TRABAJO DE FIN DE GRADO

Estudio de la función de las proteínas de la

matriz extracelular en la morfogénesis de la
genitalia interna en machos de Drosophila
melanogaster

SERGIO PALOMINO GÁLVEZ

Universidad Autónoma de Madrid

Grado en Biología
2023
 RESUMEN
Drosophila melanogaster se utiliza como organismo modelo en el estudio de la organogénesis,
un proceso altamente complejo que involucra la actividad de numerosos genes y vías de
señalización. En este trabajo en particular, se investiga el proceso de formación de la genitalia
interna en machos adultos. El objetivo principal ha sido comprender las interacciones de las
proteínas de la matriz extracelular en los diferentes tipos celulares presentes en los testículos y
su relevancia en la correcta formación y espiralización de estos. El empleo del sistema Gal/UAS
se ha permitido generar mutantes que, mediante una expresión génica y temporal restringida,
permiten obtener un rango de estudio mayor y mejorar la comprensión del impacto de la matriz
en diferentes estadios del desarrollo.

Palabras clave: Genitalia interna, testículos, epitelio terminal, vas deferens, matriz
extracelular.

INTRODUCCIÓN

Drosophila melanogaster como organismo modelo

Drosophila melanogaster conocida comúnmente como la mosca de la fruta o del vinagre, es un
organismo modelo ampliamente utilizado en estudios de Desarrollo y Genética. Desde que
Thomas H. Morgan lo introdujo en 1908 (Morgan, 1915). Su ciclo de vida breve y su fácil
mantenimiento en el laboratorio permiten obtener un gran número de individuos en un plazo
reducido de tiempo, lo que facilita la realización de estudios a gran escala. Además, su genoma
ha sido secuenciado y presenta menos complejidad que el de otros organismos, constando de
cuatro pares de cromosomas, de los cuales tres son de mayor tamaño y el otro par es más corto
(Adams et al., 2000). De estos cromosomas, tres pares son de autosomas y un par son
cromosomas sexuales, que responden al esquema XY (Karen et al., 2015). Su reducido número
facilita el estudio de mutaciones y la manipulación genética destinada a la experimentación en
mecanismos moleculares y genéticos que sustentan la biología de este organismo.

Ciclo vital y desarrollo

Drosophila es un insecto holometábolo que experimenta un proceso de metamorfosis completa

para alcanzar su forma adulta, pasando por cambios morfológicos y fisiológicos a lo largo de
diferentes etapas, desde la fase embrionaria hasta el estado adulto o imago (Figura 1.1). A 25ºC
el desarrollo embrionario tiene una duración aproximada de 21 horas, mientras que las larvas
pasan por tres estadios que abarcan cuatro días hasta llegar a la fase de pupa. Durante los cinco
días que dura este proceso de pupación, primero como prepupa y después como pupa, los
órganos larvarios degeneran y se reestructuran hasta su forma adulta. En total y a partir de la
puesta de los huevos, transcurren 9-10 días hasta que emergen las moscas adultas, tras lo cual
los machos tardan unas 8-12 horas en madurar sexualmente, lo que permite que el ciclo vital se
repita. Estos tiempos mencionados se duplican en caso de que la temperatura sea de 18ºC en
lugar de 25ºC.

Durante el desarrollo embrionario, ciertas células de la epidermis se agrupan y diferencian,

formando los discos imaginales, que darán origen a las estructuras del imago o mosca adulta,
como la cabeza, el tórax, la genitalia y la analia (Cohen y Di Nardo., 1993). Los discos
imaginales al comienzo del desarrollo son primordios, pequeños grupos de aproximadamente
10-40 células por disco, que se dividen y proliferan durante el desarrollo larvario hasta formar
grandes sacos epiteliales que dan origen a la cutícula. En paralelo a la formación de los discos
se organizan también unas agrupaciones discretas de células imaginales denominadas
histoblastos que contribuyen a la formación de la cutícula abdominal del imago (Ashburner,
1989). Las larvas contienen un total de 19 discos imaginales que forman estructuras
epidérmicas, divididos en 9 pares bilaterales más el disco genital (Figura 1.2) (Beira y Paro,
2016). Los apéndices característicos de adultos (patas, alas, antenas) provienen de la
diferenciación de las regiones del epitelio de los discos, durante la metamorfosis, en tejidos
ectodérmicos (Figura 1.2) (García-Bellido et al., 1973).

En el adulto se pueden distinguir tres regiones corporales o tagmas perfectamente definidas: la

región cefálica, compuesta por seis segmentos; la región torácica, que posee tres y la región
abdominal, que consta de once segmentos, dónde los dos últimos se fusionan y forman
finalmente un total de diez. En la región distal del abdomen se encuentra la terminalia, formada
por la genitalia y la analia (Christiansen et al.,2002; Sánchez y Guerrero, 2001).

Los procesos de diferenciación y definición de la identidad de los segmentos a lo largo del eje
anterior-posterior ocurren desde las etapas más tempranas del desarrollo embrionario (García-
Bellido et al., 1973). A través de cascadas genéticas, las redes de genes coordinan sus
actividades para establecer la forma y función de los órganos en etapas posteriores. En estos
procesos, se encuentran los genes de segmentación, divididos en tres grupos: los genes GAP,
genes de regla par y genes de polaridad de segmento. Se expresan secuencialmente y
especifican la posición relativa de los segmentos en el embrión mediante la determinación de
regiones progresivamente más definidas, que finalmente asumen la expresión diferencial de un
cuarto grupo de genes, los genes homeóticos o genes Hox (Hales et al, 2015).

