Interacción Entre Células Somáticas y Germinales de DM

Trabajo de Fin de Grado en Biología
Interacción entre células somáticas y

germinales en testículo de Drosophila
melanogaster
GEN-17
Juan Antonio Alférez Chueco
Curso 2017-2018 (julio de 2018)

INDICE
Introducción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Objetivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Materiales y métodos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Resultados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Discusión. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
Bibliografía. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
RESUMEN
El trabajo que se presenta ha tenido por objetivo el estudio de la localización de las

regiones donde se producen interacciones físicas (que probablemente conlleven
señalización celular) entre células somáticas (CySC) y germinales (GSC) en la gónada
de Drosophila melanogaster. Para ello hemos trabajado con el “nicho” (microambiente
celular y de señalización) tanto de testículo como de ovario, de la mosca de la fruta.
Hemos tenido que validar el correcto funcionamiento de las líneas
tj:Gal4/UASp:nod:GFP y nos:lexA/lexO:CD4:GFP que hemos utilizado para abordar
dicho estudio.
La metodología llevada a cabo, ha consistido en el uso de la proteína verde fluorescente

GFP (Green Fluorescent Protein) como marcador y de la técnica Split-GFP para
localizar las posibles interacciones celulares. Para todo ello hemos utilizado stocks de
moscas con las “construcciones” específicas de interés y posteriormente hemos
diseñado los cruces en los que la descendencia expresara la proteína GFP, el fragmento
GFP10 o el fragmento GFP11 en una determinada localización.
Hemos conseguido validar la línea nos:lexA/lexO:CD4:GFP que se expresa en línea

germinal de Drosophila, y nos queda pendiente confirmar la expresión del “constructo”
tj:Gal4/UASp:nod:GFP en el mismo.
Palabras clave: Drosophila, GFP, nicho, testículo

Interacción entre células somáticas y germinales en testículo de Drosophila melanogaster
INTRODUCCIÓN
La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un insecto perteneciente al

Orden de los Dípteros (dípteros: dos alas) y es uno de los animales mejor conocidos de
la Naturaleza. Organismo diploide con reproducción sexual, desde hace más de 100
años Drosophila es utilizada como organismo modelo en investigación debido a que su
ciclo de vida es relativamente corto, (en torno a unos 10 días desde la fecundación al
adulto), la progenie de los cruces es muy abundante y además es barato de sustentar en
un laboratorio donde tampoco se requiere mucho espacio para mantener los stocks. La
longevidad de la especie oscila en torno a las 10 semanas.
Se trata de un insecto holoblástico, es decir que la segmentación es completa

(CSIC, s.f.). La fecundación es interna, lo que significa que el macho introduce el
esperma dentro del aparato reproductor de la hembra donde se almacena en unos
receptáculos seminales. Este hecho tiene una especial importancia a la hora de utilizar
Drosophila como organismo modelo, ya que para realizar los distintos cruces es
necesario estar seguros de que la hembra no ha copulado previamente con ningún otro
macho (hembras vírgenes). Debido a que la hembra puede ir liberando progresivamente
el esperma del macho aunque haya pasado mucho tiempo (más de dos semanas) desde
la última cópula (Adams, 2007) es por lo que hay que asegurarse de que la hembra
escogida para el cruce es virgen. Por tanto es crucial asegurarse que en los cruces que se
llevan a cabo, se hacen utilizando hembras vírgenes.
Ciclo de vida
La hembra comienza a ovopositar entre los 4-7 días tras la salida de la pupa, y lo
hace a un ritmo de uno 60 huevos/día. Los huevos miden 0,5 mm, son blancos, ovalados
y macrolecíticos (con mucho vitelo). Externamente, estos huevos están envueltos por el
corion (membrana en forma de saco que se desarrolla a partir de señales procedentes de
células foliculares y que envuelven al embrión) y terminan en 2 filamentos respiratorios
responsables del intercambio de gases (Tyler, 2000)
A 25ºC de temperatura, los huevos fecundados eclosionan a las 24 horas tras la

puesta, entonces el desarrollo de Drosophila pasa por tres estadios larvarios (1º,2º y
tercer estadio larvario) a los que les sigue un estadio de pupa, que sufre una
metamorfosis tras la cual emerge finalmente al organismo adulto (ver figura 1).
1
Figura 1 Ciclo de vida de Drosophila melanogaster (Palermo, 2014)
Tras la eclosión del huevo fecundado surge el primer estadio larvario que se
alimenta del sustrato en la que se depositaron los huevos. A las 25 horas la larva sufre
la primera muda y aparece el segundo estadio larvario, de mayor tamaño y que sigue
siendo una fase trófica. Trascurren 24 horas más hasta que se produce la segunda muda
y, por tanto, la generación del tercer estadio larvario que deja ya de alimentarse,
abandona el sustrato donde se había estado desarrollando y comienza a subir por la
superficie vertical y lisa del tubo. Tras esto se inicia la pupación. Se conforma la pupa,
la cual madura y en su interior se va formando progresivamente por metamorfosis el
adulto, denominado también imago. Durante la metamorfosis se histolizan muchas
estructuras larvarias, aunque se conservan otros órganos como el sistema nervioso, las
gónadas o los túbulos de Malpighi. La mayoría de las estructuras del adulto se forman a
partir de los discos imaginales, paquetes pequeños de células epiteliales que formaran
estructuras epidérmicas del adulto. Durante la metamorfosis se diferencian en las
correspondientes estructuras del imago y de los histoblastos (pequeños grupos de
células dentro de la larva que formaran la epidermis abdominal y los órganos internos
del adulto), estas estructuras se activan durante la metamorfosis. Tras esta metamorfosis
los machos son sexualmente activos unas pocas horas después de haber emergido,
mientras que las hembras no tienen oocitos maduros hasta dos días después de la
eclosión. De esta manera se reinicia el ciclo (Tyler, 2000).
Estructura del aparato reproductor del macho de Drosophila,
Los machos de Drosophila poseen un par de testículos, que son túbulos largos y
ciegos con forma de espiral. Cada uno de estos está cerrado en la parte distal o apical, y
se abren en la parte basal posterior dentro del conducto testicular, para desembocar
finalmente en la vesícula seminal donde madura el esperma. En machos recién
emergidos, esta vesícula mide 0.35µm de largo y 50- 100 µm de diámetro (Cabrera,
1994). El par de vesículas están juntas en una de sus partes y desembocan en un
conducto eyaculatorio anterior que a su vez las comunica con un bulbo eyaculador de
2
aquí se comunica con un conducto eyaculatorio posterior y finalmente con los genitales
externos.
Figura 2 Nicho testicular para la formación de la espermatogonia, se ve cómo se van diferenciando y madurando
las distintas células. Observamos el Hub en verde las células madre germinales en amarillo y las somáticas en azul
(modificado de de Cuevas, 2011).
En la zona más apical del testículo se localiza el “nicho”, microambiente

