico de
fosfoÿJNK SP600125 y el inhibidor específico de fosfoÿp38 SB203580
se adquirieron de Calbiochem (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania).
Preparación de lisados celulares. Para el análisis de transferencia
Western, las células PANC-1 se cultivaron en placas de cultivo de 6
pocillos hasta una confluencia del 80ÿ90 %, luego se privaron de
nutrientes durante 24 h en DMEM sin suero. Se añadió esporamina a
0, 25, 50 y 100 µM durante 24 h. Para los experimentos de inhibición
de MAPK, las células se pretrataron durante 10 min con SP600125 20
µM, SB203580 10 µM o PD98059 20 µM antes del tratamiento con
esporamina. Después de 3 lavados en PBS a 4ÿC, las células se
lisaron en 60 µl de tampón de lisis (50 mmol/NaCl, 0,5 mmol/ml de
fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 2 mmol/ml de Na3VO4 y 10 mmol/ml de
HEPES a pH 7,4, con 0,01 % Triton Xÿ100 y 10 mg de leupeptina) a
4ÿC durante 5 min. Los lisados celulares se obtuvieron por
centrifugación a 14 000 xga 4 °C durante 10 min.
Las concentraciones de proteínas se determinaron usando un kit de
ensayo de proteína de ácido bicinconínico mejorado (Beyotime Institute
of Biotechnology, Haimen, China).
Análisis de Western Blot. Se añadió tampón de muestra SDS (0,33
mol/l de TrisÿHCl, 10 % (p/v) de SDS, 40 % (v/v) de glicerol y 0,4 %
de azul de bromofenol) a los lisados celulares (una proporción de
tampón:lisado de 1:4). Después del calentamiento durante 5 min a 100
°C, se sometieron 20 µg de proteína extraída a SDS-PAGE al 10ÿ12
%. La proteína se transfirió a una membrana de nitrocelulosa, que
luego se bloqueó a 25 °C durante 1 h con albúmina de suero bovino
al 5 % (SigmaÿAldrich; Merck KGaA) en 50 mmol/l de TrisÿHCl, 150
mmol/l de NaCl y 0,1 % Tweenÿ20 (pH 7,4). Las transferencias se
incubaron con anticuerpos primarios contra fosfo-ERK1/2 (n.º de
catálogo 4370), ERK1/2 total (n.º de catálogo 9102), fosfo-JNK1/2 (n.º
de catálogo 9251), JNK1/2 total (n.º de catálogo . 9252), fosfo-p38 (n.º
de catálogo 9211) y p38 total (n.º de catálogo 9212) (todos utilizados
en una dilución de 1:1000 y adquiridos de Cell Signaling Technology,
Inc., Danvers, MA, EE. UU.) en 4ÿC durante la noche. A esto le siguió
una incubación de 2 h a temperatura ambiente con anticuerpos
secundarios IgG anti-conejo conjugados con peroxidasa de rábano
picante (n.º de catálogo 7074) o anti-ratón (n.º de catálogo 7076)
(adquiridos de
Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, EE. UU.; utilizado en
una dilución de 1:2.000). Las señales inmunorreactivas se visualizaron
con el sustrato de transferencia Western de quimioluminiscencia
mejorada Pierce™ (Merck KGaA) y se escanearon con un sistema de
imágenes LASÿ4000 (Fujifilm Holdings Corporation, Tokio, Japón).
Determinación de la actividad de proliferación celular. Las células
PANC-1 se sembraron en placas de 24 pocillos en DMEM
suplementado con FBS al 10 % y se cultivaron hasta una confluencia
del 80 %. Luego, los cultivos se enjuagaron en DMEM y se incubaron
