LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Informe de Laboratorio Practica #2

Extracción, cuantificación y separación de proteínas del suero sanguíneo

Nombres: Thiaré Melissa Quintero Marriaga, Juan Sebastian Villero

Resumen:
La cuantificación de proteínas hace referencia a la medición de concentración de
proteína(s) total(es) es una muestra. Para esta práctica se realizó una cuantificación
de proteínas presentes en el suero sanguíneo, esto por medio de dos métodos
principales: la separación de globulinas mediante precipitación con solución salina y
la concentración de proteínas totales, globulinas y de albúminas por foto
colorimetría. Se pudo observar la concentración de las proteínas en cada suero
sanguíneo, mediante cálculos con la ecuación de Beer, y la curva de calibración de la
albúmina; haciéndose una comparación de estas con los valores fisiológicos normales
en los seres humanos.
La cuantificación de proteínas actualmente sirve para el diagnóstico de enfermedades
que alteran dichas proteínas de la sangre.

Palabras clave: Globulinas, proteínas, albúminas, Salting out/Salting in, solubilidad,

cuantificación, precipitación.

1. Introducción
Las proteínas son macromoléculas las cuales desempeñan el mayor número de funciones en las
células de los seres vivos. Forman parte de la estructura básica de tejidos (músculos, tendones,
piel, uñas, etc.), durante todos los procesos de crecimiento y desarrollo, crean, reparan y
mantienen los tejidos corporales; además desempeñan funciones metabólicas (actúan como
enzimas, hormonas, anticuerpos) y reguladoras a saber: asimilación de nutrientes, transporte de
oxígeno y de grasas en la sangre, eliminación de materiales tóxicos, regulación de vitaminas
liposolubles y minerales, etc.(Garrett and Grisham, 2004, p. 1216)

Por su alta funcionalidad en todo organismo vivo las proteínas deben encontrarse en una gran
proporción en estos, por lo que en esta práctica se hace uso de la foto colorimetría como método
para determinar la proporción en la que se encuentran en el suero sanguíneo.
Debido al amplio rango de proteínas que existen y que estas se diferencian unas de otras los
criterios de clasificación usados en estas son varios, entre los cuales se destacan:
Clasificación por presencia de grupos prostéticos: este criterio se basa en los grupos que
constituyen a las proteínas las cuales son simples si estos grupos son solo aminoácidos o son
conjugadas si contienen otro tipo de grupos aparte de los aminoácidos.
Clasificación por solubilidad: este criterio da nombre a las proteínas dependiendo del medio en el
cual estas son solubles. Algunos de los nombres son Albúminas, Globulinas, Prolaminas, etc.
Clasificación por forma estructural: este criterio distingue las proteínas entre proteínas fibrosas,
las cuales son las que presentan una estructura secundaria bien definida y las proteínas
globulares, las cuales tiene una estructura secundaria que se pliega para así dar paso a las
estructuras terciaria o cuaternaria.
La sangre se compone de 2 partes las cuales son, las células que se encuentran suspendidas en
esta como glóbulos rojo y blancos, etc; y el plasma que es el medio líquido que mantiene a las
células en suspensión. Cuando la sangre se coagula el líquido resultante recibe el nombre de
suero sanguíneo el cual se compone mayormente de proteínas solubilizadas, las principales
proteínas presentes en este son: albúmina, globulinas, α-globulinas, β-globulinas y γ-globulinas.
Para poder separar las proteínas del medio en el que se encuentran se han desarrollado varios
métodos en los cuales se toma ventaja de las características que diferencian a estas de otras
moléculas en el medio, entre las cuales se encuentran su carga, su masa, solubilidad, etc.
En la presente práctica se hace uso de la centrifugación que aprovecha la masa de las proteínas
para que estas se precipitan y del efecto Salting-Out el cual produce que la solubilidad de las
proteínas se vea reducida añadiendo una concentración de sales muy alta al medio donde estas se
encuentran.
2. Materiales y métodos
A continuación, se presenta la metodología usada, paso a paso de lo realizado en la práctica #2 de
Cuantificación de proteínas:
Antes de esto, cabe mencionar los materiales utilizados:
 Fotocolorímetros: Colorímetro Vernier y Tableta de adquisición de datos LabQuest-2,
Genesys y Boeco.
 Reactivo de Biuret: Sulfato de cobre, tartrato de sodio y potasio, hidróxido de sodio.
 Solución Patrón de albúmina.
 Solución salina al 0.9%.
 Suero sanguíneo humano.
  Centrífuga.
 Solución saturada de (NH4)2SO4.
Para la medición de las sustancias se utilizaron pipetas graduadas de 2 ml.