anatómico y de señalización donde se encuentran las Germ Stem Cells (GSCs) (de
Cuevas, 2011). En este “nicho” testicular se localizan dos tipos (linajes) de células
troncales: unas somáticas (CySC cyst stem cells) y otras que son las células troncales
germinales (GSC). Ambos linajes (CySC y GSCs) se unen a grupo de células llamadas
Hub (unas 10-15 células estromáticas las cuales no se dividen, localizadas en la parte
apical del testículo), formando comno ya se ha mencionado, el “nicho” celular,
localización anatómica donde tiene lugar la diferenciación celular de CySC y GSCs
(Feng, 2017).
En el “nicho” del testículo encontramos las células troncales ancladas

físicamente a las células del Hub, que regulan su división y diferenciación. Adyacente al
Hub encontramos células GSC, cuyo número suele oscilar entre las 6-9 por cada
testículo. Estas GSC mantienen contacto por la zona central y a través de extensiones
citoplasmáticas delgadas con el Hub (de Cuevas, 2011). El Hub y CySCs derivan de un
pool común de células en el embrión.
La diferenciación de las GSCs que salen del nicho y quedan fuera del ambiente
regulador que las mantiene como tales, ocurre como debido a la exposición de las
células a las diferentes señales reguladoras que existen fuera del nicho. La
diferenciación de las células CySC está regulada entre otras por la acción del
“enhancer” (secuencias reguladoras presentes en el ADN que se traban con factores que
incrementan la tasa de trascripción) de Polycomb (un componente de la familia genética
3
Polycomb de Drosophila el cual regula la transición de proliferación a diferenciación)

(Feng, 2018). Esta familia génica está formada por un grupo de genes, que actúan
reprimiendo a los genes homeóticos (son una familia de genes que controla el plan
corporal del embrión en el eje cefálico-caudal), (Stankunas, 1998). Además, el
“enhancer” de Polycomb inhibe la transcripción de genes asociados a múltiples vías de
señalización como JAK-STAT o TGF-β importantes en el mantenimiento de las GSC.
Esta inhibición mantiene la identidad de la línea GSC (Feng, 2017).
Estructura del aparato reproductor de la hembra de Drosophila,
Las gónadas femeninas, se sitúan en la región ventral media del abdomen y

consisten en un par de ovarios ramificados. Cada uno de los dos ovarios que posee la
hembra adulta consta de un racimo de 10 a 20 ovariolas, estructuras en forma de tubo
que se mantienen unidas por una vaina peritoneal. Los ovarios conducen, por sus
respectivos oviductos cortos, a un oviducto común que termina en el útero que a su vez
comunica con la vagina que se abre al exterior a través de la vulva, situada entre los
gonópodos constituyendo un ovipositor contráctil. (Cabrera, 1994).
Figura 3 Representación del ovario de Drosophila donde

podemos ver las estructuras descritas anteriormente
(modificado de Amstrong, 2018)
En el extremo más distal de la ovariola se encuentra el germario, región en la

que al igual que en su contrapartida testicular se localiza el “nicho” que contiene las
Germ Stem Cells (GSC, células troncales germinales) y somáticas (CySC). En el
germario cada división de GSC produce un citoblasto, célula que sufre 4 divisiones
mitóticas incompletas para producir un quiste germinal de 16 células interconectadas
por puentes citoplasmáticos. Una de esas dieciséis células llegará a ser el oocito,
mientras que las otras quince se diferencian a células nodriza del oocito. Cada cúmulo
4
de las GSC se encapsula por células somáticas y posteriormente pasa a ser un oocito
maduro (Peters, 2016).
En el ovario de Drosophila encontramos por término medio 2 GSC que se van

dividiendo cada 8 días formando huevos. Están rodeados por 3 tipos celulares: células
del filamento terminal (Terminal Filament TF) llamadas células TIF, células cap y
células de la estructura germarial interna y células foliculares (Silva, 2015). Las GSC se
pueden identificar por su tamaño y por la presencia de fusomas, estructuras
intracelulares ricas en proteínas del citoesqueleto (Xie, 2000).
Las células troncales son células que se caracterizan por tener la capacidad de
auto-renovarse y al mismo tiempo presentan un elevado potencial de diferenciación
hacia distintos fenotipos celulares. Estas células troncales residen en microambientes
con unas características fisicoquímicas y celulares específicas llamados “nichos”. El
término “nicho” se utilizó por primera vez para explicar cómo las células troncales
hematopoyéticas (Hematopoyetic Stem Cell, HSCs) mantenían su potencialidad de
proliferación y diferenciación gracias a la interacción con otras células del entorno a las
que estaban físicamente ancladas y de las cuales recibían señales reguladoras. En la
actualidad el término se ha expandido a otros factores no celulares tales como
componentes de matriz extracelular, factores de crecimiento, factores físicos como
rigidez y topografía, o concentraciones de oxígeno a los que estas células troncales están
sometidas. Estos componentes inducen el estado quiescente (cuando la célula se
mantiene en fase G del ciclo celular), de renovación celular o de diferenciación celular.
El “nicho” no solo incluye a las células troncales sino a todas las células somáticas que
regulan su estado de diferenciación (Santiago, 2015).
Figura 4 Estructura del germario y células madre: células madre germinales (GSC), diferenciadas (CB),
del filamento terminal (TF), de la cap (CPC), foliculares (FC), células internas de envoltura de germario
(IGS). También vemos los fusomas en amarillo (Xie, 2000).
5
OBJETIVOS
1) Estudio de la interacción entre células somáticas y germinales en el testículo de

Drosophila melanogaster utilizando el sistema Split-GFP
2) Testar el funcionamiento del sistema Gal4/UASp, y la expresión de los

“constructos” tj:Gal4/UASp:nod:GFP y nos:lexA/lexO:CD4:GFP
MATERIALES Y MÉTODOS
Sistema Gal4/UASp
El sistema Gal4/UASp es muy utilizado para dirigir expresión específica de

genes en Drosophila. El sistema se basa en la utilización de dos tipos de transgenes, uno
que controla la expresión (Gal4) y el otro transgen contiene la secuencia UAS
(Upstream Activator Sequence) que a su vez flanquea y dirige la expresión de una
secuencia codificante, a la que se le une el factor de trascripción Gal4. Gal4 es una
proteína de levadura la cual actúa como factor de transcripción al unirse a UAS. La
combinación de Gal4 y UAS permite la expresión específica de genes en un tejido
concreto. La activación de Gal4 puede realizarse a través de promotores endógenos
concretos, con lo que Gal4 se expresará en aquellas células en las que haya factores de
transcripción para ese para el promotor que esté flanqueando a Gal4. Por ejemplo si
tenemos la construcción tj:Gal4, los factores de transcripción Gal4 se expresarán en los
tejidos donde haya factores de trascripción endógenos para para traffic jamm (tj). Los
distintos tipos celulares con los que nos encontramos son CySC y GSCs (ver figura 5)
(Røth, 1998).
6
Figura 5 ejemplo del sistema Gal4:UASp en el que vemos la expresión sucesiva de dos
constructos, en el primero se encuentra el promotor tj asociado a la proteína Gal4 que
actúa como promotor de UASp y se da la expresión dirigida
Proteína GFP
La Green Fluorescen Protein (Green Fluorescent Protein, proteína verde

