MESA 1

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

Facultad de Ciencias
Departamento Académico de Química

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRÁCTICA 6: ESPECTRO DE ABSORCIÓN –

DETERMINACIÓN DE l ÓPTIMO

✔ Integrantes:
●
●
● Baez Barrientos, Nicolas Hans 20150430

✔ Docente: Ing. Gaby Espinoza Cordova

✔ Grupo: A
✔ Fecha de práctica: 27 / 01 / 20
✔ Fecha de entrega: 03 / 01 / 20

2020
 I. INTRODUCCIÓN

Los métodos espectrofotométricos son muy útiles debido a que se puede seguir de
forma continua el progreso de la reacción mediante métodos cinéticos (Frank Bradley,
1982).

La exactitud de un método espectrofotométrico varía según el instrumento usado (como

también el procedimiento): si bien el error instrumental suele ser de aproximadamente
+-1%, trabajando en condiciones favorables, el error puede disminuir hasta+-0,2%. Este
método es elegido entre varios por su sensibilidad y rapidez, aun siendo no muy exacta
su precisión (Eugene Olsen, 1990).

La ley de Beer, en la aplicación del análisis cuantitativo, cuando se realiza en una

mezcla, debe disponerse previamente el espectro correspondiente de cada una de las
sustancias puras. Tomando al espectro total en función de las bandas de estas (Eugene
Olsen, 1990).

En el análisis cualitativo el espectro infrarrojo es más útil en la identificación

cualitativa; que el espectro en la región ultravioleta y visible (Eugene Olsen, 1990).
 II. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
⮚ Determinación de del espectro de absorción de una sustancia coloreada
En el Cuadro 1 se presentan los datos utilizados para hallar el valor de λ óptimo para el
Naranja de Metilo. Asimismo, en la Figura 1 se presenta su espectro de absorción.

Cuadro 1: Determinación del λ óptimo para el Naranja de Metilo

λ 400nm 420nm 440nm 460nm 480nm

52.360
%T 67.764 58,614 54,954 50.816

A 0.169 0.232 0.260 0.294 0.281

Lambda Óptimo del Naranja del Metilo = 460nm

Espectro de absorción del Naranja de Metilo

0.35
0.3
0.25
Absorbancia

0.2
0.15
0.1
0.05
0
390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490
Longitud de onda (nm)

Figura 1: Espectro de absorción del Naranja de Metilo

En el Cuadro 2 se presentan los datos utilizados para hallar el valor de λ óptimo del
Azul de Bromofenol. Asimismo, en la Figura 2 se presenta su espectro de absorción.

Cuadro 2: Determinación del l óptimo para el Azul de Bromofenol

λ 520nm 560nm 580nm 600nm 620nm

%T 83 64.71 50.2 52.6 84.33

 A 0.076 0.189 0.300 0.279 0.074

Lambda Óptimo del Azul de Bromofenol = 580nm

Espectro de absorción del Azul de Bromofenol

0.35
0.3
0.25
Absorbancia

0.2
0.15
0.1
0.05
0
500 520 540 560 580 600 620
Longitud de onda (nm)

Figura 2: Espectro de absorción del Azul de Bromofenol

⮚ Preparación de la curva de calibración del Azul de Bromofenol

TUBO N O BLANCO T1 T2 T3 T4 T5

Sol.trabajo(mL) ---- 2 4 6 8 10

H 2 O destilada(mL) 10 8 6 4 2 0

Absorbancia ---- 0.064 0.132 0.198 0.269 0.323

Concentración(mg/mL) ---- 8 X 10−4 16 X 10−4 24 X 10−4 32 X 10−4 4 X 10−3

mg% ---- 8 X 10
−2
16 X 10
−2
24 X 10
−2
32 X 10
−2
4 X 10
−1

ug/mL ---- 8 X 10−1 16 X 10−1 24 X 10−1 32 X 10−1 4

ppm ----- 8 X 10
−1
16 X 10
−1
24 X 10
−1
32 X 10
−1 4
 Constante de absortividad= 371.54

Figura 3: Curva de calibración del Azul de Bromofenol

⮚ Preparación de la curva de calibración del Naranja de Metilo

TUBO N O BLANCO T1 T2 T3 T4 T5

Sol.trabajo(mL) ---- 2 4 6 8 10

H 2 O destilada(mL) 10 8 6 4 2 0

Absorbancia ---- 0.059 0.123 0.197 0.260 0.317

Concentracion(mg/mL) ---- 8 X 10−4 16 X 10−4 24 X 10−4 32 X 10−4 4 X 10−3

mg% ---- 8 X 10
−2
16 X 10
−2
24 X 10
−2
32 X 10
−2
4 X 10
−1

ug/mL ---- 8 X 10−1 16 X 10−1 24 X 10−1 32 X 10−1 4

ppm ----- 8 X 10
−1
16 X 10
−1
24 X 10
−1
32 X 10
−1 4
 Constante de absortividad = 80.786