con esporamina (50 µM), con o sin pretratamiento con inhibidor: 20
µM PD98059, 20 µM SP600125 o 10 µM SB203580 y DMEM sin suero
3
durante 12 h. A continuación, las células se cultivaron con 1,35x104 Bq/l
H-timidina
durante otras 12 h. El sobrenadante se aspiró y se lavó dos veces con
PBS para eliminar el exceso de H-timidina.
3 A continuación, las células
se resuspendieron en 0,2
3
mol/l de NaOH. La actividad de
incorporación de H-timidina se determinó con un ensayo de
incorporación de [ 3H] timidina (SigmaÿAldrich; Merck KGaA) mediante
recuento por centelleo (LS6500; Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, EE.
UU.).
Ensayo de viabilidad celular. Para evaluar los efectos de la esporamina
en la viabilidad de las células PANC-1, se realizó un ensayo MTT.
Las células PANC-1 se sembraron en placas de 96 pocillos y se
cultivaron hasta una confluencia del 80%. Luego, los cultivos se
enjuagaron en DMEM y se incubaron con esporamina (50 µM), con o
sin pretratamiento con inhibidor: 20 µM PD98059, 20 µM SP600125 o
10 µM SB203580 en DMEM sin suero durante 24 h. Se añadió MTT a
una concentración final de 0,5 g/l. Los cultivos se retiraron de la
incubadora 1 h más tarde y los cristales de formazán se solubilizaron
en una solución que contenía Triton X-100 al 10 % (v/v) y HCl 0,1 mol/
l en isopropanol al 100 % igual al volumen de DMEM (100 µl) medio
de cultivo. La absorbancia se midió a 570 nm utilizando un lector de
microplacas (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.).
Análisis de citometría de flujo para apoptosis. An Anexina V-
Isotiocianato de fluoresceína (FITC)/Yoduro de propidio (PI)
Se utilizó el kit de detección de apoptosis (BD Biosciences, San José,
CA, EE. UU.) para detectar la apoptosis de acuerdo con el protocolo
del fabricante. Brevemente, las células se incubaron con esporamina
(50 µM), con o sin tratamiento previo con inhibidor: PD98059 20 µM,
SP600125 20 µM o SB203580 10 µM durante 24 h.
Las células adherentes y no adherentes se combinaron y recolectaron
mediante centrifugación a 100 xg durante 5 min, se lavaron dos veces
con PBS a 4 °C y se resuspendieron en tampón de unión 1X (NaOH
140 mM, HEPES 10 mM y CaCl2 2,5 mM; pH 7,4). a una concentración
de 1x106 células/ml. Se transfirió un total de 1x105 células a un tubo
de cultivo de 5 ml y se tiñeron con 5 µl de anexina V-FITC y 5 µl de PI
durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Finalmente,
se agregaron 400 µl de tampón de unión 1X y las células se analizaron
usando un citómetro de flujo BD FACSCalibur™ con el software BD
CellQuest™ Pro versión 6.0 (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.).
Determinación morfológica y cuantificación de apop-
tosis Las células se cultivaron en placas de 12 pocillos a una densidad
de 1x105 células/pocillo y se incubaron con esporamina (50 µM), con
o sin pretratamiento con inhibidor: 20 µM PD98059, 20 µM
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ONCOLOGIA CARTAS 16: 1237-1242, 2018 1239