fluorescente) es una proteína cuyo gen se ha aislado de la medusa Aequorea victoria. La
GFP se utiliza como proteína marcadora de expresión génica. El descubrimiento de la
GFP seguido del descubrimiento de su estructura molecular introdujo un marcador
revolucionario para estudios biológicos. Esta proteína, tiene una baja toxicidad y
permite una fácil obtención de imágenes, en microscopía confocal y microscopía de
epifluorescencia que amplían aún más las opciones de estudios a tiempo real en tejidos
vivos (Kumar, 2016). La GFP tiene un peso molecular de unos 27 kDa y está
compuesta por 238 aminoácidos y tiene un pico de absorbancia a 395 nm (UV) y otro
pico de absorbancia menor a 475 nm (azul). El pico de emisión lo presenta en 508 nm
(verde). GFP es muy resistente a la desnaturalización y es estable en un amplio rango de
pH de <4.0 o> 12.0 (ver figura 6). Una de las características de la GFP es capacidad
para autoensamblarse sin necesidad de energía externa o de la intervención de otras
proteínas. El cromóforo es fluorescente solo cuando está ensamblado dentro de la
molécula de GFP correcta y completamente plegada (Shearin, 2014).
Figura 6 Estructura de la proteína GFP completa, incluye medidas y visión frontal y vista desde arriba (ZEISS
Microscopy Online Campus | Jellyfish Fluorescent Proteins, s.f.)
Además de la GFP completa también vamos a utilizar un método denominado

Split GFP. La Split GFP consiste en la utilización de dos fragmentos de la GFP (GFP10
y GFP11) que por sí solos carecen de actividad fluorescente, pero que cuando
interaccionan restituyen dicha actividad. (Kumar, 2016).
7
Figura 7 Ensamblaje de GFP10 y GFP11, recuperando la fluorescencia (modificado de Shearin, 2014)
Stocks de moscas
Comenzamos con el cultivo de los diferentes stocks de moscas que necesitamos

y lo hacemos en tubos de plástico tapados con un algodón que se mantienen en una
estufa a 28ºC y una papilla (Formula 24-4® Instant Drosophila Medium).Utilizamos en
un principio 4 stocks. Los stocks han sido cedidos del laboratorio del Dr. Acaimo
González Reyes del Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD. CSIC) con el
que mantenemos una colaboración desde hace años.
Pasamos a describir los stocks de moscas que hemos utilizado:
1. En estas moscas encontramos el primer cromosoma en

homocigosis constituido por el marcador white (w) esto nos indica que las
moscas tendrán ojos blancos (Flybase.org, 2018). En el segundo cromosoma
tenemos heterocigosis para Curly (CyO). CyO es un marcador dominante que
está en un cromosoma balanceado, es decir un cromosoma con secuencias
invertidas de manera no puede recombinar con el homólogo (que tiene las
secuencias “wild type”). De esta forma tanto el cromosoma balanceador como el
“wild type” (wt) pasan estables a las siguientes generaciones. El fenotipo CyO
además de otorgar un fenotipo dominante para las alas, que son curvadas (ver
imagen) es recesivo para la letalidad. Eso quiere decir que no es viable en
homocigosis (no existen por tanto moscas adultas CyO/CyO). El cromosoma
homólogo contiene una “construcción” que es UASp (promotor al que se unen
los factores de transcripción Gal4) flanqueando a la secuencia nod (una proteín
quinasa que juega un papel fundamental en la separación de cromosomas
aquiasmáticos durante la meiosis masculina) (Cui, 2005) y a la secuencia de la
GFP. La proteína nod ejerce su efecto a nivel del citosol, no se ancla a ninguna
membrana.
8
2. En este stock el primer cromosoma contiene en

heterocigosis w y de yw (cuya expresión se corresponde con una menor
pigmentación del cuerpo) (Flybase.org, 2018). En el segundo cromosoma se
presenta en heterocigosis el balanceador CyO y otra parte del “constructo” esta
vez formado por el promotor de tj para el que hay factores de transcripción
endógenos en células somáticas y Gal4, que forma parte del sistema Gal4:UAS
explicado antes (Flybase.org, 2018). Por último en el tercer cromosoma y en
heterocigosis encontramos TM6B, un cromosoma balanceador con un marcador
que al igual que CyO es dominante en heterocigosis mostrando pupas “tubby”
(tb) (el fenotipo tb se manifiesta con unas larvas y pupas desproporcionadamente
bajas y “rechonchas” en comparación con el fenotipo wt) (ver figura 8) y
recesivo para letalidad (Lattao, 2011). En el adulto este fenotipo se expresa
como humeral (hu) el cual se manifiesta con un incremento en el número de
quetas inferiores al húmero (Dura, 1985). Por otro lado el stock consta de Tub
Gal80 un marcador que bloquea la actividad de GAL4 uniéndose a su dominio
de activación transcripcional (Suster, 2004). Está regulado por la temperatura, de
manera que a temperaturas mayores de 29 ºC se reprime su expresión (Head,
2015)
3. En esta línea se localiza en el primer cromosoma en homocigosis
w y en el segundo cromosoma también en homocigosis el “constructo”
nos:lexA, nos actúa como promotor de LexA, un gen procedente de Escherichia
coli (Flybase.org, 2018). LexA funciona de manera semejante a como lo hace
Gal4 en el sistema Gal4:UAS, codificando para un factor de transcripción que
reconoce y se une a la secuencia lexO (Kockel, 2016)
4. En el primer cromosoma se encuentra en
homocigosis la secuencia ywlexO:mCD8:GFP. LexO es el promotor que al
flanquear a la construcción CD8:GFP, regulará (vía unión con el factor lexA) la
transcripción y posterior traducción de la proteína de fusión mCD8:GFP
(Flybase.org, 2018).
5. Esta línea expresa constitutivmente GFP en aquellas zonas en las
que se encuentren los factores de transcripción para troll. Troll es una proteína
que se expresa como parte del la matriz extracelular (Grigorian, 2013).
6. Este stock presenta en el primer cormosoma
en homocigosis w, en el segundo en heterocigosis el balanceador CyO junto con
el balanceador speck (Sp), el cual fenotípicamente se ve reflejado como moscas
más oscuras y con ojos blancos. Por último en el tercer cromosoma encontramos
en heterocigosis TM6B y el “constructo” UAS:CD4:GFP10;LexO:CD$:GFP11
9
en el que se hallan los fragmentos de la proteína GFP 10 y GFP11 asociados a la

proteína de membrana CD4.
La finalidad de los cruces realizados ha sido testar la expresión de esos

