MESA 1

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

Facultad de Ciencias
Departamento Académico de Química

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRÁCTICA 7: DETERMINACIÓN
ESPECTROFOTOMÉTRICA DE CREATININA

✔ Integrantes:
● Baez Barrientos, Nicolas Hans 20150430
● Espinoza Landa, Diego 20181244
● Rojas Medina, Shezira 20151367

✔ Docente: Mg. Sc. Paola Jorge Montalvo

✔ Grupo: A
✔ Fecha de práctica: 28 / 01 / 20
✔ Fecha de entrega: 04 / 01 / 20

2020
 I. INTRODUCCIÓN

En el presente informe trabajaremos por reacciones colorimétricas en las cuales los

enlaces peptídicos de ciertos aminoácidos reaccionan y los productos coloridos son los
que se cuantifican. la concentración de proteínas en una muestra biológica que se aborda
un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la
actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de
enfermedades, así como para otros muchos propósitos.

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos

métodos se basan en la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV,
para la formación de derivados químicos, o la capacidad que tienen las proteínas de unir
ciertos colorantes.

Para los métodos colorimétricos se necesita un: factor de calibración

Es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de una sustancia

(por ejemplo la albúmina sérica bovina) que se utiliza para determinar la cantidad de
proteínas presente en una muestra incógnita.

En determinaciones colorimétricas, se cumple una relación proporcional entre la

magnitud o intensidad de color que da una reacción y la cantidad del reactivo que la
provoca.

La intensidad de color se mide con un espectrofotómetro o colorímetro en función de las

concentraciones crecientes de la sustancia se obtiene una recta, y para esto
necesitaremos de la aplicación directa y útil de la Ley de Lambert y Beer ;que explica
esencialmente que a mayor cantidad de proteína, mayor cantidad de producto de
reacción y por lo tanto, mayor intensidad de color.

La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya

concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes,
reactivos) que absorben también a esa longitud de onda. Se debe descartar la
absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que
contenga todos los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta
muestra se llama blanco y la absorbancia de éste debe restarse a las muestras problema
y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0,
o sea 100% de transmitancia. (Rocca P., 2003, Bioquímica: Técnicas y métodos).
 II. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En el Cuadro 1 se presentan los datos obtenidos para el cálculo de creatinina total en la

muestra.

Cuadro 1: Datos para el cálculo de creatinina

BLANCO ESTÁNDAR MUESTRA

H2O DESTILADA 2 mL --- ---

SOL. ESTÁNDAR DE
--- 2 mL ---
CREATININA
MUESTRA CLASIFICADA
--- --- 2 mL
(FILTRADA)
PICRATO NA 1 mL 1 mL 1 mL
ABSORBANCIA
M1 0.148 0.090
M2 0.137 0.059
M3 0.157 0.060
M4 0.366 0.146
M5 0.144 0.044
M6 0.156 0.121
PROMEDIO
0.185 0.087

Sol .STOCK

100 mg ↔ 100 ml
0.6 mg ↔0.6 ml
−3
6 x 10 ↔ 1 ml
−2
1.2 x 10 ↔2 ml
−2
1.2 x 10 ↔3 ml
−3
4 x 10 ↔1 ml

Cst
Cm= xAm
Ast
 −3
4 x 10 0.04 −3
Cm= =1.081 x 10
0.148

1.081 x 10−3 ↔1 ml
3.243 x 10−3 ↔ 3 ml

3.243 x 10−3 ↔ 2ml ( filtrado )

−2
3.243 x 10 ↔ 20 ml
−2
3.243 x 10 ↔ 2ml
1.621↔ 100 ml
o De los tubos que se rotularon se tomaron pequeñas cantidades en las cubetas para
realizar la medición, “las diluciones necesarias para la medición se preparan
directamente en la cubeta del espectrofotómetro, esto para evitar posibles
contaminantes” (Adela Mauri, 2010).
o La cubeta del espectrofotómetro es de aproximadamente 1 cm, para realizar
cálculos más simples “se fotometra a continuación el contenido del matraz
poniendo para compensación agua destilada, la cubeta más apropiada suele ser de
3 cm” (Poggio Mesorama,1945)
o La lectura en el espectrofotómetro es de 520nm, para las muestras, ”la lectura
ideal en el espectrofotómetro se calibra a 420nm sin ningún agente ajeno a la
medición” (Instituto de Cirugía Urológica Avanzada (2002).
o La cantidad de creatinina en un bovino normal es 1.5mg/dl (Enciclopedia bovina,
2010), en la práctica se obtuvo un total de 2.8 mg/dl, es elevado, pero no lo
suficiente para diagnosticar un fallo renal importante (Clínica Dam, 2015).
o En humanos la creatinina oscila entre 0.5 a 1.4 mg/dL. La muestra nos arroja un
valor de 2.8 mg/dl, lo cual puede ser un signo de patologías asociadas al riñón
(Saunders Elsevier; 2007) como:
 Necrosis tubular aguda
 Deshidratación
 Nefropatía diabética
 Eclampsia
 Glomerulonefritis
 Insuficiencia renal
 III. CONCLUSIONES