Los genes Hox desempeñan un papel fundamental en la especificación de tejidos y órganos en

segmentos específicos. Se agrupan en dos complejos: el complejo Antennapedia y el complejo
Bithorax. El complejo Antennapedia está compuesto por cinco genes: labial (lab),
proboscipedia (pb), deformed (Dfd), Sex combs reduced (Scr) y Antennapedia (Antp); que
controlan la identidad de los segmentos anteriores a la mitad del tórax. A su vez, el complejo
Bithrorax consta de tres genes: Ultrabithorax (Ubx), abdominal-A (abd-A) y Abdominal-B
(Abd-B); que controlan la identidad de los segmentos posteriores a la mitad del tórax (Sánchez-
Herrero et al, 1985). Los genes Abd-A y Abd-B desempeñan un papel fundamental en el proceso
de diferenciación y formación de la genitalia en Drosophila.

Figura 1. Ciclo de vida y discos imaginales de Drosophila melanogaster. 1.1. Ciclo de vida de Drosophila
melanogaster desde el estadio embrionario hasta el imago. En el estadio larvario se distinguen 3 fases: Larva
1, 2 y 3, que aumentan de tamaño hasta el estadio de pupa, de la que emerge el individuo adulto. 1.2.
Localización de los discos imaginales de ojo-antena, pata, ala, halterio y genital en la fase larvaria y
estructuras que forman en el adulto. Imagen modificada de (Blair, 1999)

Anatomía del sistema reproductor del macho adulto.

El aparato reproductor es un sistema complejo formado a partir de dos estructuras larvarias: las
gónadas y el disco genital. Las gónadas se forman en los segmentos embrionarios abdominales
cuarto y quinto (A4 y A5) (Szabad y Nöthiger, 1992) y el disco genital en el octavo segmento
abdominal (A8). Durante la metamorfosis, en las etapas de pupa, los tejidos que derivan del
disco genital se desplazan hacia la región anterior de la pupa donde se fusionan con las gónadas
(Figura 2) (Dobzhansky, 1931; Dobzhansky y Tan, 1937).
El desarrollo de las gónadas involucra tanto células somáticas como células germinales que a
través de distintos mecanismos experimentan procesos de determinación sexual. En la gónada
embrionaria encontramos distintos tipos celulares que se forman durante la embriogénesis:
células madre de la línea germinal (GSCs), precursores somáticos gonadales (SGPs),
precursores somáticos gonadales específicos de macho (msSGPs) y las células pigmentarias
(PCs) (Figura 3) (DeFalco et al., 2003).

Este trabajo se dedicará al estudio de las gónadas en los machos. Una de las diferencias entre
ovarios y testículos es que estos últimos finalizan su proceso de formación al final de la
embriogénesis o primeras etapas larvales, mientras que los ovarios lo harán en la transición
larva-pupa. El “nicho” de células madre en los machos está ubicado en el extremo proximal del
testículo, alrededor del “hub” (Figura 3) (Hardy et al., 1979). Este actúa como un centro
organizador que permite el mantenimiento y regulación del patrón de división de las células
madre mediante vías de señalización como JAK/STAT (Figura 3). Los SGPs tienen, por un
lado, la capacidad de unirse entre sí e incorporar células germinales para formar la gónada
embrionaria y, por otro lado, la de migrar formando un tejido cohesivo que envuelve las células
germinales. Los msSGPs en machos se sitúan en la parte posterior de la gónada embrionaria y
en las hembras experimentan apoptosis específica de sexo. En los machos, migran activamente
para unirse a las SGPs y células germinales en la formación de la gónada y finalmente dan lugar
al epitelio terminal de los testículos, de gran importancia en este trabajo por ser la región que
habrá de contactar con el resto de la genitalia interna a través de las vesículas seminales o vasa
deferentia. Durante la última etapa de la embriogénesis surgen las células pigmentarias,
específicas de las gónadas de los machos, que rodean superficialmente a los testículos y a otras
regiones de la genitalia interna y de las que se desconoce la función aunque se cree que influye
en la formación de los testículos a través de señales hormonales (Whitworth et al., 2012).

Por otro lado, toda la genitalia interna está rodeada por una capa muscular que se origina a partir
de células precursoras del músculo que migran desde el disco genital en el momento en que
contactan con la base de la gónada, hasta rodearla. Encima de esta capa de tejido muscular liso
se encuentra la lámina basal y sobre ella, la capa conformada por las células pigmentarias. La
formación del disco genital se da en el extremo posterior del embrión y da origen a la parte
posterior del intestino o hindgut, la analia y la totalidad de la genitalia externa e interna,
excluyendo las gónadas (Nöthiger et al., 1997). El disco genital deriva de la invaginación de
precursores embrionarios de los tres últimos segmentos abdominales (A8, A9 y A10) que se
fusionan y pasan a localizarse en el segmento A8 en el estadio larval (Schüpbach et al., 1978).
Dentro del grupo de células que componen el disco genital, podemos distinguir tres regiones:
la región anterior o primordio A8, que da origen a la mayor parte de la genitalia femenina; la
región medial o primordio A9 que da origen fundamentalmente a la genitalia masculina; y la
región posterior o primordio A10, que forma la analia en ambos sexos (Schupbach et al, 1978).