Figura 4: Curva de calibración del Naranja de Metilo

Para el caso de Azul de Bromofenol se realizaron 4 mediciones a 520, 560, 580 y 600
nm, obteniendo como lambda óptimo a 580 nm con una absorbancia de 0.300, ya que a
600 nm empezaba a disminuir la absorbancia. Esta longitud de onda coincide con los
valores obtenidos experimentalmente por Hernández et al (2002), que obtuvo un lambda
óptimo de 580 nm y una absorbancia de 0.352, esto es debido a que las moléculas tienen
un estado excitación que las distingue del resto de las otras, el estado de excitación se da
cuando la molécula absorbe un fotón y como consecuencia aumenta la energía de la
molécula, estos cambios dependen de las transiciones electrónicas entre los estados de
energía individual de la molécula (Markzenko et al, 2000).

Para el naranja de metilo se obtuvo un lambda óptimo de 460 nm, con una absorbancia
de 0.294, estos son similares a los datos obtenidos por Hernández et al. (2002), los
cuales fueron de 460 nm y 0.307 de absorbancia. Así mismo en el reporte presentado
por (Palacio & Gallegos, 2011) también se reporta 460nm como el lambda óptimo, esto
indica que antes del óptimo la absorbancia es menor y después del óptimo la
absorbancia fue mayor durante el experimento. Según Sogorb & Vilanova (2004), la
diferencia entre los resultados es debido por una mala calibración del equipo o un mal
manejo del operador al momento de tomar la muestra.
 III. CONCLUSIONES

 Aprendimos el manejo del espectrofotómetro y su utilidad para medir la

absorbancia de una solución.
 Se determinó experimentalmente el lambda óptima de absorción (λ) del azul de
bromofenol y el naranja de metilo mediante la medición de estas a diferentes
longitudes de onda (λ) dentro del rango de luz visible hasta encontrar la
absorbancia máxima, obteniendo para el azul de bromofenol un landa de 580
nm.
 Aplicamos la ley de Lambert y Beer concluyendo que la diferencia entre
intensidades del rayo incidente con el emergente (absorbancia) es proporcional a
la longitud de trayectoria y a la concentración de la solución.
 Evidenciamos la relación lineal entre la absorbancia y la concentración
propuesta por la ley de Beer al preparar la curva de calibración cuyo eje de
ordenadas es la absorbancia y el eje de abscisas contiene la cantidad de
concentración de forma ascendente, para hallar la pendiente “a” que sería el
coeficiente de la absorbancia.
 Aprendimos a hallar la concentración en mg/ml de una solución y expresarlo en
otras unidades de medida.
 IV. BIBLIOGRAFÍA

⮚ Hernández L., González C. (2002). Introducción Al Análisis Instrumental.

Barcelona. Editorial Ariel S.A. 453p.
⮚ Markzenko, Z., Balrcerzak, M. (2000). Separation, Preconcentration and
Spectrophotometryin Inorganic Analysis. 1° Edition. Netherlands. Ed Elsevier.
521p
⮚ Sogorb Sánchez, M.A. Vilanova, E. (2004). Técnicas Analíticas De Contaminantes
Químicos: Aplicaciones Toxicológicas Medioambientales Y Alimentarias. Ed. Díaz
De Santos. España. 320p.

⮚ Palacio, J., & Gallegos, J. (2011). Biología de la Celula I: Espectrofotometria.

Medellin.
⮚ F. B. Armstrong, Frank Bradley. Bioquímica. 1era edición. España: Editorial
Reverté, S. A.; 1982.
⮚ Brunatti, C; Martín, A. Introducción a la Espectroscopía de Absorción Molecular
Ultravioleta, Visible e Infrarrojo Cercano. Consultado 14 de Octubre del 201

V. PROBLEMAS ENCARGADOS

1. Hallar la concentración de una muestra de suero si su absorbancia es de

0.280 y las absorbancias del estándar son:
TUBO Absorbancia Concentración

1 0.100 10mg

2 0.200 20mg

3 0.300 30mg

0.280 🡪 X

0.300 🡪 30

X = 28mg
2. El coeficiente de extinción molar del NaOH es 6x10-3 cm-1 M-1 ¿Cuál será la
concentración de la muestra que tiene una absorbancia de 0.720 diluida la
mitad y puesta en una cubeta de 1cm de espesor?