SP600125 o 10 µM SB203580 durante 24 h. Para el ensayo de tinción nuclear,

las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % a 4 ÿM durante 15 min (pH
7,4) y se tiñeron con 0,5 µg/ml de DAPI (Sigma-Aldrich, Merck KGaA) durante
5 min a temperatura ambiente. Las imágenes se adquirieron utilizando un
microscopio de fluorescencia (aumento, x200; DMI4000B; Olympus Corporation,
Tokio, Japón).
Los cambios morfológicos nucleares apoptóticos típicos, incluidos los núcleos
condensados y fragmentados, se consideraron indicativos de apoptosis y se
distinguieron fácilmente de los núcleos intactos por microscopía. Se examinaron
un total de seis campos de visión elegidos al azar con <500 células puntuadas
en cada uno, y se calculó el porcentaje de células apoptóticas.

Análisis estadístico. Todos los datos se presentan como media ± desviación

estándar. Se aplicó un análisis de varianza de una vía, seguido de la prueba
post hoc de Dunnett, para analizar las diferencias entre los grupos utilizando
SPSS 18.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.). Se consideró que
P<0,05 indicaba una diferencia estadísticamente significativa.

Resultados

Figura 1. Efecto de la esporamina sobre la activación de MAPK en células PANCÿ1.

Efecto de la esporamina sobre la activación de MAPK en células PANCÿ1.
Para abordar la participación de MAPK en la supresión del crecimiento celular
inducido por esporamina y la apoptosis directamente, se determinaron los
niveles de expresión de proteínas fosfo-ERK1/2, fosfo-JNK1/2 y fosfo-p38
La transferencia Western reveló la activación dependiente de la concentración de ERK1/2,
JNK1/2 y p38 después de un tratamiento con esporamina de 10 minutos en células PANC-1.
MAPK, proteína quinasa activada por mitógeno; ERK, quinasa regulada por señal
extracelular; JNK, proteína quinasa c-Jun N-terminal; p38, p38ÿMAPK.

mediante transferencia Western. Como se demuestra en la Fig. 1, el tratamiento

con esporamina a 25ÿ100 µM durante 24 h estimuló un aumento en la expresión
de las proteínas fosfo-ERK1/2, fosfo-JNK1/2 y fosfo-p38 de una manera
dependiente de la concentración. Estos resultados indicaron que la esporamina
aumentó la activación de las proteínas MAPK en las células PANCÿ1. Como la
esporamina 50 µM indujo un marcado aumento en la activación de las proteínas
MAPK, los siguientes experimentos implicaron el tratamiento celular a una
concentración de esporamina de 50 µM.

Efecto de los inhibidores de MAPK sobre la activación inducida por esporamina

ción de MAPK en células PANCÿ1. En células PANC-1 tratadas con PD98059,
SP600125 o SB203580 durante 10 minutos antes del tratamiento con
esporamina, la fosforilación inducida por esporamina de ERK1/2 (Fig. 2A),
JNK1/2 (Fig. 2B) y p38 (Fig. 2C) ) disminuyó notablemente en comparación con
las células tratadas con esporamina sola o con células no tratadas. Estos
resultados demostraron que los inhibidores de MAPK prevenían la activación
inducida por esporamina de las proteínas MAPK en las células PANC-1.

Efecto de los inhibidores de MAPK en la inhibición inducida por esporamina de

la proliferación celular y la viabilidad en células PANC-1. Se investigó si los
inhibidores de MAPK podrían lograr un efecto supresor sinérgico sobre el
crecimiento celular con esporamina. Un ensayo de actividad de3de
incorporación
H-timidina
reveló que hubo una disminución significativa en la proliferación de células
PANC-1 cuando se trataron previamente con inhibidores de MAPK, en
comparación con las células PANC-1 tratadas con esporamina o con un
inhibidor de MAPK solo (Fig. 3A). Un ensayo MTT reveló que la viabilidad
celular también se redujo significativamente en las células pretratadas con Figura 2. Efecto de los inhibidores de MAPK en la activación de proteínas MAPK inducida
inhibidores de MAPK, en comparación con las células tratadas con esporamina por esporamina en células PANC-1. Las células se trataron con esporamina (50 µM), con o
o un inhibidor de MAPK solo (Fig. 3B). Estos resultados demostraron que los sin tratamiento previo con inhibidor: PD98059 20 µM, SP600125 20 µM o SB203580 10 µM.
(A) la activación de ERK1/2, (B) la activación de JNK1/2 y (C) la activación de p38 se
inhibidores de MAPK mejoraron la inhibición inducida por esporamina de la
analizaron mediante transferencia Western. MAPK, proteína quinasa activada por mitógeno;
actividad de proliferación celular y la viabilidad en las células PANCÿ1. ERK, quinasa regulada por señal extracelular; JNK, proteína quinasa c-Jun N-terminal; p38,
p38ÿMAPK.
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1240 QIAN et al: LA ESPORAMINA INDUCE LA ACTIVACIÓN DE MAPK EN EL CÁNCER DE PÁNCREAS