En este trabajo se estudiará la genitalia de los machos adultos de Drosophila que son estructuras
elongadas y enrolladas en espiral donde maduran los espermatozoides. Los derivados del disco
forman unas estructuras que contactan directamente con los testículos, los vasa deferentias. El
epitelio del vas deferens está cubierto por una capa de músculo y células epiteliales y se adhieren
a la parte posterior del testículo dónde las msSGPs forman el epitelio terminal. Esta región es
crucial para la diferenciación final de las espermátidas y diversos estudios apuntan que poseen
un papel importante en la conexión del testículo con otras partes del tracto reproductivo
(Whithworth et al., 2012). El epitelio terminal comprende desde la unión del testículo con el
vas deferens hasta la región del testículo dónde hay más separación entre las células. Los vasa
deferentia están en contacto directo con el conducto eyaculatorio en un punto en el que también
se unen las paragonias, glándulas accesorias. El conducto eyaculatorio desemboca en la bomba
espermática que continúa hasta el aparado del pene, que comunica la genitalia con el exterior
(Figura 2) (Miller, 1941).

Figura 2. Fases de formación y anatomía de la genitalia en machos. Están representados cinco estadios del
proceso de unión de los derivados del disco genital con las gónadas y su posterior desarrollo. Las tres primeras
fases detallan las primeras 24 horas del proceso donde el contacto entre ambas estructuras no se ha dado. Sin
embargo en las fases 4 y 5, tras el contacto, las estructuras de la genitalia interna presentan un desarrollo más
acusado. En los dibujos se detallan las partes convenientemente: epitelio terminal (ET), vas deferens (VD),
paragonias (P), testículos (T), conducto eyaculatorio (CE), bomba espermática (BE) y pene (P). Imagen
modificada de (Epper, 1983).
 Figura 3. Tipos celulares presentes en la embriogénesis de los testículos. Resumen de los tipos celulares y
procesos de migración en la formación y maduración de los testículos. (Whitworth et al., 2012).

Formación y desarrollo de la genitalia

Como he indicado anteriormente, el disco genital y los testículos tienen origen en diferentes
segmentos, el disco en la región del segmento abdominal octavo y los testículos en el cuarto.
Durante el desarrollo pupal de machos y hembras, el disco genital se evagina y alarga hacia la
parte anterior a medida que desarrolla varias estructuras que se fusionan con las gónadas para
formar el sistema reproductivo. Al estar separados por una larga distancia se ha postulado la
existencia de alguna señal que provenga de las gónadas o de los derivados del disco genital que
sea responsable del contacto entre ambas estructuras. Durante décadas se ha estudiado cómo
ocurre este proceso de fusión mediante el trasplante de gónadas y discos genitales así como la
producción de ginandromorfos. Se ha observado que la espiralización y desarrollo de los
testículos solo ocurre cuando existe contacto entre el vas deferens y los testículos (Stern y
Ardon, 1939). Investigaciones más recientes sugieren que puede haber una señal del disco
genital hacia las gónadas, pero no al revés, y que en ausencia del disco genital, estas no se
desarrollarían, pero el disco tendría la capacidad de hacerlo aún sin la presencia de las gónadas
(Olivera, 2017).

Entre otras cosas, el contacto entre el testículo y el disco genital se requiere para intercambiar
ciertas células. Así, los precursores de las células musculares no se encuentran en los testículos
antes de que contacten con los derivados del disco ni las células pigmentarias existen fuera de
las gónadas, y es necesario que suceda una doble migración celular donde las células
musculares del vas deferens se desplazan hacia el testículo para rodearlos y las pigment cells
migran en dirección opuesta hacia el vas deferens para cubrir el vas deferens.

El contacto entre estas estructuras conduce a la elongación y enrollamiento de los testículos,

que presenta diferencias en función de la especie. En Drosophila melanogaster son dos vueltas
y media y siempre en la misma dirección, dextrógira, por lo que también se ha considerado un
buen modelo de estudio de asimetría.

Matriz extracelular

La matriz extracelular (MEC) es una red tridimensional que abarca órganos, tejidos y células
del organismo en todos los animales y que sirve de protección, nutrición y soporte celular. La
membrana basal es una MEC especializada y participa en procesos de morfogénesis,
señalización, compartimentalización y mantenimiento de los tejidos (Farquar, 1991). Las
moléculas que constituyen la membrana basal están asociadas entre sí y también a las células
epiteliales. En Biología la matriz extracelular ha sido objeto de estudio desde hace décadas
debido a su importancia en procesos de desarrollo de los distintos órganos y su papel específico
en la migración celular (Fehon et al, 1987; Semeriva et al., 1989).

La proteína más abundante de la MEC es el Colágeno IV, común a todos los animales.
Estructuralmente, está formado por tres cadenas α que se asocian con otras proteínas a través
de sus dominios (Glanville, 1987). En Drosophila existen dos genes que codifican para estas
cadenas de Colágeno IV: viking (vkg) y Collagen at 25C (Cg25C). La falta de función de
cualquiera de los dos imposibilita el desarrollo de la mosca (Rodriguez et al., 1996;
Yasothornsrikul, 1997). Además del Colágeno IV otros tres elementos componen la membrana
basal: la Laminina, el Nidógeno y el Perlecán, presentes los tres en Drosophila (LeBleu et al.,
2007).

En este trabajo se estudian genes que codifican para elementos de la MEC así como para algunas
proteínas asociadas (Figura 4).

Entre los que pertenecen a la propia matriz extracelular y que actúan como ligandos
extracelulares destacan las lamininas: LamininA y LamininB. Las lamininas son glicoproteínas,
compuestas por tres brazos cortos, cada uno de ellos con dos o tres dominios globulares, y un
brazo largo con un único dominio globular. Son un complejo de tres cadenas polipeptídicas:
alfa, beta y gamma. Las funciones de estos dominios estructurales están relacionadas con la
adhesión celular y la interacción con proteínas de la matriz. En estudios recientes se ha visto
que las integrinas serían las responsables de mediar la interacción entre las células del hub y la
MEC de la pared del testículo (Tanentzapf et al., 2007).