 Al desproteinizar la muestra de sangre, se debió tomar con cuidado durante el

proceso del filtrado en el cual se trabajó con una solución proveniente de la,
“desproteinización de Folin- Wu”, donde se buscó separar la creatinina de la
presencia de glucosa , triglicéridos y colesterol en la sangre oxalatada para poder
obtener una muestra incolora .Durante este método un mal filtrado puede dar
valores no adecuados al usar el espectrofotómetro
 Los niveles altos de creatinina dan a entender que el organismo no funciona de una
manera adecuada.
 El ácido tungsteno es un eficiente desnaturalizador de la sangre lo cuales
beneficioso para el estudio de la creatinina

IV. BIBLIOGRAFÍA

 Mauri, A. & Llobat, M. & Herráez, R. (2010). Laboratorio de Análisis. Universidad

de Valencia. España. 304 p. Estraído de: https://books.google.com.pe/books?
id=YDvLEZ3AdLQC&pg=PA63&dq=determinacion+espectrofotometrica+de+la+
creatinina&hl=es-
419&sa=X&ei=uN1jVY6hOuG1sASG_IDACA&ved=0CCgQ6AEwAg#v=onepag
e&q=determinacion%20espectrofotometrica%20de%20la%20creatinina&f=false.
Última revisión: 02/10/2016.
 Gonzales, B. (s.f.). Deterinación de Espectrofotometría de Creatinina. [en línea]. 6
p. Extraído de:
http://www.academia.edu/3632352/
DETERMINACION_ESPECTROFOTOMETRICA_DE_CREATININA. Última
revisión: 02/10/2016.
 Univcersidad Nacional Autónoma de México (UNAM) Características Generales
del ganado bovino. México. 6 p. Extraído de:
http://www.fmvz.unam.mx/fmvz/e_bovina/
05CaracteristicasGeneralesdeBovinos.pdf. Última revisión: 02/10/16.
 Bazari H. Approach to the patient with renal disease. En: Goldman L, Ausiello D,
eds. Cecil Medicina. 23rd ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2007: pagina
115.

V. PROBLEMAS ENCARGADOS

1. Una disolución aislada de E. coli de una absorbancia de 0.7930 a 260nm en

una celda de 1cm a pH 4.5. Si el E1% 1cm es 197. calcular la concentración en
mg/ml.
Concentración ST/Absorbancia ST = Concentración Muestra/Absorbancia Muestra

(1mg)/Absorbancia E = X/0.7930

197 = X/0.7930

X = 156.221 mg/ml

2. Calcule el coeficiente de extinción molar a 361nm para la acuocobalamina en

tampón fosfato 0.1M a pH 7.0 a partir de los siguientes datos obtenidos en
una celda de 1cm.

SOLUCIÓN CONC. x10-5 M I0 I

A 2.23 93.1 27.4
B 1.90 94.2 32.8

Para “A” 2 –log(27.4)= (ε)(1)(2.23 x10-5)

A = ε.l.c ε = 0.56/2.23 x10-5

2 –log(93.1)= (ε)(1)(2.23 x10-5) ε = 25112.11

ε = 0.031/2.23 x10-5 Para “B”

ε = 1392.39 A = ε.l.c

A = ε.l.c 2 –log(94.2)= (ε)(1)(1.90x10-5)

 ε = 0.026/1.90 x10-5 2 –log(32.8)= (ε)(1)(1.90 x10-5)

ε = 1368.42 ε = 0.48/1.90 x10-5

A = ε.l.c ε = 25263.16

(25263.16+1368.42+25112.11+1392.39)/4 = 13284.02

3. En una determinación de glucosa se obtuvieron los siguientes resultados:

Glucosa (mg%) 50 75 100 125 150 175 200 250
Transmitancia 92.9 89.9 86.3 84.3 81.3 78.7 73.8 70.5

Hallar el factor de calibración promedio, y la concentración de 2 muestras de

suero que resultaron con una transmitancia de 88.3 y 85.11

Glucosa (mg%) 50 75 100 125 150 175 200 250

Transmitancia 92.9 89.9 86.3 84.3 81.3 78.7 73.8 70.5
Absorbancia 0.032 0.046 0.064 0.074 0.090 0.104 0.132 0.152
Factor de
1562.5 1630.43 1562.5 1689.19 1666.67 1682.69 1515.15 1644.74
Calibración

Factor de Calibración Promedio = 1619.23

Para un suero con transmitancia de 88.3

Concentración ST/Absorbancia ST = Concentración Muestra/Absorbancia Muestra

1619.23 = X/[2-log(88.3)]

1619.23 = X/0.054

X = 87.44mg/ml

Para un suero con transmitancia de 85.11

Concentración ST/Absorbancia ST = Concentración Muestra/Absorbancia Muestra

1619.23 = X/[2-log(85.11)]

1619.23 = X/0.070

X = 113.35mg/ml
4. Para evaluar un metabolito “x”, una muestra fue sometida a dilución
tomando una parte de ella con 4 partes de agua y luego fue comparada
espectrofotométricamente con un estándar de 10mg/ml obteniéndose las
siguientes lecturas de absorbancia: Blanco=0.0023, Estándar=0.357,
Muestra=0.677. calcule la concentración de la muestra en mg%.
Concentración ST/Absorbancia ST = Concentración Muestra/Absorbancia Muestra

10/0.357= X/0.677

X = 18.96mg/ml

94.8mg/ml de metabolito “x”

9480 mg%

5. ¿Qué es el factor de dilución? Explique mediante un ejemplo.