Efecto de los inhibidores de MAPK en la apoptosis inducida por

esporamina en células PANC-1. El tratamiento combinado con
esporamina e inhibidores de MAPK aumentó la proporción de células
PANC-1 apoptóticas (anexina V-positivas) en un 21,44 ± 2,44 %
(esporamina con SP600125 versus tratamiento con esporamina o
SP600125 solo; P <0,01), 19,59 ± 1,64 % (esporamina con SB203580
versus tratamiento con esporamina o SB203580 solo; P <0.01) y 27.58
± 3.59% (esporamina con PD98059 versus tratamiento con esporamina
o PD98059 solo; P <0.01) (Fig. 4A y B). Tinción nuclear DAPI. De
manera constante, las células PANC-1 expuestas a inhibidores de
esporamina y MAPK exhibieron un aumento en el número de núcleos
condensados y fragmentados en comparación con cualquiera de los
agentes solos (Fig. 4C). Estos resultados indicaron que los inhibidores
de MAPK mejoraron la apoptosis inducida por esporamina en las células
PANCÿ1.

Discusión

Los resultados del presente estudio demostraron que la esporamina

suprimió el crecimiento de las células PANC-1 mediante la inhibición de
la proliferación y viabilidad celular (Fig. 3). Los efectos supresores de la
esporamina sobre el crecimiento celular también se atribuyen
parcialmente a la inducción de la apoptosis (Fig. 4). Además, se
demostró que la activación de MAPK puede cumplir una función
protectora contra los efectos antitumorales de la esporamina, ya que el
tratamiento combinado de inhibidores de MAPK y esporamina resultó
en una mayor supresión del crecimiento celular y apoptosis.
La esporamina inhibe el crecimiento celular e induce la apoptosis
en las células de cáncer colorrectal (4) y las células de cáncer de Figura 3. Efectos de SP600125, SB203580 y PD98059 sobre la proliferación y viabilidad
de células PANC-1 tratadas con esporamina. Las células se preincubaron con SP600125
lengua (5). Los resultados del presente estudio demostraron que la
20 µM, SB203580 10 µM o PD98059 20 µM durante 10 min antes del tratamiento con
esporamina suprimió el crecimiento de las células PANCÿ1. La esporamina 50 µM durante 24 h. (A) La proliferación celular y (B) la viabilidad celular se
3
supresión del crecimiento celular puede atribuirse a la apoptosis de las determinaron mediante la incorporación de H-timidina
Los datos yselos
presentan
ensayoscomo
MTT, media
respectivamente.
±

células PC (10), y en el presente estudio se demostró que la esporamina
inducía la apoptosis en las células PANC-1. El presente estudio también
investigó el mecanismo potencial subyacente a los efectos antitumorales
de la esporamina.
desviación estándar; P<0.05 y ##P<0.01
*
n=4. P<0,05 y **P<0,01 frente a células de control no tratadas; #
frente a células tratadas con esporamina sola; $P<0,05 y $$P<0,01 frente a células tratadas
con SP600125 solo; ÿP<0,05 y ÿÿP<0,01 frente a células tratadas con SB203580 solo;
ÿP<0,05 y ÿÿP<0,01 frente a células tratadas con PD98059 solo. Control, control; S,

Las MAPK están involucradas en las complejas cascadas de esporamina; SP, SP600125; SB, SB203580; PD, PD98059.

