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La replicación es posible porque una hebra puede ser el molde par su hebra complementaria.
Para que la información se pueda pasar, se requiere que la replicación sea fidedigna, por lo
que se tiene un conjunto de sistemas de síntesis, revisión y reparación que dan una tasa de
error de 1 en 3 x 109 bases. Aun así, el ADN está expuesto a otros factores que pueden afectar
su integridad y un fallo en el sistema de reparación podría ser determinante en la aparición de
un cáncer. Una posible lesión es la escisión de la doble hebra de ADN, que compromenten su
rol como moldes para próximas cadenas, esta lesión es reparada mediante un proceso de
recombinación.
La formación de las cadena es catalizada por una DNA polimerasa, actúan cuando el nucleótido
ya ha establecido contacto con la hebra molde, por lo que la DNA polimerasa es una enzima
dirigida por un molde. La DNA polimerasa catalizará el ataque del hidroxilo del carbono 3 de la
cadena que se está formando con el fosfato alfa del nucleótido que se va a añadir. Para que la
reacción se de se requiere un cebador que de un hidroxilo en el extremo 3, ya que el
nucleótido no se puede añadir de frente a la hebra molde. Una enzima que sí puede actuar sin
cebador es la ARN polimerasa.
Las DNA polimerasas tienen una unidad polimerasa en forma de mano. Se ha identificado cinco
tipos de ADN polimerasas, pero en todos los casos los dominios que conforman los dedos de la
unidad polimerasa se enrrollan sobre el ADN y lo mantienen en el sitio activo, todas usan dos
iones metálicos para realizar la polimerización
Hay dos iones metálicos en el centro activo, uno se une al desoxinucleotido trifosfato y el otro
al hidroxilo de la posición 3 del cebador, el otro solo se une al desoxirribonucleótido trifosfato.
Normalmente estos son iones magnesio +2, y son unidos por un grupo carboxilato de un
aspartato del dominio de palma, algo que también los mantiene en el lugar y la orientación
correcta. Los iones estabilizan la carga negativa generada en un estado de transición en la
reacción.
La unión del desoxirribonucleótido que contenga la base complementaria está muy favorecida,
si bien la formación de puentes de hidrógeno es importante, la complementariedad lo es aún
más. La importancia de la complementariedad es porque:
Las DNA polimerasas donan puentes de hidrógeno a las bases del surco menor y los
aceptores siempre se encuentran en las mismas posiciones.
La unión de la base al centro activo provoca un cambio conformacional que formará
una cavidad que solo admitirá a la base adecuada, la formación de este bolsillo
favorece la eficacia y hace que el proceso sea más fidedigno.
1.1.5. Un cebador de ARN sintetizado por una primasa permite el comienzo de la síntesis
de ADN
El cebador, que tiene el grupo hidroxilo en el cabono 3 libre, es generado por primasas. Estas
sintetizan fragmentos cortos de ARN, que son complementarios a alguna parte del ADN molde,
la primasa puede empezar la síntesis sin un cebador. Cuando se inicia la síntesis de ADN, el
fragmento de ARN se reemplaza por uno de ADN
1.1.6. Una de las hebras del ADN se sintetiza de forma continua mientras que la otra
hebra se sintetiza a base de fragmentos
1.1.7. La DNA ligasa une a los fragmentos del DNA en regiones de doble hebra
La unión de los fragmentos de Okazaki se da gracias a una DNA ligasa que cataliza la formación
de un enlace entre al hidroxilo del carbono 3 de la hebra que está creciendo y el fosfato del
carbono 5 del nucleótido a ser agregado. Como esta reacción no es espontánea, se requiere
del uso de ATP. Las subunidades de la ligasa presentan un bucle P en el dominio dNTPasa, ese
mismo bucle P posee dos nuclrs que interaccionan con el ADN
1.1.8. La separación de las hebras del ADN requiere helicasas específicas y la hidrolisis de
ATP
Para que se pueda formar la horquilla de replicación, deben actuar una serie de helicasas, la
separación de la horquilla se dará también en necesidad de cable. Presenta una subunidad que
tiene actividad NTPasa con un plegamiento en bucle P, que tiene dos plegamientos que ayudan
a anillar e interaccionar con el ADN. La helicasa consta de 6 subunidades localizadas en forma
de anillo, estas subunidades se dividen en tres, dependiendo su orientación alrededor del eje
del plano del anillo, esats diferencias también afectan la posición del bucle de unión al ADN.