Un segundo grupo de genes son aquellos implicados en la modulación, que codifican para
proteínas como las metaloproteinasas de matriz (MMP) inducidas por la vía de señalización
JNK. La función de las metaloproteinasas es la remodelación del tejido degradando la matriz
extracelular y en Drosophila sólo existen dos: Matrix metalloproteinase 1 (Mmp1) y Matrix
metalloproteinase 2 (Mmp2) (Srivasttava et al., 2007). La inhibición de las metaloproteinasas
se da por parte del inhibidor Tissue inhibitor of metalloproteinases (Timp) que uniéndose a ellas
las inactiva, anulando así su función (Brew et al., 2000).

Por último hemos estudiado algunos de los genes de las integrinas y sus proteínas asociadas.
Las integrinas son proteínas transmembrana que conectan el citoesqueleto de actina con las
células epiteliales y desempeñan un papel crucial en procesos de proliferación y diferenciación
durante el desarrollo. Estas proteínas no se conectan directamente al citoesqueleto, sino que lo
hacen mediante proteínas asociadas a integrinas (IAPs) como PINCH, Vinculina, Tensina o
Talina. Las talinas están presentes en el citoesqueleto y se asocian a las regiones citoplasmáticas
de las integrinas, mediando la transducción bidireccional de la señal de la membrana
permitiendo su unión con las lamininas. Las integrinas son heterodímeros conformados por una
cadena α y una β que están unidas entre sí para formar el receptor extracelular funcional con el
que conectan estructuralmente con el medio (Kishimoto et al., 1987). Están implicadas en
interacciones celulares durante diferenciación y desarrollo tanto en Drosophila como en
vertebrados (Brown, 1993). En Drosophila se han identificado un total de cinco subunidades α
y dos β, codificadas por genes como inflated (If), multiple edematous wings (Mew) y
myospheroid (mys). Mys codifica para la subunidad βPS y se necesita para prácticamente todos
los procesos conocidos mediados por integrinas (Devenport and Brown, 2004).

En este trabajo se estudiará el papel de estas proteínas de la Matriz Extracelular en el testículo

y el epitelio terminal de Drosophila. El análisis de estas proteínas facilita la comprensión de los
complejos mecanismos de remodelación de la matriz y su importancia en la organogénesis y
migración y remodelación celular. Además, permite reducir el área de estudio a genes
específicos, ya que, en mamíferos, existen alrededor de 20 isoformas de metaloproteinasas y 4
isoformas de sus los inhibidores (Brew et al., 2000), en cambio en Drosophila este número se
reduce a dos genes que codifican metaloproteinasas y un único gen que codifica su inhibidor
Timp. Estudios previos han logrado determinar el papel de la membrana basal en la formación
de otros órganos como las alas o los halterios (García, 2020). Sin embargo, en los testículos,
aún no se ha dilucidado el papel concreto de estas proteínas y su importancia en la maduración
y espiralización testicular.

Figura 4. Tejidos presentes en el testículo y composición detallada de las proteínas de la MEC. En la

imagen superior se muestra la capa de células epiteliales, musculares y células pigmentarias presentes en el
testículo. Con más detalle, se representa la imagen con todas las proteínas mencionadas anteriormente.

MATERIAL Y MÉTODOS

1. Sistema Gal4/UAS

El sistema Gal 4/UAS es una herramienta genética proveniente de levaduras que permite lograr
una expresión génica temporal y espacialmente restringida (Brand y Perrimon, 1993). La
presencia de la proteína Gal 4 permite establecer un control preciso de la expresión génica en
respuesta a patrones específicos de expresión de los potenciadores de la línea utilizada. Gal4 se
une a secuencias específicas del ADN conocidas como Upstream Activation Sequence (UAS),
activando la transcripción del locus adyacente. Esto permite activar de forma dirigida la
transcripción de diversas secuencias de interés, que puede ser un gen que deseamos
sobreexpresar, un marcador visible o un ARN de interferencia. Para visualizar las regiones de
interés, se emplea el sistema UAS-GFP (Green Fluorescent Protein), que permite detectar la
fluorescencia en el dominio dirigido por Gal4.

La actividad de Gal4 puede ser anulada y controlada mediante la expresión ubicua de la proteína
Gal80 termosensible (Gal80-ts). Gal80 inactiva la acción del sistema Gal4-UAS al bloquear la
función de Gal4. Cuando las larvas son expuestas a una temperatura de 29ºC, la versión
termosensible de la proteína Gal80 se degrada y activa el sistema Gal4-UAS. Sin embargo, a
17ºC, Gal80-ts es estable y la actividad de Gal4 se ve interrumpida por ella (McGuire et al.,
2003). Esto permite utilizar los cambios de temperatura a la que se cultivan las moscas como
un interruptor general que activa y desactiva el sistema Gal4 mencionado.

Figura 5. Funcionamiento del sistema Gal4-UAS en Drosophila melanogaster. La imagen detalla el cruce
entre dos líneas, una de ellas tiene Gal-4 controlado por un promotor específico, mientras que la otra contiene
una secuencia UAS seguida de un gen de interés. En la progenie resultante que se muestra en la parte inferior
de la imagen, a través del sistema Gal4-UAS, cuando el promotor específico del tejido se activa y produce la
transcripción y unión deGal4 al UAS, también se llevará a cabo la transcripción del gen de interés.

1.1 Líneas Gal4

Se han utilizado distintas líneas Gal4 con las que poder dirigir de forma específica la expresión
a los testículos, epitelio terminal y vas deferens.