transducción de señales que regulan la apoptosis (7). Varios estudios

previos han indicado que las tirosina quinasas, el estado redox celular
y las fosfatasas están involucradas en la activación de las respuestas
de estrés, lo que representa la activación de MAPK en diferentes tipos
de células posteriores al tratamiento con paclitaxel (11) o factor de
necrosis tumoral (12). En particular, en el presente estudio, el
tratamiento con esporamina activó ERK1/2, JNK1/2 y p38 de manera
dependiente de la concentración (Fig. 1) durante la apoptosis inducida
por esporamina de las células PANC-1 (Fig. 4). Este resultado indicó
que la señalización de MAPK está involucrada en la regulación de la
apoptosis de las células PANC-1 debido al tratamiento con esporamina.
Las proteínas MAPK pueden desempeñar un papel importante en
los complejos mecanismos reguladores que subyacen a la resistencia
a los quimioterapéuticos (13,14). En un estudio anterior, se demostró
que el inhibidor de la histona desacetilasa TSA induce la detención del
crecimiento celular, la apoptosis y la activación de ERK1/2. La activación
de ERK1/2 protegió a las células de carcinoma gástrico SGC7901 de la
apoptosis inducida por TSA (15). De manera similar, los resultados del
presente estudio demostraron que las proteínas MAPK se activan
mediante el tratamiento con esporaminas y que la activación de MAPK
podría proteger a las células PANC-1 de la apoptosis inducida por
esporaminas. Sin embargo, la inhibición de ERK1/2 usando PD98059 o
U0126 bloqueó notablemente la apoptosis inducida por cisplatino.
en líneas celulares testiculares malignas humanas (16). Por el contrario,
el presente estudio demostró que la inhibición de MAPK por PD98059,
SP600125 o SB203580 mejoró significativamente la apoptosis inducida
por esporamina en las células PANC-1. Los diferentes efectos de los
inhibidores de MAPK en la apoptosis pueden deberse a los diferentes
tipos de células cancerosas utilizadas por diferentes estudios y sus
estados genéticos/epigenéticos asociados. Por lo tanto, se requieren
más estudios que utilicen otras líneas celulares de cáncer para
caracterizar mejor este fenómeno.
Las vías de señalización de MAPK son importantes en el crecimiento
celular, la resistencia a los medicamentos y la transformación maligna
en varios tipos de tumores (17-19). Comprender el mecanismo molecular
detrás de la activación de MAPK inducida por esporamina debería
beneficiar el desarrollo de nuevas terapias para PC.
La activación de p38 generalmente se asocia con la inducción de
apoptosis, mientras que la activación de ERK1/2 se asocia con efectos
citoprotectores (17). Por lo tanto, el presente estudio se centró en el
papel de MAPK en la apoptosis inducida por esporamina.
Aunque la inhibición de MAPK mejoró la apoptosis inducida por
esporamina en células PANC-1 (Fig. 4), los resultados también indicaron
que los niveles basales de ERK1/2, JNK1/2 y
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ONCOLOGIA CARTAS 16: 1237-1242, 2018 1241

Figura 4. Efecto de SP600125, SB203580 y PD98059 sobre el porcentaje de células apoptóticas en células PANC-1 tratadas con esporamina. Las células se preincubaron con
SP600125 20 µM, SB203580 10 µM o PD98059 20 µM durante 10 min antes del tratamiento con esporamina 50 µM durante 24 h. (A) El porcentaje de células apoptóticas
tempranas (anexina V positiva, PI negativa) y células apoptóticas tardías (anexina V positiva y PI positiva) se analizó mediante citometría de flujo. (B) Histogramas
representativos de citometría de flujo. (C) Los cambios morfológicos apoptóticos se usaron para contar las células apoptóticas y, posteriormente, calcular la tasa porcentual de
apoptosis. Se examinaron un total de 6 campos de visión elegidos al azar con un número mínimo de 500 células puntuadas en cada tratamiento. Los datos se presentan como
$P<0.05 y $$P<0.01*la media
vs desviación
± estándar
de celdas;
P<0,05n=4.
y **P<0,01
tratadofrente
con SP600125
a las células
solo;
deÿP<0,05
control no
y ÿÿP<0,01
tratadas; frente
ÿP<0,05a células
y ÿÿP<0,01
tratadas
frente
cona SB203580
células tratadas
solo; ÿP<0,05
con esporamina
y ÿÿP<0,01
sola;frente a
células tratadas con PD98059 solo. PI, yoduro de propidio; Control, control; S, esporamina; SP, SP600125; SB, SB203580; PD, PD98059.