Figura 1.
Diagrama de la separación de las globulinas en el suero sanguíneo
 Figura 2. Diagrama de la preparación de proteínas totales

Figura
3. Diagrama de la medición de la absorbancia en las distintas soluciones de proteínas
 Figura 4. Diagrama de preparación de la curva de calibración

3. Resultados y Discusión
 Resultados medición de absorbancia de las soluciones de proteínas

Tabla 3.1. Absorbancia de las soluciones de proteínas

Solución
Solución Solución Solución
Tubo patrón de Solución Abs
Contenido NaCl de de
No. Albúmin de suero (nm)
0.9% globulinas Biuret
a
1 Blanco 2.0 ml ------ ----- ----- 4.0 ml 0
2 Patrón 1.0 ml 1.0 ml ----- ----- 4.0 ml 0.215
3 Globulinas 1.0 ml ----- 1.0 ml ----- 4.0 ml 0.181
4 Prot. Total 1.0 ml ----- ----- 1.0 ml 4.0 ml 0.159

 Resultados de la preparación de la curva de calibración de albúmina

Tabla 3.2 Curva de Calibración de la Albúmina

Solución
Solución Solución de Concentración
Tubo patrón Absorbancia
NaCl 0.9% Biuret (g/ml)
Albúmina
Blanco 0.0ml 2.0ml 4ml 0 0
1 0.3ml 1.7ml 4ml 0.000225 0.215
2 0.5ml 1.5ml 4ml 0.000375 0.281
3 0.7ml 1.3ml 4ml 0.000525 0.314
4 1.0ml 1.0ml 4ml 0.00075 0.366
5 1.2ml 0.8ml 4ml 0.0009 0.395
6 1.5ml 0.5ml 4ml 0.001125 0.449
 Absorbancia vs Concentración
0.5
0.45 f(x) = 352.195402298851 x + 0.092348275862069
0.4
Absorbancia (nm)
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.001 0.0012
Concentración g/ml

Gráfica 1. Curva de calibración de la Albúmina

El suero sanguíneo contiene en su mayoría proteínas solubilizadas; durante la realización de esta

práctica se usaron diferentes métodos para la cuantificación las estas proteínas presentes en una
muestra de suero sanguíneo de un donante.
Dicho esto, en la primera parte de la práctica correspondiente a la separación de las globulinas en
el suero, se utilizó dos métodos de aislamiento y purificación de proteínas, el efecto Salting–Out
(mediante sulfato de amonio), y el efecto Salting–In (por cloruro de sodio).
En primer lugar, el efecto Salting-Out es un método que consiste en disminuir la solubilidad de
las proteínas en un medio donde la concentración de sales es muy alta. El exceso de los iones
salinos desplaza a un gran número de moléculas de agua para su hidratación, que estaban
rodeando y solvatando a los macro iones proteínicos; en consecuencia, éstos se podrán acercar y
precipitar. (1)
Para esta práctica se utilizó sulfato de amonio concentrado con el fin de precipitar las globulinas,
esto debido a que se trata de una sal que, naturalmente se disocia en iones amonios e iones
sulfatos cuando se encuentra en soluciones acuosas; entonces, estos iones de sal son altamente
solubles en agua y por lo tanto su capacidad de hidratarse es mayor en comparación con otras
moléculas, el sulfato se une al agua formando puentes de hidrogeno, haciendo que el agua no
interactúe con el compuesto que se está purificando, en este caso las globulinas, y por lo tanto
estas mismas se deshidratan, lo que las lleva a que se precipiten.
Como se puede ver en su estructura ya disociada, el
sulfato de amonio presenta dos iones de amonio NH4+ y
un ion de sulfato SO42-, estos dentro de la solución acuosa
se sienten atraídos por las cargas opuestas de la proteína,
Imagen 1. “Iones del sulfato de amonio”
Tomada de March 23, 2023, from
y es por eso que las moléculas de agua deben “competir”
https://www.laboratoriumdiscounter.nl/es/quimi
cos/a-z/a/sulfato-de-amonio/
entre la disolución de sal o de la proteína, causando que
se precipiten en forma concentrada las globulinas. (2)
Por otro lado, el efecto Salting–in, es un método donde la solubilidad de la proteína aumenta a
medida que la concentración de sal aumenta también, la sal que se usó para lograr este efecto fue
el cloruro de sodio.
Debido a que el cloruro de sodio no tiene fuerzas iónicas muy fuertes, no es capaz de precipitar la
proteína, pero si facilita que se solubilice, por tanto, esta sal se utilizó para disolver el precipitado
que se obtuvo anteriormente de las globulinas.
Ahora que se mencionó a las fuerzas iónicas, es importante resaltar como estas afectan la
solubilidad de las proteínas y porqué justamente gracias a estas se empleó el sulfato de amonio
para la precipitación.
En general, las sales neutras tienen efectos sobre la solubilidad de proteínas globulares, a baja
concentración de estas, las sales incrementan la solubilidad de muchas proteínas, lo que se
conoce como solubilización por salado. La capacidad de estas sales para influir en la solubilidad
de las proteínas está dada por la fuerza iónica de cada una, esta fuerza se constituye en la
concentración y número de cargas eléctricas que hay en los iones (cationes y aniones) que aporta
la sal al disociarse en soluciones acuosas. A medida que esta fuerza iónica aumenta, la
solubilidad de una proteína comienza a disminuir, y a una fuerza iónica bastante elevada estas
mismas se precipitan. Básicamente lo que provoca esta fuerza iónica es que los iones donados por
la sal que se adicione a la solución sean altamente afines a las moléculas de agua y ganen la
interacción con esta, suspendiendo la interacción de los grupos ionizables de las proteínas con el
agua. (3)
El sulfato de amonio tiene una fuerza iónica mayor al del cloruro de sodio ya que, como se
mencionó antes, este de disocia en iones cargados positiva y negativamente, son estos iones
divalentes quieres forman enlaces con el agua del medio, provocando así que la solubilidad de la
proteína disminuye, y que finalmente se precipite, mientras que el cloruro de sodio no tiene esta
misma capacidad ni son tan eficientes para la precipitación de las proteínas porque no tienen una
alta fuerza iónica, sus iones monovalentes no tienen cargas lo suficientemente fuertes en
comparación con el sulfato de amonio. (4)
Cerrando esta primera parte, se pasó luego a preparar la solución de proteínas totales,
agregándole solución salina al suero sanguíneo, posteriormente a esto se realizó la medición de
absorbancia de las soluciones de proteínas mediante el fotocolorímetro, de donde se obtuvo los
resultados contenidos en la tabla 3.1, con estos datos y la ecuación de Beer-Lambert se pudo
realizar los cálculos de las concentraciones en %p/v y otras unidades de concentración de esta
manera:

Cdesc=Cpat∗ ( Adesc
Apat )
Para las globulinas

Cglobul=Cpat∗ ( Aglobul
Apat ) =
100 ml ( 0.215 )
0.45 g 0.181
∗

g
Cglobul=0.0038
ml

p g
% =0.0038 ∗100=0.38 %
v ml
Para las proteínas
Cprot=Cpat∗ ( Aprot
Apat )=
100 ml ( 0.215 )
0.45 g 0.159
∗

g
Cprot=0.0033
ml

p g
% =0.0033 ∗100=0.33 %
v ml

Dado que estás son las concentraciones en disolución, se vió necesario multiplicarlas por su
factor de dilución cada una para obtener las concentraciones originales de cada una:
C i globulinas=Cglobulinas∗5
 g g
C i globulinas=0.0038 ∗5=0.020
ml ml
p g
% =0.020 ∗100=2 %
v ml

C i proteinas=Cproteinas∗20

g g
C i proteinas=0.0033 ∗20=0.066
ml ml
p g
% =0.066 ∗100=6.6 %
v ml

Para la determinación de la concentración de albúmina, se restó los valores de la concentración

original de proteínas totales menos la concentración original de globulinas:
C i Albúminas=C i proteinas totales−C i globulinas

Proteína Total Globulinas Albúminas

Concentraciones obtenidas (%p/v) 6.6% 2% 4.6%
g/dl 6.6 2.0 4.6
mg/ml 66 20 46
g/L 66 20 46
g/ml 0.066 0.020 0.046
Concentración fisiológica 6 – 8 g/dl 2.3 – 3.4 g/dl 3.2 – 5.4 g/dl
normal
g g g
C i Alb ú minas=0.066 −0.020 =0.046
ml ml ml
g
C i Alb ú minas=0.046
ml

Tabla 3.3. Datos de las concentraciones de proteína total, globulinas y albúmina en

diferentes unidades de medición.
Teniendo estos datos, se realizó una comparación con las concentraciones fisiológicas adecuadas
que hay en el suero sanguíneo de una persona adulta promedio. (5)
El único dato que se puede ver diferente a este rango estipulado es la concentración de la
globulina, si se observa en la tabla, la concentración que se obtuvo se encuentra un poco por
debajo de ese rango (0.3 por debajo), aunque la diferencia no sea mucha, este se pudo deber a
errores durante la práctica, medición de la sustancia/solventes o al aproximamiento de las cifras
durante el cálculo de las concentraciones; también se le podría atribuir esto a la procedencia del
suero sanguíneo, ya que las bajas concentraciones de globulinas en este pueden ser un signo de
enfermedad del hígado o riñones, y de ahí se puede decir que el donante talvez tenía alguna
enfermedad de este tipo. (6)
Por último, se realizó la curva de calibración de la albúmina mediante foto colorimetría y se pudo
observar las concentraciones de esta a diferentes absorbancias, estos datos se establecieron en la
tabla 3.2 y la gráfica 1, de donde se obtuvo la ecuación de la recta. Esta ecuación fue utilizada
como segundo método para hallar las concentraciones de proteínas totales, globulinas y
albúminas; para esto se realizó una interpolación en la gráfica con los nuevos datos de la
siguiente manera:
y=352 , 2 x+ 0,0923
En esta ecuación tenemos la absorbancia (y) en función de la concentración (x), por lo que fue
necesario poner la concentración en función de la absorbancia y obtener una nueva grafica para
hallar los datos requeridos.
y−0,0923
x=
352 ,2
 Concentración vs Absorbancia
0.0012