“constructos”en el testículo del macho de Drosphila. Los cruces que hemos llevado a
cabo han sido los siguientes:
1. ♂ X♀ → expresión en la línea CySC.
2. ♂ X♀ → expresión en la línea GSC.
En primer lugar comenzamos con la selección de hembras vírgenes (se necesitan

hembras vírgenes porque las moscas tienen una bolsa espermática y con solo una cópula
pueden guardar el esperma del macho para mucho tiempo, por lo que de no ser vírgenes
no podríamos estar seguros del fenotipo de la F1) de y de
, para esto “crecemos” moscas hembras y machos en

matraces de plástico con papilla tapados con un algodón (aumenta el nº de individuos
por estar el tubo tapado con un algodón). Una vez que han emergido las pupas
eliminamos las moscas del matraz, con lo que se pueden seleccionar las pupas maduras
y diferenciar entre machos y hembras, para esto nos fijamos en los peines sexuales del
primer par de patas (ver figura 9) y separamos las pupas hembra en un tubo aparte con
papilla, eliminando del tubo los machos. Por otro lado si las moscas ya han emergido de
las pupas dentro del matraz., podemos seleccionar hembras diferenciándolas de los
machos porque las hembras carecen del peine sexual que es una estructura morfológica
específica del macho. Una vez seleccionadas las hembras, nos aseguramos de que son
vírgenes utilizando la presencia de meconio como característica diferenciadora. El
meconio son las primeras heces excretadas por el adulto y se observan como una
mancha negra en el interior del abdomen. Si la hembra presenta meconio es virgen. Para
seleccionar hembras vírgenes es necesario anestesiarlas usando CO2.
Posteriormente seleccionamos machos (no importa que sean vírgenes) de genotipo

y machos de genotipo . Una vez seleccionados los
machos de interés, se cruzan con hembras vírgenes previamente seleccionadas,
manteniendo una proporción entre hembras y machos de 4:1 y realizamos 2 réplicas de
cada cruce. Los cruces que realizamos son ♂ X ♀
y♂ X♀
La descendencia del cruce de moscas con

moscas expresarán GFP en la línea germinal. Vamos a
10
seleccionar a toda la descendencia, cuyo genotipo sería
sin distinción ya que todos van portar el

“constructo” nos:lexA-nos:lexO:GFP. Como control negativo utilizaremos un parental,
ya que ningún parental tiene los genes necesarios para la expresión de la proteína GFP
por lo que no se expresaría la proteína GFP y no se detectaría fluorescencia. En este
control negativo al faltar el factor de transcripción lexA que se una al promotor lexO, la
expresión de la proteína GFP no tendrá lugar. Hemos utilizado el parental con genotipo
, como control negativo ya que como se ha dicho ante la
ausencia de la construcción nos:lexA, no se expresará la proteína GFP. En el caso de
que en esta línea viésemos fluorescencia, nos indicaría que ésta es inespecífica (no
debida a la GFP) y nos invalidaría el resultado que supondría la fluorescencia observada
en los individuos experimentales, al no poder estar seguros si la fluorescencia que
observáramos en estos sería por la GFP o sería fluorescencia endógena debida a los
propios tejidos. Sin embargo en el caso de la línea somática solo nos interesan aquellas
moscas que sean de genotipo . Para obtener individuos con este
genotipo, seleccionamos según el fenotipo de la descendencia, por lo que es necesario
escoger aquellas pupas que sean Tb y una vez que eclosionen, seleccionamos aquellas
que no tengan fenotipo en el ala CyO. Las que tengan alas CyO las utilizaremos como
control negativo, por el mismo motivo que antes, al no poseer estas no tienen el
“constructo” completo y por tanto no poder mostrar actividad GFP.
Figura 8 Podemos observar dos pupas cada una con un fenotipo, la de la izquierda es Tb, mientras que la de la
derecha es Wt, en estos caracteres nos fijamos a la hora de seleccionar fenotipo. Se ve claramente que la pupa Tb
es significativamente más corta y ancha que la de fenotipo Wt.
11
Antes de realizar la IF comenzamos con la disección de las moscas. Sumergimos

a las moscas previamente anestesiadas mediante CO2 en PBT y con las pinzas abrimos
el abdomen a 1/3 del tórax, extraemos testículos u ovarios y los introducimos en tubos
eppendorf de 500µl con PBT y que están en hielo picado. A continuación estas gónadas
pasamos a realizar una inmunofluorescencia (IF) (la IF es una técnica que consiste en el
uso de anticuerpos marcados con fluorescencia capaces de detectar antígenos diana
específicos) para comprobar que los “constructos” expresan la GFP, de tal modo que si
la proteína se expresa veremos fluorescencia. Así se amplifica la señal luminosa de la
GFP (Odel, 2013).
Tras la disección es necesario fijar los testículos/ovarios, para esto aspiramos el

PBT y añadimos 400µl de fijador (PBT-PFA 4%) e incubamos 20’en rotación. Después
aspiramos el fijador y lavamos con PBT, 3 veces durante 10 minutos cada vez, en
rotación. Tras el fijado se incuban las gónadas con solución de bloqueo (PBT 10 +BSA)
y se mantienen 1 hora en rotación. Las proteínas presentes en la solución de bloqueo se
unen inespecíficamente con otras proteínas presentes en las células con lo que se copan
muchos dominios de esas proteínas que de otro modo estarían accesibles. Por tanto, esta
reacción de “bloqueo” evita reacciones cruzadas de los anticuerpos con epitopos de
otras proteínas no relacionadas, y que darían lugar a muchas señales inespecíficas en el
caso de que no la lleváramos a cabo (Abyntek Biopharma, 2018).
Posteriormente pasamos a incubar con anticuerpos primarios específicos frente a

la GFP. Se aspira la solución de bloqueo (PBT10) y se añade una solución de los
anticuerpos primarios en PBT1. Las gónadas se mantienen toda la noche en esta
solución de anticuerpos primarios. Los anticuerpos primarios utilizados son anti-GFP
(reconoce un epítopo de la GFP y se ha obtenido en conejo) y anticuerpo primario anti-
HTS (que se ha obtenido en ratón). El anti-HTS es un anticuerpo primario específico
que reconoce un epítopo de una proteína del espectrosoma, orgánulo exclusivo de las
células germinales y que se utiliza como “marcador” de éstas. Una vez se han incubado
las gónadas toda la noche, se aspira esta solución de anticuerpos primarios, se “lavan”
las gónadas con PBT (3x10min) en rotación y a continuación se incuban con los
anticuerpos secundarios. Coherentes con la “fuente” de donde se han obtenido los
anticuerpos primario, como anticuerpos secundarios utilizamos anticuerpo anti-rabbit
(que se une específicamente al anticuerpo primario anti-GFP) y anticuerpo anti-mouse
(que es inmunoreactivo frente al anticuerpo primario anti-HTS) esta unión del
anticuerpo secundario al anticuerpo primario amplifica extraordinariamente la señal.
Se incuba de 2-4 horas (también en rotación) en 400µl de una solución de