La fosforilación de p38 desempeña un papel en el mantenimiento de la Agradecimientos

supervivencia de las células PANCÿ1. Así, la esporamina puede ejercer
un doble papel: i) Un papel citotóxico al inducir la apoptosis; y ii) un papel
protector al activar las proteínas de señalización MAPK, incluidas
ERK1/2, JNK1/2 y p38.
Un estudio anterior ha demostrado que la activación de ERK1/2 en
células de cáncer gástrico se asocia con una mayor resistencia a los
fármacos quimioterapéuticos (20). La activación de ERK1/2, que se
asocia con respuestas proliferativas y antiapoptóticas, resultó en la
generación de resistencia a los fármacos quimioterapéuticos en las
células PC (21). El aumento de la activación de MAPK después de
tratamientos farmacológicos quimioterapéuticos es indicativo de un
aumento potencial en la abundancia de MAPK (17-21). En el presente
estudio se demostró que la esporamina inducía la activación de ERK1/2,
JNK1/2 y p38 de forma dependiente de la concentración, y que los
inhibidores de MAPK atenuaban este efecto de la esporamina en las
células PANCÿ1.
El tratamiento con inhibidores de MAPK no solo redujo los niveles
constitutivos de fosfo-ERK1/2, fosfo-JNK1/2 y fosfo-p38, sino que también
inhibió la activación inducida por esporamina de las proteínas de
señalización de MAPK (Fig. 2). El tratamiento con inhibidores de MAPK
también mejoró la inhibición de la actividad y viabilidad de proliferación
celular (Fig. 3) y la inducción de apoptosis (Fig. 4) en células PANC-1
tratadas con esporamina.
Los tratamientos con inhibidores de MAPK y Sporamin tienen efectos
sinérgicos, lo que indica el potencial terapéutico de esta combinación
para pacientes con PC.
En resumen, el uso de inhibidores de MAPK para mejorar la
apoptosis a través de la esporamina indicó que las terapias con MAPK
pueden ser ventajosas para la eficacia de la quimioterapia contra el
cáncer de TI, y que la combinación de TI con inhibidores de MAPK
puede ser una estrategia de tratamiento eficaz. Por lo tanto, los
resultados del presente estudio tienen un gran potencial en el tratamiento
de la CP utilizando inhibidores de MAPK con TI.
No aplica.
Fondos
El presente estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación de
Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (subvención n.º
LY16H160033), el Proyecto de Investigación Técnica Aplicada de
Bienestar Público de la provincia de Zhejiang (subvención n.º
2016C33189), los Planes de Ciencia y Tecnología de la ciudad de
Taizhou (subvención n.º .1701yw07), y el Programa Nacional de
Capacitación en Innovación y Emprendimiento de Estudiantes Universitarios (subvenc
Disponibilidad de datos y materiales.
Los conjuntos de datos analizados generados durante el estudio están
disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.
Contribuciones de los autores
JY y CQ concibieron y dirigieron el proyecto. CQ y YQ diseñaron los
experimentos. CQ, YQ, SZ, JZ y XC realizaron los experimentos. JY y
CQ realizaron el análisis de datos e interpretaron los resultados. JY y
CQ escribieron y editaron el artículo.
Todos los autores revisaron el manuscrito.
Aprobación ética y consentimiento para participar
No aplica.
Consentimiento para publicación
No aplica.
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1242 QIAN et al: LA ESPORAMINA INDUCE LA ACTIVACIÓN DE MAPK EN EL CÁNCER DE PÁNCREAS
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
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