0.001
f(x) = 0.00247864957913947 x − 0.000158124592837389
Concentración g/ml
0.0008

0.0006

0.0004

0.0002

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5
-0.0002
Absorbancia (nm)

Gráfica 2. Curva de calibración concentración vs Absorbancia

(Nota: la ecuación obtenida en esta gráfica equivaldría a la misma que fue despejada
anteriormente).
Obtenida la ecuación hallamos las concentraciones respectivas de las globulinas y proteínas
totales con el dato de sus absorbancias:
0,181−0,0923
x ( globulinas )= ∗6=0.00152 g /ml
352 , 2

0,159−0,0923
x ( prot . totales )= ∗6=0.00114 g /ml
352 , 2

Posteriormente se multiplicaron las concentraciones por sus respectivos factores de dilución para
obtener las C i originales.
g g
C i globulinas=0.0015 2 ∗5=0.0076
ml ml

g g
C i proteinas totales=0.0011 4 ∗20=0.0227
ml ml
Como último procedimiento se realizó una comparación entre las concentraciones obtenidas por
ambos métodos, y se puede observar que el por método de la curva de calibración y por la
comparación con la solución patrón con la ley de Beer dan concentraciones muy diferentes entre
sí, pero el método que dio las concentraciones similares a las fisiológicas normales fue el
segundo mencionado, ya que al tratarse de cálculos numéricos, estos pueden ser más exactos y
precisos a la hora de reportar resultados de los datos, por lo que considero que es un mejor
método; mientras que, el método de la curva de calibración a se pude decir que es bastante
cualitativo y puede presentar muchos errores a la hora de medir la absorbancia por foto
colorimetría o simples errores de medición durante el proceso.

4. Conclusiones
Para poder conocer de manera cuantitativa las concentraciones en las que se encuentran los
diferentes componentes de interés del suero sanguíneo lo mejor es llevar a cabo una medición de
la absorbancia de estos para lo cual se necesita tener por separado cada componente, lo cual es
posible conociendo las diferentes características de estos y como se comportan ante cambios en
su medio, por ejemplo la concentración de sales, debido a este conocimiento se puede aislar y
purificar de manera eficaz al componente en cuestión. Las mediciones de absorbancia obtenidas
son usadas para hallar las proporciones en la cual se encuentran los componentes del suero
sanguíneo que se tenía de muestra por medio de la ley de Beer, se encuentra que las proporciones
en general se encuentran dentro del rango promedio o se acercan mucho a este, sin embargo estas
mediciones se encuentran sujetas a errores en los equipos o en el proceso y tratándose de suero
sanguíneo también se toma en cuenta el posible caso en el que el donante tenga alguna condición
que produzca las anormalidades en las proporciones.

5. Bibliografía

(1) (N.d.). Edu.Co. Retrieved March 24, 2023, from

https://unvirtual.medellin.unal.edu.co/pluginfile.php/396796/mod_resource/content/4/PR

%C3%81CTICA%20No%202.%2001_2023.pdf.

(2) Sulfato de amonio. (n.d.). Laboratorium Discounter. Retrieved March 23, 2023, from

https://www.laboratoriumdiscounter.nl/es/quimicos/a-z/a/sulfato-de-amonio/.
(3) SOLUBILIDAD DE LAS PROTEINAS: EFECTO DE LA FUERZA IONICA. (n.d.). Ull.Es.

Retrieved March 23, 2023, from https://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/8.pdf.

(4) (N.d.). Edu.Ar. Retrieved March 23, 2023, from

http://ufq.unq.edu.ar/Docencia-Virtual/BQblog/Salting-in-Salting-out-precipitacion-

solventes.pdf.

(5) El Médico Interactivo, Diario Electrónico de la Sanidad. (n.d.). Retrieved March 23, 2023,

from http://2011.elmedicointeractivo.com/formacion_acre2004/tema18/apl3.

(6) Proteínas totales, cociente albúmina-globulina (A/G). (n.d.). Labtestsonline.es. Retrieved

March 23, 2023, from https://www.labtestsonline.es/tests/proteinas-totales-cociente-

albumina-globulina-ag.

(7) Garrett R. H., y C. M Grisham 2004. Biochemistry Brooks Cole Publisher. Charlottesville,

VA, USA. p 1216