anticuerpos secundarios en PBT. Por último, se aspira esta solución de anticuerpos
secundarios y se añade Hoechstt, un colorante fluorescente que se une al ADN (Hawley,
12
2004) y que nos permite localizar los núcleos de las células. A continuación se “lavan”
las gónadas con PBT (3x10min) y finalmente se aspira todo el PBT posible y se añade
una gota de Vectashield protege y mantiene la fluorescencia de las muestras, dejamos
unos minutos agitando y se conserva el tubo a -20 ºC.
Figura 9 El fenotipo de la derecha corresponde con una mosca CyO con alas curvadas (flecha negra), b) mosca con
fenotipo wt para las alas (flecha blanca).
Este protocolo lo realizamos para los dos cruces, utilizando un control positivo
(troll:GFP) que nos valida tanto si los anticuerpos son funcionales o no como que la
técnica ha sido realizada correctamente. Este control positivo asegura que no tenemos
falsos positivos ni negativos. Para esto se usará en las dos IF tanto un control positivo
como un control negativo (dependiendo de la línea se usará un control negativo distinto
en la línea celular CySC usaremos como control negativo mientras que
para la línea GSC usaremos como control negativo) y las

moscas de interés tanto testículos como ovarios (en el caso de GSC disponemos de
mientras que para las CySC nos interesan
aquellas moscas con fenotipo ).
13
Figura 10 Comparación entre macho y hembra, el espécimen de la derecha es un macho, se observa la placa genital
típica de machos y un peine copulador (marcados por flechas), mientras que el de la izquierda nos vemos la placa
genital típica de machos ni peines copuladores.
Una vez realizada la IF se “montan” las preparaciones. Esto es distinto si

realizamos una preparación de testículos o de ovarios, la de ovarios tiene un
acondicionamiento previo, hay que separar las ovariolas del ovario y a estas hay que
eliminarle la capa de músculo que las recubre, mientras que los testículos no necesitan
un tratamiento previo por lo que pasaríamos directamente a montar la preparación.
Colocamos una gota de Vectashield al final de un portaobjetos, y pasamos los testículos
o las ovariolas desde la suspensicón de Vectashield del eppendorf hasta la gota de
Vectashield. Una vez colocados en el Vectashield, colocamos un cubreobjetos y lo
sellamos.
Split-GFP
Una vez realizados estos cruces para comprobar el funcionamiento de los

distintos “constructos” dentro de las líneas pasamos a diseñar y realizar el cruce
experimental, en el cual intentamos obtener individuos en los que en células germinales
expresen el fragmento GFP 11 y en células somáticas expresen el fragmento GFP 1-10
de la GFP.
Para ello es necesario que los individuos posean un transgen con un promotor
específico de células germinales (nos:lexA) y por otro lado un transgen en el que lexO
está flanqueado una secuencia para proteína de fusión CD4:GFP11. Al mismo tiempo
esos individuos deberán poseer otro transgen con un promotor específico de células
somáticas (tj:Gal4) y una secuencia para una proteína de fusión CD4:GFP10 bajo el
control del promotor UAS. De esta manera, presumiblemente en las zonas donde células
germinales y somáticas establecen contacto se restaurará la actividad fluorescente.
Figura 11 Esquema en el que representamos como la combinación de los dos constructos y el

contacto entre el fragmento GFP10 y GFP11 restauran la actividad fluorescente de la proteína GFP
14
Con esos cuatro “constructos” que necesitamos buscamos en la base de datos de

FlyBase algunos stocks con los que sus cruces diesen lugar a una descendencia con el
fenotipo de interés. Encontramos stock que tenía la Split-GFP completa (GFP10 y
GFP11) en el tercer cromosoma, por lo que nos decantamos por esa cepa para realizar el
cruce. El stock en cuestión es: Tenemos que
realizar dos cruces secuenciales. Un primer cruce con moscas hembras vírgenes
y machos . De este cruce tenemos
que seleccionar por su fenotipo aquellos machos que sean
, es decir aquellas moscas que sean CyO pero no
Tb. Posteriormente estas moscas las cruzamos con hembras vírgenes de
y volvemos a seleccionar el fenotipo que nos interesa, es decir,
aquellas moscas que no sean CyO pero que si presenten tb, por lo que tendrían un
genotipo de .
Una vez realizamos el cruce y tenemos la línea realizamos una IF, igual a como
se ha descrito anteriormente. En este caso como control positivo utilizaremos de nuevo
la cepa troll:GFP y como control negativo usaremos machos del cruce realizado los
cuales presenten el fenotipo conjunto de CyO y tb, los cuales corresponden con un
genotipo en el cual no expresaría el transgen
completo.
RESULTADOS
Con las líneas
hemos realizado los cruces para testar el funcionamiento
de las líneas ♂ X ♀ y ♂ X ♀
y constatamos que UASp:nod:GFP y lexO_mCD8:GFP se

expresan en células somáticas y germinales respectivamente en testículo de Drosophila.
Por otro lado realizamos los cruces necesarios para obtener una línea con
genotipo como ya se ha descrito anteriormente
sin embargo no hemos apreciado fluorescencia en las distintas micrografías realizadas.
Por lo que no hemos podido detectar interacción celular.
15
Resultados de :
Testículo
Hoechst A Anti-GFP Ab B Anti-HTS Ab C

Figura 12 en estas tres micrografía podemos ver como en la imagen A, se observa la tinción con Hoechst, vemos los núcleos marcados en
azul, señalados por una flecha negra. En la micrografía B encontramos la tinción con anticuerpo anti-GFP, no se observa fluorescencia, lo
que marca la fecha verde son posibles solapamientos de longitudes de onda. Por último vemos la micrografía C vemos la tinción
anticuerpo anti_HTS, podemos observar cómo se tiñen de rojo los espectrosomas, señalados por la flecha amarilla.
anti-GFP Ab
Figura 13 aquí podemos observar como se ve fluorescencia específica en la

células señaladas por la flecha blanca.
troll:GFP, control positivo
Hoechst Anti-GFP Ab Anti-HTS Ab
A B C
Figura 14 Estas micrografías corresponden al control positivo, en ellas podemos ver como se expresa la GFP, por lo que la
inmunofluorescencia ha salido correctamente
16
troll:GFP
anti-GFP Ab
Figura 15 En esta micrografía se aprecia fluorescencia en la capa de músculo que rodea al testículo.
Ovariola
Anti-GFP ab Anti-HTS Ab Hoechst
A B C
Figura 16 La flecha verde señala solapamientos entre las distintas longitudes de onda que hemos usado, ya que entre el verde y el
rojo se pude dar solapamiento. Por otro lado la flecha gris nos muestra zonas en las que se puede ver fluorescencia, pero nada
específico, seguramente se trate de autofluerescencia del órgano.
Ovariola
anti-GFP Ab
Figura 17 En esta micrografía vemos una tinción de ovariola, en la que no se aprecia fluorescencia.
17
Resultados de
Testículo de
Hoechst Anti-GFP ab Anti-HTS Ab
A B C
Figura 18 En la micrografía A observamos de nuevo una tinción con Hoechstt que marca los núcleos en azul (flecha negra). La micrografía
B corresponde con la tinción con anticuerpo anti-GFP en la cual observamos fluorescencia. Por último la micrografía C está teñida con
anticuerpo anti-HTS la cual marca los espectrosomas.
anti-GFP Ab
Figura 19 Se puede observar expresión de la proteína GFP en la capa