Entonces el mecanismo sería que la helicasa, que presenta seis subunidades, de estas dos se
unen a ATP, dos presentan ADP + P y las otras dos están vacías. El ADN se va a ubicar en los
bucles de dos subunidades adyacentes, una que tenga unido ATP y otra que tenga ADP + P,
cuando se unen dos ATPs a los dos sitios que estaban vacíos y liberarse el ADP + P de los otros
dos sitios, se provoca un cambio conformacional de la helicasa que provoca que el DNA avance
a través de la helicasa
1.2. El desenrollamiento y el superenrollamiento del ADN están controlados por las
topoisomerasas:
La helicasa separa las bases con el ADN desenrrollado, como las hélices de ADN tienden a
plegarse sobre sí mismas y formar estructuras mediante un superenrollamiento, este proceso
debe ser evitado pro unas topoisomerasas, enzimas que regulan el proceso de enrollamiento y
superenrollamiento. Se puede dar cambios con el DNA enrollado, donde se unirían sus
extremos para formar un ADN circular relajado. Si el ADN ya ha sido desenrollado, hay dos
opciones:
1.2.1. El número de enlace del ADN, una propiedad topológica, determina el grado de
superenrollamiento
Una propiedad topológica del ADN circular es el número de enlace, que es el número de veces
que una hebra se enrolla en sentido dextrógiro alrededor del eje de la hélice cuando este eje
se confina en un plano. Las moléculas que solo se diferencien en su número de enlace son
topoisomeros, estos se pueden interconvertir si se corta una o las dos hebras de ADN y se
vuelven a unir. También debemos considerar el giro, que es una medida del grado de
enrollamiento helicoidal de las hebras entre sí, mientras que la torsión es una medida del
superenrollamiento, donde, cuando el ADN es dextrógiro se le asigna un número neagativo y
cuando es levógiro es positivo. La suma del grado de torsión y de giro es igual al número de
enlace. Si dos ADNs tienen el mismo número de enlace, se podrán interconvertir sin necesidad
de desenrollarse previamente. Gran parte de un cambio en el número de enlace se refleja en
el número de torsiones. Moléculas de ADN con diferentes números de torsión se pueden
separar fácilmente en electroforesis en gel de agarosa.
El ADN (también llamado fragmento G) se une a la topoisomerasa II, cada una de las
hebras se situa cerca de una tirosina.
El complejo enzima-fragmento G se une a otra doble hélice (fragmento T)
Se une el ATP a los sitios de unión de ATP de los monómeros, se da un cambio
conformacional que los acerca, atrapando al fragmento T unido y la división del
fragmento G en dos
El fragmento T pasa a través del fragmento G escindido a una cavidad central
El fragmento G se repara, liberando el fragmento T
Cuando se libera ADP y ortofosfato la enzima está lista para unirse a otro fragmento T
o Resultado: Número de enlace acortado en 2 unidades
1.3.1. La replicación del ADN requiere polimerasas con un elevado nivel de procesividad
Las polimerasas son potentes catalíticamente, fieles y progresivas (cataliza muchas reacciones
consecutivas sin liberar sutrato). La DNA polimerasa de E.coli, en su subunidad beta2 tiene
forma de anillo de 35 amstrongs de diámetro, en el centro de esta se acomoda una molécula
de ADN alejada lo suficiente de la proteína como para permitir el movimiento rápido de la
molécula. La subunidad beta2 actuará como una abrazadera que se desliza sobre el ADN. El
ADN se mantendrá en la abrazadera gracias a dominios del sistema de carga de la abrazadera,
que usan ATP, cuya hidrolisis hará que la abrazadera se cierre sobre el ADN.
Los huecos entre los fragmentos de la hebra retardada se rellenan por una polimerasa I, que
también elimina el ARN cebador gracias a su actividad exonucleasa, esto no se puede dar
usando una polimerasa III, ya que esta no puede hacer recortes en dirección 5-3. Por ultimo, la
DNA ligasa empalma los fragmentos.