Por un lado, las líneas Gal4 utilizadas han sido: c855a-Gal4 (Bloomington 6990; Hrdlicka et
al., 2002); Mj12a-Gal4 (Bloomington 6991), mef2-Gal4s (Ranganayakulu et al., 1995) y 1151-
Gal4s (Roy y Raghavan, 1997).
 1.2 Líneas UAS

Para poder seguir dominios de expresión se utilizaron las construcciones UAS-GFP que marca
las células mediante una proteína fluorescente verde y UAS:Cherry que expresa una proteína
fluorescente roja. Se utilizó también UAS-Timp (Bloomington 58708).

• Líneas reporteras

Se utilizaron líneas de expresión de GFP asociadas a diferentes genes de interés, bien como
inserciones de la GFP en sus loci, bien como construcciones que incluyen secuencias
reguladoras propias de estos genes o bien para monitorizar su expresión.

Las construcciones que se utilizaron fueron: Mys:GFP, lamA:GFP, lanB1:GFP, mmp1:GFP,

mmp2:GFP, rhea:Cherry:

• ARN de interferencia y líneas utilizadas

Mediante el sistema de interferencia ARNi se pueden silenciar genes debido a la degradación

de sus ARN mensajeros mediante el ARN de doble cadena (dsARN) de secuencia idéntica. De
esta manera, permite generar fenotipos de pérdida de función, que se traduce en un
silenciamiento génico. Este sistema puede acoplarse al sistema Gal-4 mediante la utilización de
construcciones UAS-ARNi que permitirán reducir la expresión génica en diferentes células del
testículo en el momento del desarrollo y el tejido específico deseados.

Los UAS-ARNi utilizados fueron: UAS-Mys ARNi (Bloomington 33642), UAS-lanB1 ARNi
obtenida de VDRC, UAS-mmp1 ARNi, UAS-mmp2 ARNi, UAS-rhea ARNi, UAS-lamA ARNi
proporcionadas por BDSC.

Selectivamente, empleando las distintas líneas Gal mencionadas previamente, se inducirá la

expresión en distintos tipos celulares y etapas concretas del desarrollo generando así un
contexto de pérdida de función de los genes asociados.

2. Inmunohistoquímica

Para el estudio de los testículos, se diseccionan machos adultos en PBS 1X, separando el
abdomen del tórax y abriendo la cutícula hasta medio abdomen por su zona dorsal o lateral.
Después de este proceso se fija la muestra en Paraformaldehido (PFA) al 4% (con Tritón X-100
al 0,1% y DOC al 0,1%) durante 45 minutos.

Pasados los 45 minutos se realizan tres lavados lentos con PBT (0,1% Tritón X-100 en PBS) de
15 minutos y acto seguido tres lavados rápidos (añadiendo y retirando PBT). Después de los
lavados se añade el anticuerpo primario y se incuba a 4ºC toda la noche. Una vez pasado ese
tiempo, se realizan cuatro lavados de 10 minutos con PBT y se incuban con el anticuerpo
secundario que corresponde a 2 horas a temperatura ambiente en el agitador.

Se realiza un lavado de 15 minutos en PBT para retirar el anticuerpo secundario y se añade To-
pro-3 (Life Technologies) para marcar los núcleos (15 minutos en una dilución de 1:500).
Finalmente se realizan otros tres lavados de 10 minutos con PBT y se retira para añadir el
Vectashield (Vector laboratorios, Inc.), un medio líquido que permite conservar la muestra antes
del montaje. Los testículos para analizar se colocan sobre el Vectashield en un portaobjetos y
encima se coloca el cubre que se sella con laca para su posterior observación en el microscopio
confocal.

• El anticuerpo primario que utilizado ha sido anti-tropomiosina desarrollado rata (1:200)

(MAC141; Babraham Tech.).
• El anticuerpo secundario empleado ha sido antirata con el fluorocromo Alexa Fluor 555
(Thermo Fisher), en una dilución 1:200.

La tinción con To-Pro-3 (Life Technologies), en una dilución 1:500, incorporado al proceso
como se ha mencionado en el protocolo previamente (Baena-López et al., 2003)

3. Obtención de imágenes

Los adultos que habían sido teñidos con fluorescencia en la atapa previa se visualizaron y
analizaron en el microscopio confocal Leica “TCS SPE” y las imágenes obtenidas en él se han
tratado digitalmente con el programa ImageJ y se han montado y tratado con Adobe Photoshop.
 OBJETIVOS

Este trabajo tiene la finalidad de estudiar y comprender mejor las relaciones de las proteínas de
la matriz extracelular en el correcto desarrollo del testículo. Los objetivos planteados para ello
fueron los dos siguientes:

- Estudiar la expresión de las proteínas de la matriz en la genitalia, el epitelio terminal y

el vas deferens.
- Caracterizar funcionalmente estos genes en contexto anatómico del epitelio terminal y
sus requerimientos en el desarrollo de los testículos.

RESULTADOS

Papel de los componentes de la Matriz Extracelular en el desarrollo de los testículos.

Como hemos visto, el desarrollo del testículo incluye procesos morfogenéticos diversos, como
elongación y determinación de tejidos, migraciones celulares, el crecimiento polarizado que
permite la espiralización y la fusión de tejidos en el encuentro entre el vas deferens y el propio
testículo.

En este tipo de procesos, es muy relevante la matriz extracelular como elemento de interacción
célula-célula y como medio en el que distribuir de manera ordenada las células. En el contexto
de una elongación o una migración las células deben perder y ganar diferentes capacidades de
adhesión y de integración en el tejido y deben responder a señalizaciones que las orienten
espacialmente.