adventicia que rodia al testículo (flecha blanca) y también los espectrosomas
(flecha verde)
troll:GFP, control positivo de
A B C
18
C
Figura 20 En la micrografía A observamos los núcleos celulares teñido por Hoechst. La micrografía B
corresponde con la tinción mediante anticuerpo anti-GFP. En la micrografía C podemos ver los espectrosomas
marcados por anticuerpo anti-HTS.
troll:GFP
anti-GFP Ab
Figura 21 En esta micrografía observamos la expresión de GFP en las células de la capa externa del músculo que
rodea al testículo. En este caso no vemos los espectrosomas porque la señal parece muy baja.
Ovariolas de
A B C
Figura 22 Micrografía A observamos la tinción de Hoechst donde se marcan os núcleos en azul. La micrografía B corresponde con el
Anticuerpo anti-GFP. Por último en la micrografía C se marcan los espectrosomas con anticuerpo anti-HTS .
Ovariola de
anti-GFP Ab
Ab
Figura 23 En esta micrografía podemos observar que vuelve a haber expresión de GFP
en las células que rodean a la ovariola (flecha blanca).
19
Control negativo:
A B C
Figura 24 A. Micrografía del control negativo. Encontramos la tinción con Hoechst. Localizamos los núcleos en azul. La micrografía
B corresponde con la tinción mediante anti-GFP. Por último la microgrfía C se tiñe con anti HTS que marca los espectrosomas
Anti-GFP Ab
Figura 25 Control negativo en el cual no se ve expresión de GFP como era de esperar
Resultados de
Testículos
A B C
Anti-GFP Ab Anti-HTS Ab
Hoechst
20
Figura 26 Comparación de las micrografías tomadas de podemos ver de nuevo en la micrografía A

los núcleos marcados en azul, en la B se tiñe con anti GFP y por último la micrografía C marcando los espectrosomas
Anti-GFP Ab
Figura 27 Micrografía en la que no se detecta expresión de GFP aunque si podemos observar autofluorescencia
del testículo.
Ovariola
A B C
Figura 28 Tres micrografías de una ovariola de Drosophila comparadas a distinta longitud de onda en al que se observan los
A y la posible expresión de GFP
núclelos celulares, los espectrosomas B C
Anti-GFP Ab
Ovariola
Figura 29 En esta micrografía no se aprecia expresión específica de GFP.
21
Control positivo Troll:GFP
A B C
Figura 30 Comparación de la muestra control bajo los 3 distintos filtros de luz a los que sometemos al testículo donde
diferenciamos núcleos, espectrosomas y la posible expresión de GFP
B
troll:GFP
Anti-GFP Ab
Figura 31 En esta micrografía no se observa expresión de GFP.
Control negativo:
A B C
Ilustración 32 comparación de las 3 micrografías a distintas longitudes de onda en las que observamos núcleos, espectrosomas y la
posible expresión de la GFP.
22
Anti-GF AbP
Ilustración 33 Micrografía en la que no se observa la expresión de GFP
DISCUSIÓN
En el caso de la línea podemos decir que

se da expresión de GFP en células germinales tal y como se esperaba. En la micrografía
correspondiente a la línea (Figura 16) vemos

señal específica de GFP. Sin embargo en las micrografías tomadas posteriormente no se
observa señal específica en las células del “nicho” (Figura 15) de la misma forma que
no se aprecia señal específica de GFP en las ovariolas. Una explicación puede ser que al
no haber eliminado completamente la capa del músculo que rodea a la ovariola el
anticuerpo no haya podido penetrar lo suficiente como para que la señal sea detectable.
Será necesario repetir el experimento asegurándonos esta vez de que efectivamente no
queda capa de músculo rodeando a la ovariola. Según Pfeiffer y colaboradores (Pfeiffer,
2010) la eficacia de expresión del sistema lexA/lexO es menor que la del sistema
Gal4/UAS por lo que este puede ser un factor añadido a la hora de explicar la no
detección de señal fluorescente específica GFP en ovariolas.
La línea en el caso de los testículos se aprecia expresión en las

células del músculo liso que rodea al testículo (Figuras 17 y 18). Sin embargo no se
observa la señal de las células somáticas del nicho del testículo (Figura 18). En el caso
de que la señal que se observa fuera específica esto significaría que en esa túnica
muscular hay factores de transcripción endógenos para tj. Sin embargo ya que está
descrito (Michel, 2012) que tanto las células somáticas del testículo como las del ovario
23
expresan tj, entonces o bien la técnica nos ha fallado o bien el ab o ambos dos. Ya que
se obtiene una señal clara y específica para las proteínas del espectrosoma (anti-HTS
Ab) es razonable pensar que el protocolo se ha realizado correctamente, por lo que la
causa de la ausencia de señal para la GFP debe estar en los anticuerpos y/o el stock de
moscas. Estamos repitiendo y “chekeando” tanto los anticuerpos primarios y
secundarios como el propio stock ( ).
Por otro lado, en la ovariola se observa más nítidamente la expresión de la GFP

(Figuras 21 y 22). Es posible que no se observe la expresión de GFP en células del
nicho debido a que la señal sea tan baja que resulte indetectable. Hemos usado un
microscopio de fluorescencia, que no permite ver las muestras en 3D, sin embargo si
hubiéramos utilizado un microscopio confocal podría haberse observado el tejido de una
manera más precisa para ver las distintas señales con mayor especificidad (García
2012). También es posible que no se observe señal específica fluorescente en el
testículo debido a que el anticuerpo no haya podido penetrar en el interior del mismo
siendo por tanto imposible de reconocer a su epítopo e impidiendo la fluorescencia.
Por último en el caso de la línea no