La replicación en E.coli empieza en un solo origen de replicación llamado oriC, que contiene
cinco repeticiones de una secuencia que actúan como sitio de unión para una proteína que la
reconoce, además de tener muchas secuencias enriquecidas en bases A-T. Para preparar al
ADN para el inicio de la replicación:
La replicación de ADN se da en el ciclo celular, de manera que no se puede dar la siguiente fase
hasta que se termine, lo que necesita de puntos de control, esto se da gracias a ciclinas, que se
unen a proteínas quinasas dependientes de ciclina, específicamente la quinasa 2 es la que
regulará la replicación.
1.3.5. Los telómeros son estructuras singulares de los extremos de cromosomas lineales
Los extremos del ADN son difíciles de replicar porque las polimerasas actúan solo en dirección
5-3, la hebra retardada tendría un extremo 5 incompleto después de la eliminación de los
cebadores, por lo que la replicación acortaría los cromosomas. Esto se resolvió con el
descubrimiento de los telomeros, que contienen regiones de 6 nucleotidos que se repiten.
Posiblemente en el extremo la región de hebra sencilla forma un bucle hacia otra zona con la
secuencia repetida, esta estructura se estabiliza por proteínas especificas que se unen a los
telomeros, se dice que esto protege el extremo del cromosoma
Las secuencias repetidas se generan por una telomerasa, que contiene un ARN que actúa como
molde para adicionar las repeticiones rigas en G. Se encontró que tiene relación con las
transcriptasas inversas, por lo que es una transcriptasa inversa que lleva su propio molde., esta
se presenta en altos niveles en células de división rápida, por lo que se involucran en el
desarrollo de cáncer y envejecimiento celular. De hecho, esta es una diana potencial para
tratamientos de cáncer.
El ADN se puede dañar, puede ser simple como una sustitución de una base (modificación que
pasarse a la descendencia, o compleja como una modificación química de la molécula de ADN.
La consecuencia puede ser muerte celular o modificación del individuo o incluso se puede
bloquear la replicación. Estos posibles efectos pueden ser evitados por mecanismos de
reparación.
La incorporación de una base incorrecta hace que se forme un par no Watson y Crick, además,
pueden causar cambios permanentes en el ADN. Las hebras con pares de bases no Watson y
Crick, cuando se repliquen, van a formar dobles hélices con diferentes secuencias de bases,
porque la base incorrecta se emparejará con su base correcta para formar un par Watson y
Crick. También se puede dar deleciones, inserciones y ruptura de una o ambas hélices. Una
hebra molde que presenta daños, será bloqueada por las polimerasas, haciendo que la
replicación del genoma se detenga prematuramente.
1.4.2. Las bases se pueden lesionar por agentes oxidantes, alquilantes y la luz.
Mutágenos: Compuestos que alteran bases del DNA después de ser este replicado. Por
ejemplo:
La luz UV forma dímeros entre bases pirimidinas, si se dan enlaces cruzados, entonces la
replicación se verá impedida. La radiación por rayos X rompe el ADN
1.4.3. Las lesiones del ADN pueden detectarse y repararse mediante una gran diversidad
de sistemas
Reconocimiento de errores
Eliminación
Reparación del hueco generado
La subunidad épsilon de la DNA polimerasa III tiene actividad exonucleasa, esta eliminará
nucleótidos mal emparejados cortándolos en sus extremos 3. De esta manera, la DNA
polimerasa, a medida que sintetice nuevos nucleótidos va a ir comprobando que sean los
correctos, si se detecta un error, la replicación se ralentiza, ya que un emparejamiento
incorrecto no va a permitir un encaje rápido por parte de la polimerasa y dará uniones débiles
entre bases. Esta ralentización hará que el error pueda desplazarse al sitio con actividad
exonucleasa, para que se pierda el segmento incorrecto. Si este mecanismo no resulta, se da
una reparación de emparejamientos incorrectos, donde una proteína (MutS) reconocerá un
segmento incorrecto y la otra (MutL) reclutará endonucleasas (MutH) que cortarán el
fragmento. Otro mecanismo es el de reparación directa, donde una DNA fototiolasa, que
mediante la energía lumínica entrará a un estado excitado y romperá dímeros de pirimidina
formados (que como se vio anteriormente pueden ser formados por radiación UV), estas
usarán sus cofactores metiltetrahidrofolato y FAD para unirse al ADN. La enzima AlkA de E.coli
se une a un fragmento de ADN dañado y lo separa gracias a su actividad glicosilasa, esto
formará un fragmento de ADN carente de una base o sitio AP (apurínico si le falta A o G y
apiirimidinico si le falta C o G). Una endonucleasa AP reconocerá este defecto y cortará el
esqueleto de azúcar fosfato al lado de la base eliminada, luego la desoxirribosa fosfodiesterasa
corta la unidad desoxirribosa fosfato por el otro lado. Luego una DNA polimerasa I insertará un
nucleótido complementario a la otra hebra, luego una ligasa recompone la hebra rota.