A = ε.l.c

0.720 = (6x10-3)(1)c

c = 120 M

3. Una solución que contiene 2g/L de una sustancia que absorbe luz en una
cubeta de 1cm trasmite el 75% de la luz incidente. Calcule la transmitancia
de una solución que contiene:
a. 4g/L
A = ε.l.c

A = (15.625)(1)(16x10-3)

A = 0.25

T = 10(2-A)

T= 56.23

b. 1g/L
A = ε.l.c

A = (15.625)(1)(4x10-3)

A = 0.0625

T = 10(2-A)

T= 86.60

c. 5.4g/L
 A = ε.l.c

A = (15.625)(1)(21.6x10-3)

A = 0.3375

T = 10(2-A)

T= 45.97

d. Si el peso molecular del compuesto es 250, calcule el

coeficiente de extinción molar.

A = 2 – log T%

A = 2 – log75%

A = 0.125

250 g 🡪 1 Mol

1g🡪X

X = 4x10-3

A = ε.l.c

0.125 = ε(1)( 8x10-3)

ε =15.625 cm-1 M-1

4. Una solución 10-5 M de ATP tiene una transmitancia de 0.702 (70.2%) a

260mm en una cubeta de 1cm. Calcular:
a. La transmitancia de la solución en una cubeta de 3cm.
b. La densidad óptica de una solución en cubetas de 1cm y 3cm
c. La densidad óptica y la transmitancia de una solución de ATP 5x10-
5 M.
 A = 2 – log T%

A = 2 – log70.2%

A = 0.154

A = ε.l.c

0.154 = ε(1)(10-5)

ε =15400 cm-1 M-1

a. La transmitancia de la solución en una cubeta de 3cm.

A = ε.l.c

A = (15400)(3)(10-5)

A = 0.462

T = 10(2-A)

T= 34.51

b. La densidad óptica de una solución en cubetas de 1cm y 3cm

Para una cubeta de 1 cm

A = ε.l.c

A = (15400)(1)(10-5)

A = 0.154

Para una cubeta de 3 cm

A = ε.l.c
 A = (15400)(3)(10-5)

A = 0.462

c. La densidad óptica y la transmitancia de una solución de ATP 5x10 -5

M.
A = ε.l.c

A = (15400)(1)(5x10-5)

A = 0.77

Transmitancia = 16,98%

5. Con los siguientes datos, hacer en un solo papel milimetrado, las tres curvas
de absorción de la Hb en sus estados desoxihemoglobina, oxihemoglobina y
cianohemoglobina, indicando cada curva con diferente color o marca.
Grafique en sistema (xy) longitud de onda D.O respectivamente. Identificar
para cada curva obtenida el o los puntos de máxima absorción.

LONGITUD DE Hb HbO2 HbCN

ONDA (nm) D.O D.O D.O

470 0.07 0.34 0.46

475 0.05 0.31 0.40

480 0.06 0.27 0.35

485 0.11 0.24 0.32

490 0.15 0.21 0.28

495 0.18 0.18 0.27

500 0.23 0.17 0.28

505 0.25 0.20 0.29

510 0.34 0.24 0.30

 515 0.35 0.30 0.33

520 0.40 0.38 0.35

525 0.45 0.50 0.38

530 0.47 0.58 0.42

535 0.52 0.67 0.47

540 0.54 0.70 0.53

545 0.57 0.66 0.54

550 0.62 0.62 0.52

555 0.66 0.57 0.51

560 0.70 0.56 0.49

565 0.78 0.50 0.47

570 0.72 0.58 0.42

575 0.68 0.68 0.32

580 0.65 0.80 0.24

585 0.60 0.70 0.22

590 0.51 0.57 0.15

595 0.47 0.40 0.12

600 0.13 0.18 0.05

a. ¿Qué importancia tiene la longitud de onda?

La longitud de onda permite calcular la cantidad de luz que absorbe una solución
en una región del espectro determinado. También permite conocer la cantidad de
energía radiante que una sustancia absorbe.
 b. ¿Por qué en la gráfica no coinciden los puntos de máxima absorción
a pesar de pertenecer las 3 graficas a la Hb?
Si es cierto que las tres sustancias son hemoglobina, no se trata del mismo
complejo de hemoglobina, es decir su base es la misma pero no la sustancia en su
conjunto, teniendo diferentes características, entre ellas, la más notoria su pH,
dando como resultado diferentes valores de longitudes de ondas óptimos para sus
estudios.

6. A partir de una solución stock de sulfato de Cu de 10g% se preparó la

siguiente batería:
Tubo Nº1 Nº2 Nº3 Nº4

Solución stock Cu 0.25mL 0.5mL 2.0mL 4.0mL

H2O destilada 9.75mL 9.5mL 8.0mL 6.0mL

Exprese las concentraciones de cada uno de los tubos en ppm y en mg% (en
forma tabular)

10g 🡪 100 mL

X g 🡪 lo extraído

X=M

M g 🡪 10 mL

X g 🡪 100 mL

Y g 🡪 1000 mL

Tubo Nº1 Nº2 Nº3 Nº4

ppm (Y) 2.5 5 20 40

mg% (X) 0.25 0.5 2.0 4.0