De todos los componentes de la matriz celular, hicimos una selección que incluía las dos
metaloproteinasas mmp1 y mmp2 debido a su papel fundamental en la degradación de la matriz.
También incluimos Timp para anular la función de las metaloproteinasas inhibiéndolas. Una
integrina, estudiada mediante el gen Mys, que codifica la subunidad que permite la activación
funcional de estas proteínas. Asimismo, las dos lamininas lamA y lanB que participan en
procesos de adhesión e interacción entre elementos de la matriz. La interacción entre integrinas
y lamininas está mediada, entre otros, por la Talina, codificada por el gen rhea, que también
seleccionamos.
El abordaje para estudiar estos componentes fue doble: por un lado, nos centramos en la
especificación precisa de cada uno de ellos en el contexto de la genitalia interna del macho, con
especial enfoque en la unión disco-testicular, lugar en el que se concentran todos los procesos
descritos anteriormente. Por otro lado, estudiamos la falta de función de estos genes en ese
mismo contexto, mediante la utilización de ARNs de interferencia dirigidos específicamente a
una selección.

1. Expresión de genes de MEC en la genitalia interna.

La matriz extracelular (MEC) además de ser un andamio estructural proporciona información

esencial para la diferenciación y el desarrollo adecuado de los tejidos. En este trabajo se ha
estudiado el posible papel de la MEC y su importancia en el desarrollo de los tejidos que
conforman el testículo en su proceso de crecimiento y diferenciación. Con el fin de comprender
mejor este proceso, se han investigado los distintos componentes de la MEC y de qué forma
son capaces de regular procesos de adhesión celular, migración, diferenciación y proliferación.

Las proteínas que se han estudiado son las siguientes:

• Integrinas: proteínas heterodiméricas transmembrana compuestas por una cadena α y

una β que conectan estructuralmente con el medio. Se sabe que tanto en Drosophila
como en vertebrados están implicadas en interacciones celulares durante la
diferenciación y el desarrollo. El gen que se ha utilizado para estudiar las integrinas ha
sido el gen myospheroid (mys) que codifica para la subunidad βPS (Wright, 1960), que
ha sido caracterizada en una amplia variedad de tejidos, mientras que la cadena β (βPV)
es típica de la porción media del intestino. (Brown, 2000).

• Talinas: proteínas presentes en el citoesqueleto que se asocian a las regiones

citoplasmáticas de las integrinas, mediando la transducción bidireccional de la señal en
la membrana y permitiendo su unión con las lamininas. Es el gen rhea el que codifica
en Drosophila para la acción de la Talina y el que se utilizó en este trabajo para estudiar
a estas proteínas.
 • Lamininas: las lamininas son complejos glucoproteicos compuestos por subunidades
múltiples que interaccionan entre sí y con el resto de los elementos de la membrana. En
Drosophila únicamente se han identificado tres ligandos extracelulares y dos de ellos
son lamininas. En estudios previos se encontró una alta similitud de secuencias en las
cadenas β que componen las lamininas de ratón y Drosophila además de otras
homologías en diferentes regiones y otros dominios. Las dos lamininas que se han
estudiado son lamA y lanB1.

• Metaloproteinasas: como se mencionó anteriormente, las metaloproteinasas tienen

como función la remodelación del tejido mediante el proceso de degradación de la MEC.
Las metaloproteinasas utilizadas han sido Matrix metalloproteinase 1 (Mmp1) y Matrix
metalloproteinase 2 (Mmp2). Ambas proteínas están relacionadas con la dinámica de la
MEC y pueden aparecer ancladas a la membrana o en el medio. En Drosophila
únicamente existen estas dos metaloproteinasas que se han utilizado en este estudio, por
lo que permite hacer un análisis muy completo de la función de estas proteínas.

• Inhibidor de las metaloproteinasas: Tissue inhibitor of metalloproteinases (Timp) es el

único inhibidor de metaloproteinasas de Drosophila. Al ser un gen único, representa su
inhibición completa, inactivándolas y anulando así su función.

Para visualizar la expresión de proteínas en el microscopio de fluorescencia de los genes

mencionados anteriormente se diseccionaron los testículos de machos adultos utilizando las
siguientes construcciones: MysGFP; rhea:Cherry; lamA:GFP; lanB1:GFP; Mmp1:GFP;
Mmp2:GFP. En las siguientes fotografías tomadas de estas construcciones se revelan las
regiones de expresión de estos genes en los testículos, el vas deferens y el epitelio terminal, lo
que nos permite obtener información sobre los lugares específicos dónde se activan. Utilizando
TOPRO, logramos delimitar eficientemente la región final del epitelio terminal mostrando un
cambio abrupto en su expresión, debido a la distribución especial de sus células.
Figura 6. Expresión de los genes que codifican para proteínas de MEC. Imágenes del testículo en
individuos macho adultos. Son seis figuras independientes, numeradas del 1-6 que se dividen en series de 3.
En la izquierda se observan los 3 canales simultáneamente, la segunda imagen muestra los núcleos teñidos de
azul con el marcador TOPRO y de color rojo por el anticuerpo anti-tropomiosina, a excepción de la 2, que
tiene cambiados el canal de Cherry por el de tropomiosina. En la de la derecha se marca de color verde, por el
sistema UAS:GFP, las zonas de expresión de los genes que titulan cada imagen. Todas tienen flechas
indicativas de los lugares concretos de expresión.

Mys:GFP: la expresión de mys en los tejidos estudiados fue algo más baja pero se aprecia claramente como
en el vas deferens y en el segmento inicial del epitelio terminal hay expresión del reportero (6.1).