También existe la reparación por escisión de nucleótidos, utilizada para la escisión de dímeros
de pirimidina., donde un complejo de proteínas formadas por los genes uvr/ABC detecta la
distorsión producida, luego, una enzima uvrABC separa la hebra dañada a una distancia
determinada:
Luego una escinuclasa muy específica corta el segmento de 12 residuos para que luego la DNA
polimerasa recubra el hueco usando como cebador al extremo 3, luego el extremo 3 de la
cadena recién sintetizada se une mediante una ligasa.
Algunas enfermedades se dan por secuencias de ADN que tienden a producir errores. Por
ejemplo:
Enfermedad de Huntington: Un gen mutado que da para una huntingtina, que tiene
nucleótidos de glutamina consecutivos en forma de secuencias CAG, en personas
afectadas esta disposición se encuentra entre 36 y 82 veces, donde el número de
repeticiones aumentan, haciendo que los hijos presenten la enfermedad a edades más
tempranas (“anticipación”). Las repeticiones aparecen por la formación de un bucle
por parte de uno de los fragmentos de ADN, que agregará más de estas secuencias,
que serán replicadas en la hebra complemento ( esto último se ve mejor en este video
https://www.youtube.com/watch?v=M6Z9bkd7zF8 del 1:34 al 2:25).
1.4.6. Muchos cánceres se deben a una reparación defectuosa del ADN
Xeroderma pigmentoso:
o Síntomas:
Hipersensibilidad a luz solar
Piel seca y atrofiada
Queratosis
Parpados agrietados
Úlceras en la córnea
Cáncer de piel en multiples lugares
o Se ha demostrado que los pacientes presentan mutaciones en genes para
proteínas que reparan el ADN por escisión de nucleótidos (homologas a
UvrABC).
Cáncer colorrectal hereditario sin poliposis: Deficiencias en reparación de
emparejamientos incorrectos en ADN, una mayor predisposición a esta enfermedad se
da por mutaciones en genes hMSH2 y hMLH1 que codifican a los equivalentes
humanos de MutS y MutL, que provocan la cumulación de mutaciones, algunas
relacionadas al control de la proliferación celular, por ejemplo, p53, que reconoce
casos de ruptura en las dos hebras, para luego promover la reparación del ADN o
apoptosis. Normlamente mutaciones en el gen para esta proteína no son heredadas,
cuando esto se da se presenta el síndrome de Li-Fraumeni.
Las células cancerígenas son más vulnerables a agentes que lesionan al ADN porque:
Colocar una placa de Agar con 109 bacterias Salmonella (sin enzimas), estas no pueden
crecer en ausencia de histidina, ya que no pueden sintetizarla
Adición del mutágeno
El mutágeno va a incidir sobre muchos genes, en algunos casos afectará un gen que
hará que puedan sintetizar histidina, estos revertientes son más presentes en ausencia
de histidina
Si aparecen muchos revertientes, entonces estamos hablando de un mutágeno (en
ausencia de estos también pueden aparecer, pero en menor medida)
La relación dosis-respuesta sigue una naturaleza lineal, por lo que no hay un umbral de
concentración para la mutagénesis
El efecto de los mutágenos es fácil de conseguir, ya que las cepas usadas carecen de la
barrera de lipopolisacáridos completa.
o En ocasiones incluso se puede ver que tipo de daño de ADN induce
(sustituciones, deleciones, adiciones, etc.)
En ocasiones se requiere añadir un homogenado de hígado, ya que muchos
carcinógenos adquieren esta propiedad después de ser activados por enzimas
hepáticas o de otros tejidos.