hemos obtenido señal fluorescente, por lo que presumiblemente no se ha restaurado la
actividad fluorescente de la GFP. Esto podría deberse a varias causas:
1) No interactúan los dos fragmentos de la GFP porque las zonas entre ambas
células, (somáticas y germinales) no están lo suficientemente cercanas como
para que los dos fragmentos lleguen a contactar. Ya que no contactan no es
posible que se restaure la actividad fluorescente de la GFP.
2) Se expresa un transgen (“constructo”) pero no el otro por lo que tampoco es
posible que se restaure la actividad fluorescente.
3) Como se ha dicho anteriormente puede que por la menor eficiencia del propio
sistema lexA:lexO a la hora de expresarse (Pfeiffer, 2010), el nivel de resolución
de dicho sistema no sea suficiente para detectar señal.
4) No descartamos la posibilidad de que el propio protocolo (fundamentalmente la
fijación con PFA) haya impedido la interacción entre los fragmentos GFP 10 y
GFP 11. Pensamos que la observación “in vivo” por microscopía confocal de la
gónada nos podría permitir visualizar los “puntos de contacto” entre las células
somáticas y germinales.
24
CONCLUSIONES
Hemos validado la línea nos:lexA:lexO:CD4:GFP ya que como cabría esperar al ser
“nos” un promotor específico de línea germinal hemos observado señal verde
fluorescente en las GSCs del testículo de Drosophila.
Nos queda pendiente asegurarnos de que la señal que observamos en la capa

muscular que envuelve al testículo cuando utilizamos el sistema tj:Gal4 UAS:GFP es
específica. Si fuera así, tendríamos que obtener también señal en las células somáticas
de la gónada de macho.
Al no detectar señal en tejidos de gónadas fijadas abordaremos el estudio de

gónadas “in vivo” utilizando microscopía confocal.
BIBLIOGRAFÍA
- Abyntek Biopharma. (2018). Tips para elegir el buffer de bloqueo - Abyntek Biopharma.
[online] Aviable at: http://www.avyntek.com/tips-para-elegir-el-buffer-de-blooqueo/ [Accessed
29 Jun 2018].
- Adams, E. M., & Wolfner, M. F. (2007). Seminal proteins but not sperm induce morphological
changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal
of Insect Physiology, 53(4), 319–331. https://doi.org/10.1016/j.jinsphys.2006.12.003
- Armstrong, A. R., & Drummond-Barbosa, D. (2018). Insulin signaling acts in adult adipocytes
via GSK-3β and independently of FOXO to control Drosophila female germline stem cell
numbers. Developmental Biology, 440(1), 31–39. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2018.04.028
- Cabrera, A. A.(1994) Efectos del arsénico sobre los mecanismos de no-disyunción y

pérdida del cromosoma X en Drosophila melanogaster.
- Cui W. & al. (2005). Drosophila Nod Protein Binds Preferentially to the Plus Ends of
Microtubules and Promotes Microtubule Polymerization In Vitro. Molecular Biology of the Cell
Vol. 16, 5400–5409.
- de Cuevas, M., & Matunis, E. L. (2011). The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.
Development, 138(14), 2861–2869. https://doi.org/10.1242/dev.056242
- Dura, J. M., Brock, H. W., & Santamaria, P. (1985). Polyhomeotic: A gene of Drosophila
melanogaster required for correct expression of segmental identity. MGG Molecular & General
Genetics, 198(2), 213–220. https://doi.org/10.1007/BF00382998
- Feng, L., Shi, Z., & Chen, X. (2017). Enhancer of polycomb coordinates multiple signaling
pathways to promote both cyst and germline stem cell differentiation in the Drosophila adult
testis. PLoS Genetics (Vol. 13). https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006571
- Feng, L., Shi, Z., Xie, J., Ma, B., & Chen, X. (2018). Enhancer of polycomb maintains germline
activity and genome integrity in Drosophila testis. Cell Death and Differentiation, 1–17.
https://doi.org/10.1038/s41418-017-0056-5
- García, M. G., (2012). Uso de la fluorescencia y la microscopía confocal en la. Sebbm

Divulgacion. https://doi.org/10.18567/sebbmdiv_RPC.2012.07.1
25
- Grigorian, M., Liu, T., Banerjee, U., & Hartenstein, V. (2013). The proteoglycan Trol controls
the architecture of the extracellular matrix and balances proliferation and differentiation of blood
progenitors in the Drosophila lymph gland. Developmental Biology, 384(2), 301–312.
https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2013.03.007
- Hawley, Robert C.; Teresa S. Hawley (2004). Flow Cytometry Protocols (Methods in
Molecular Biology (Clifton, N.J.), V. 263.). Totowa, NJ: Humana Press
- Head, L. M., Tang, X., Hayley, S. E., Goda, T., Umezaki, Y., Chang, E. C. & Hamada, F. N.
(2015). The influence of light on temperature preference in Drosophila. Current Biology, 25(8),
1063–1068. https://doi.org/10.1016/j.cub.2015.02.038
- Kockel, L., Huq, L. M., Ayyar, A., Herold, E., MacAlpine, E., Logan, M., & Kim, S. K. (2016).
A Drosophila LexA Enhancer-Trap Resource for Developmental Biology and Neuroendocrine
Research. Genes|Genomes|Genetics, 6(October), 3017–3026.
https://doi.org/10.1534/g3.116.031229
- Kumar, A., et Pal, D. (2016) Green fluorescent protein and their applications in advance
research. Neuron 19, p. 735-41.
- Lattao, R., Bonaccorsi, S., Guan, X., Wasserman, S. A., & Gatti, M. (2011). Tubby-tagged
balancers for the drosophila X and second chromosomes. Fly, 5(4), 369–370.
https://doi.org/10.4161/fly.5.4.17283
- Michel, M., Kupinski, A. P., Raabe, I., & Bokel, C. (2012). Hh signalling is essential for somatic
stem cell maintenance in the Drosophila testis niche. Development, 139(15), 2663–2669.
https://doi.org/10.1242/dev.075242
- Odel I. & Cook D. (2013). Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative

Dermatology 133, e4. doi:10.1038/jid.2012.455
- Palermo, Ana María, & Mudry, Marta Dolores. (2014). Etanol e isopropanol:
genotoxicidad y teratogénesis evaluada aplicando el modelo de Drosophila melanogaster. Acta
toxicológica argentina, 22(3), 122-135. Recuperado en 14 de junio de 2018, de
http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1851-
37432014000300003&lng=es&tlng=es.
- Peters, N. C., & Berg, C. A. (2016). In vitro culturing and live imaging of Drosophila egg
chambers: A history and adaptable method. Methods Mol Biol Methods Mol Biol, ,1457, 1–30.
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3795-0
- Pfeiffer, B. D., Ngo, T. T. B., Hibbard, K. L., Murphy, C., Jenett, A., Truman, J. W., & Rubin,
G. M. (2010). Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics, 186(2),
735–755. https://doi.org/10.1534/genetics.110.119917
- Røth P. (1998). Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development 78 (1998)
113–118.
- Santiago, C. R., & Tamariz, E. (2015). Células Troncales, Nicho y Biomateriales.
- Shearin, H. K., MacDonald, I. S., Spector, L. P., & Steven Stowers, R. (2014). Hexameric GFP
and mCherry reporters for the Drosophila GAL4, Q, and LexA transcription systems. Genetics,
196(4), 951–960. https://doi.org/10.1534/genetics.113.161141
- Silva, D., & Jemc, J. C. (2015). Sorting out identities: An educational primer for use with “Novel
tools for genetic manipulation of follicle stem cells in the drosophila ovary reveal an integrin-
dependent transition from quiescence to proliferation.” Genetics, 201(1), 13–22.
https://doi.org/10.1534/genetics.115.179911
26
- Stankunas, K., Berger, J., Ruse, C., Sinclair, D. a, Randazzo, F., & Brock, H. W. (1998). The
enhancer of polycomb gene of Drosophila encodes a chromatin protein conserved in yeast and
mammals. Development (Cambridge, England), 125(20), 4055–4066.
- Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., & Sokolowski, M. B. (2004). Refining GAL4-Driven
Transgene Expression in Drosophila With a GAL80 Enhancer-Trap, 245, 240–245.
https://doi.org/10.1002/gene.20051
- Tyler, M. S. (2000). Developmental Biology, A Guide for Experimental Study. Developmental