Rhea:GFP: la expresión se localiza concentrada únicamente en el sector del epitelio terminal que contacta con
el vas deferns. A lo largo del testículo se detecta también una expresión leve (6.2).

lanB1:GFP: se observó expresión en la zona media del vas deferens y el epitelio terminal, así como en el
inicio del testículo, marcando las células pigmentarias y la fibras musculares que están presentes a lo largo de
su recorrido (6.3).

lamA:GFP: se detectó expresión en las células musculares del epitelio del vas deferens y de los testículos
completos. La mayor actividad génica se localiza en la zona del epitelio terminal y del segmento proximal del
testículo (6.4) (6.6).

mmp1:GFP: se expresaba a lo largo del epitelio terminal y en el vas deferens, concretamente en la zona
proximal, dónde se produce el contacto con el testículo (6.5).

mmp2:GFP: en las imágenes tomadas no se ha detectado señal relevante en ninguna de las regiones analizadas.
.

En general, se ha observado una menor expresión a lo largo del testículo en los genes
estudiados, con alguna excepción. Así, rhea-Cherry marca todo el epitelio del testículo y mmp-
GFP muestra expresión hasta el extremo distal del testículo, abarcando todo su recorrido. No
obstante, la mayor expresión de mmp1-GFP se concentra en las regiones mencionadas
anteriormente, epitelio terminal y vas deferens. Las dos lamininas apenas muestran expresión a
lo largo del testículo y la expresión de mys-GFP es muy débil.

2. Función de la MEC en el desarrollo testicular.

Desarrollo de los testículos y fenotipo asociado.

Para el estudio de los mutantes obtenidos se diseccionó la genitalia interna de machos adultos
con el fin de poder catalogar y analizar los fenotipos que mostraban en base a la clasificación
que se muestra en la figura (Figura 7).

Se valoró en función del grado de desarrollo una vez alcanzaba el estadio de adulto en su ciclo
vital. Los fenotipos 1 y 2 se denominan fenotipos “en bola” y presentan un nivel de desarrollo
mínimo en el que no hay unión entre el disco genital y las gónadas, resultando en una forma
ovalada. El fenotipo 3 es el “fenotipo en maza” en el que se ha desarrollado la región proximal
del testículo que contacta con los derivados del disco genital, pero en la zona distal del testículo
hay ausencia de elongación; en esta región se observa un engrosamiento fruto de la ausencia de
migración del tejido muscular a lo largo del testículo. En el fenotipo 4 el desarrollo es mayor
sin llegar a ser completo y no se evidencia ningún engrosamiento en la parte distal. En este
caso, el desarrollo del testículo es más pronunciado y también se aprecia una mayor
espiralización, aunque no alcanza a ser total: típicamente el testículo espiraliza hasta dar entre
1 y 1,5 vueltas de las 2,5 que da en condición salvaje. En el fenotipo 5 o wild type la maduración
del testículo es plena y se encuentra totalmente espiralizado sin defecto en los tejidos,
indistinguible de un testículo no mutante.
 Figura 7. Catalogación de los fenotipos de testículos según su grado de desarrollo. Figura comparativa
que muestra cinco casos reales de los fenotipos ordenados de mayor a menor expresividad. Los fenotipos 1 y
2 corresponden a testículos con morfología ovalada, denominados “en bola”. Por otro lado, los fenotipos 3 y
4 denominados “en maza”, donde únicamente el fenotipo 3 exhibe el engrosamiento distal característico. Por
último se ilustra el fenotipo 5 o wild type.

Estudio funcional de los genes de la MEC

Para comprender la intervención e importancia de los distintos componentes de la Matriz

Extracelular en la formación de los testículos se han utilizado distintos Gal4 como drivers para
alterar la expresión de los genes seleccionados mediante líneas UAS y UAS-ARNi en diferentes
tipos celulares y zonas concretas de la genitalia interna: testículos, epitelio terminal y vas
deferens. De todos ellos hicimos comprobación de sus dominios de expresión mediante cruces
con reporteros UAS-GFP y UAS-RFP. Los Gal4 que se han estudiado han sido:

• 1151-Gal4 en las células musculares del testículo y del vas deferens. (Figura 8A).

• mef2-Gal4 (Ranganayakulu et al., 1995) se expresa en todas las células musculares

(Figura 8B).

• c855a-Gal4 se expresa en el epitelio de toda la región distal del vas deferens,

específicamente en la zona en la que se une al conducto eyaculatorio (Figura 8C).

• Mj12a-Gal4 se expresa en el epitelio terminal en las células pigmentarias, así como en

el vas deferens hasta su unión al conducto eyaculatorio (Figura 8D).
 Figura 8. Expresión de los Gal4. Imágenes en las que se muestra el lugar de expresión mediante el sistema
UAS:GFP (B, C y D) en color verde y UAS-RFP (A), de color rojo. Los núcleos de las células marcadas con
TOPRO se visualizan en color morado. En las 4 imágenes se señalan convenientemente las partes de la
genitalia interna: testículos (T), epitelio terminal (ET) y vas deferens (VD).

Las líneas Gal80ts se emplearon para mejorar la precisión del sistema y tener el control sobre el
momento específico del desarrollo en el cual se activa la expresión del gen de interés. Los
cruces realizados con estas líneas se mantuvieron a 17º para tener bloqueada la actividad de
Gal4 hasta que alcanzasen etapas concretas del desarrollo, dónde se pasaban a 29ºC para
inactivar a Gal80ts y permitir que Gal4 realice su función.