El factor de dilución es el número total de volúmenes al que se lleva un volumen dado

de muestra original, o parte alícuota. En otros términos, el factor de dilución también
corresponde a la división de la concentración de la muestra original sobre la
concentración de la muestra diluida.

Ejemplo: Cuando un volumen de una solución A de concentración 0,1 M se diluye con

un volumen de agua destilada, haciendo un total de 2 volúmenes de solución diluida, se
habla de una dilución 1:2 (también expresada como ½), y la concentración B teórica así
lograda es 0.05 M.

Si la dilución buscada es 1:10, se tomaría un volumen de la solución 0,1M y se

añadirían 9 volúmenes de disolvente, con lo que la concentración teórica lograda sería
0,01 M.

6. ¿Qué es el factor de calibración? Explique mediante un ejemplo.

El Factor de Calibración de una técnica fotométrica es absolutamente necesario para
determinar la concentración desconocida de la molécula en estudio, mediante la
ecuación de Lambert-Beer.

7. Explique la preparación de la muestra problema (sangre) para la

determinación de creatinina.
 Se depositará en un tubo de ensayo 14 mL de agua destilada, 2 mL de sangre, 2
mL de Na2WO4 (agente desproteinizante) y 2 mL de H2SO4. Aquí la sangre de
desnaturalizara por acción del Na2WO4. Se dejara reposar por unos minutos.
 Luego de someterá a filtrado, en este proceso las proteínas desnaturalizadas
(hemoglobina) quedará impregnado en el papel filtro.
 La sangre filtrada será incolora pero aun contendrá creatinina, glucosa,
triglicéridos entre otros. Pero, ya que el objetivo es obtener solamente creatinina,
la solución obtenida será sometida a una reacción (reacción de Jaffé) en donde se
le hará reaccionar con picrato, el cual formara ácido picrático.

8. Diferencias entre una solución stock, solución estándar y solución trabajo

 Solución estándar: Este término es utilizado de referencia tan concentrados que
no pueden ser usados directamente durante las mediciones, deben de ser diluidos
adecuadamente, se prepara con reactivos a alta pureza y se deben pesar con
exactitud la cantidad calculada para obtener la concentración.
 Solución stock: Es una solución estándar intermedia entre la solución madre y los
estándares de trabajo.
 Solución trabajo: Son solución estándar de concentración exactamente conocida
normalmente preparada por dilución conveniente de la solución stock y dentro del
rango de concentración establecida para el método utilizado.

9. ¿Qué función bioquímica cumple la creatinina? Escriba su fórmula.

Gran parte de la creatina se almacena en todos los músculos del cuerpo (alrededor del
90%), se sabe que un adulto que tenga 70 kg de peso corporal posee cerca de 120 g de
creatina. La finalidad del almacenamiento es la creación junto con el fósforo de la
fosfocreatina (PCr) presente en las células musculares de los vertebrados así como
algunos invertebrados, se encuentra presente con la enzima creatina quinasa. Los
músculos no son capaces de sintetizar la creatina y es por esta razón por la que la toman
del torrente sanguíneo. La creatina constituye la fuente inmediata y directa para
regenerar ATP (Adenosín trifosfato) un constituyente energético de las células
musculares.

Fosfocreatina+ ADP →Creatina+ ATP

10. ¿Qué papel cumplen los siguientes reactivos en la cuantificación de

creatinina?
 Tungstato de sodio: Es un desproteinizante utilizado para desnaturalizar y
precipitar la proteína (hemoglobina) por el cambio brusco que sufre por el cambio
de pH. A este proceso se le conoce con el nombre de “Desproteinizacion de Folin-
Wu”
 Ácido sulfúrico: Mantendrá el pH, que cambio a causa del tungstato de sodio,
constante
 Acido pícrico: Se basa en la reacción de Jaffé. La creatinina con el ácido pícrico
en medio alcalino formando un complejo de color rojo a una longitud de onda
entre 510 – 520 nm.

11. El coeficiente de extinción molar de un complejo yodo – glucógeno a 450 nm

es 0,20. Calcule la concentración del glucógeno en una solución de complejo
en yodo que tiene una absorbancia de 0,36, medida en una cubeta de 3 cm.
A=a . b . c
0,36=0,20 ×3 × c
c=0,6 M