Biology, A Guide for Experimental Study, 85–106. https://doi.org/10.1002/ajmg.1320590229
- Xie, T., & Spradling, A. (2000). A Niche Maintaining Germ Line Stem Cells in the Drosophila
Ovary. Science (New York, N.Y.), 290(5490), 328–330. https://doi.org/DOI
10.1126/science.290.5490.328
- CSIC. (s.f.). Seresmodelicos.csic.es. [online] Available at

http://www.seresmodelicos.csic.es/mosca.htm [Accessed 4 mar. 2018]
- Flybase.org. (2018). FlyBase Allele Report: Scer\GAL4[twi.PG]. [online] Available at:

http://flybase.org/reports/FBal0040491.html [Accessed 30 Jun. 2018].
- Flybase.org. (2018). FlyBase Gene Report: Dmel\nos. [online] Available at:

http://flybase.org/reports/FBgn0002962.html [Accessed 9 Jun. 2018].
- Flybase.org. (2018). FlyBase Gene Report: Dmel\Nos. [online] Available at:

- Flybase.org. (2018). FlyBase Gene Report: Dmel\tj. [online] Available at:

- Flybase.org. (2018). FlyBase Gene Report: Dmel\w. [online] Available at:

- Flybase.org. (2018). FlyBase Gene Report: Ecol\lexA. [online] Available at:

- Flybase.org. (2018). FlyBase Gene Report: Ecol\lexAop. [online] Available at:

- Flybase.org. (2018). FlyBase Recombinant Construct Report: P{tubP-GAL80[ts]}. [online]

Available at: http://flybase.org/reports/FBtp0017264.html [Accessed 30 Jun. 2018].
- ZEISS Microscopy Online Campus | Jellyfish Fluorescent Proteins. (s.f.). Zeiss-

campus.magnet.fsu.edu. [online] Available at: http://zeiss-
campus.magnet.fsu.edu/articles/probes/jellyfishfps.html [Accessed 20 mar. 2018].
27

Interacción Entre Células Somáticas y Germinales de DM

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Interacción Entre Células Somáticas y Germinales de DM

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Trabajo de Fin de Grado en Biología

Interacción entre células somáticas y

Juan Antonio Alférez Chueco

Curso 2017-2018 (julio de 2018)

El trabajo que se presenta ha tenido por objetivo el estudio de la localización de las

La metodología llevada a cabo, ha consistido en el uso de la proteína verde fluorescente

Hemos conseguido validar la línea nos:lexA/lexO:CD4:GFP que se expresa en línea

Palabras clave: Drosophila, GFP, nicho, testículo

La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un insecto perteneciente al

Se trata de un insecto holoblástico, es decir que la segmentación es completa

A 25ºC de temperatura, los huevos fecundados eclosionan a las 24 horas tras la

Figura 1 Ciclo de vida de Drosophila melanogaster (Palermo, 2014)

Estructura del aparato reproductor del macho de Drosophila,

En la zona más apical del testículo se localiza el “nicho”, microambiente

En el “nicho” del testículo encontramos las células troncales ancladas

Polycomb de Drosophila el cual regula la transición de proliferación a diferenciación)

Estructura del aparato reproductor de la hembra de Drosophila,

Las gónadas femeninas, se sitúan en la región ventral media del abdomen y

Figura 3 Representación del ovario de Drosophila donde

En el extremo más distal de la ovariola se encuentra el germario, región en la

En el ovario de Drosophila encontramos por término medio 2 GSC que se van

1) Estudio de la interacción entre células somáticas y germinales en el testículo de

2) Testar el funcionamiento del sistema Gal4/UASp, y la expresión de los

El sistema Gal4/UASp es muy utilizado para dirigir expresión específica de

La Green Fluorescen Protein (Green Fluorescent Protein, proteína verde

Además de la GFP completa también vamos a utilizar un método denominado

Figura 7 Ensamblaje de GFP10 y GFP11, recuperando la fluorescencia (modificado de Shearin, 2014)

Comenzamos con el cultivo de los diferentes stocks de moscas que necesitamos

Pasamos a describir los stocks de moscas que hemos utilizado:

1. En estas moscas encontramos el primer cromosoma en

2. En este stock el primer cromosoma contiene en

en el que se hallan los fragmentos de la proteína GFP 10 y GFP11 asociados a la

La finalidad de los cruces realizados ha sido testar la expresión de esos

1. ♂ X♀ → expresión en la línea CySC.

2. ♂ X♀ → expresión en la línea GSC.

En primer lugar comenzamos con la selección de hembras vírgenes (se necesitan

, para esto “crecemos” moscas hembras y machos en

Posteriormente seleccionamos machos (no importa que sean vírgenes) de genotipo

La descendencia del cruce de moscas con

seleccionar a toda la descendencia, cuyo genotipo sería

sin distinción ya que todos van portar el

Antes de realizar la IF comenzamos con la disección de las moscas. Sumergimos

Tras la disección es necesario fijar los testículos/ovarios, para esto aspiramos el

Posteriormente pasamos a incubar con anticuerpos primarios específicos frente a

Se incuba de 2-4 horas (también en rotación) en 400µl de una solución de

para la línea GSC usaremos como control negativo) y las

mientras que para las CySC nos interesan

aquellas moscas con fenotipo ).

Una vez realizada la IF se “montan” las preparaciones. Esto es distinto si

Una vez realizados estos cruces para comprobar el funcionamiento de los

Figura 11 Esquema en el que representamos como la combinación de los dos constructos y el

Con esos cuatro “constructos” que necesitamos buscamos en la base de datos de

Con las líneas

hemos realizado los cruces para testar el funcionamiento

y constatamos que UASp:nod:GFP y lexO_mCD8:GFP se

Hoechst A Anti-GFP Ab B Anti-HTS Ab C

Figura 13 aquí podemos observar como se ve fluorescencia específica en la

troll:GFP, control positivo

Hoechst Anti-GFP Ab Anti-HTS Ab

Anti-GFP ab Anti-HTS Ab Hoechst

Hoechst Anti-GFP ab Anti-HTS Ab

Figura 19 Se puede observar expresión de la proteína GFP en la capa

troll:GFP, control positivo de