Las líneas UAS-ARNi permiten inhibir la expresión de estos genes mediante ARNs de
interferencia (ARNi). Los cruces que se realizaron entre las líneas Gal4 y Gal80ts se hicieron
con el fin de poder suprimir la función del gen en un tipo celular y momento específico del
desarrollo. Los UAS-ARNi que se utilizaron fueron: UAS-Mys ARNi, UAS-rhea ARNi, UAS-
lamA ARNi, UAS-lanB ARNi, UAS-mmp1 ARNi, UAS-mmp2 ARNi. Además se utilizó la línea
UAS-timp, que expresa el inhibidor natural de metaloproteinasas Timp.

Se calculó la proporción porcentual de cada fenotipo obtenido a partir de una cohorte de entre
40-50 individuos de machos adultos. De los cruzamientos usando las líneas 1151- Gal80ts y
mef2- Gal80ts.se sometió a los organismos a un cambio de temperatura de 17ºC a 29ºC cuando
alcanzaban la fase de larva 3 (L3), para inactivar al sistema Gal80ts en ese punto específico del
ciclo vital. Por otro lado, en los cruzamientos con Mj12a-Gal4 (Bloomington 6991) y c855a-
Gal4 (Bloomington 6990), se mantenían a una temperatura constante de 25ºC y una vez
realizaban la puesta, se pasaban a una cámara de 29ºC para acelerar el proceso de crecimiento.
Metaloproteinasas:

Figura 9. Porcentaje de fenotipos obtenidos en los cruzamientos con UAS-Mmp1 ARNi y UAS-Mmp2
ARNi. Resultados de una muestra de entre 40-50 individuos que se diseccionaron y clasificaron en las 5
categorías fenotípicas. El cruce se realiza con las líneas 1151- Gal80ts y mef2-Gal80ts en dos puntos del
desarrollo diferentes: embrión (E) y fase de larva 3 (L3).

Se hicieron cruces entre las dos metaloproteinasas Mmmp1 y Mmp2 con las líneas 1151-Gal80ts
y mef2-Gal80ts. Para determinar el instante preciso del desarrollo en el que participan las dos
metaloproteinasas en el proceso, se aplicó el cambio a la cámara de 29ºC en dos etapas
diferentes del ciclo vital: durante la fase de larva 3 (L3) y durante la etapa embrionaria (E). Las
líneas 1151- Gal80ts y mef2- Gal80ts dirigen la expresión a los precursores musculares a lo largo
de todo el proceso de crecimiento y maduración del testículo (Figura 9).

Inhibidor de metaloproteinasas:

Figura 10. Porcentaje de fenotipos obtenidos en los cruzamientos con UAS-timp. Resultados de una
muestra de entre 40-50 individuos que se diseccionaron y clasificaron en las 5 categorías fenotípicas. El cruce
se realiza con las líneas 1151- Gal80ts, mef2- Gal80ts, Mj12a-Gal4 (Bloomington 6991) y c855a-Gal4
(Bloomington 6990).

Para complementar los resultados obtenidos de los cruces con las metaloproteinasas, se llevaron
a cabo cruzamientos entre las líneas mencionadas anteriormente y Mj12a-Gal4 (Bloomington
6991) y c855a-Gal4 (Bloomington 6990) con el único inhibidor de metaloproteinasas presente
en Drosophila, Timp. Los resultados de estos cruces muestran un incremento significativo del
fenotipo 4 en los cuatro cruces, así como una disminución del fenotipo salvaje en comparación
con los resultados previos. Es importante destacar el porcentaje de individuos con el fenotipo
en maza en el cruce con mef2-Gal4 siendo la única línea en la que se observó este engrosamiento
en la parte distal del testículo. En los demás, se presentaron fenotipos 4 con un crecimiento
incompleto alternándose con fenotipos salvajes (Figura 10).

Integrinas:

Figura 11. Porcentaje de fenotipos obtenidos en los cruzamientos con UAS-Mys ARNi. Resultados de una
muestra de entre 40-50 individuos que se diseccionaron y clasificaron en las 5 categorías fenotípicas. El cruce
se realiza con las líneas 1151- Gal80ts, mef2- Gal80ts, Mj12a-Gal4 (Bloomington 6991) y c855a-Gal4
(Bloomington 6990).

Los siguientes resultados se han obtenido del cruce con UAS-Mys ARNi y revelan de nuevo
una predominancia del fenotipo salvaje en los cruces con las líneas 1151-Gal80ts, Mj12a-Gal4
(Bloomington 6991) y c855a-Gal4 (Bloomington 6990). Sin embargo, se observan
porcentajes significativos del fenotipo 4, especialmente con mef2-Gal4, donde se registra un
70,59% de individuos que muestran un desarrollo incompleto del testículo. Aun así la
aparición de los fenotipos menos desarrollados no se observa en ninguno de los casos cuando
no se expresa la integrina en el proceso (Figura 11).

Lamininas y talina:
 Figura 12. Porcentaje de fenotipos obtenidos en los cruzamientos con UAS-lamA ARNi, UAS-lanB ARNi
y UAS-rhea ARNi. Resultados de una muestra de entre 40-50 individuos que se diseccionaron y clasificaron
en las 5 categorías fenotípicas. El cruce se realiza con las líneas 1151- Gal80ts, mef2- Gal80ts, Mj12a-Gal4
(Bloomington 6991) y c855a-Gal4 (Bloomington 6990).

Las siguientes tablas (Figura 12) recogen los resultados de los cruces entre 1151, mef2, 6990 y
6991 Gal4 con las líneas de ARN de interferencia contra los dos tipos de lamininas en
Drosophila. Además, se realizaron cruces con el UAS-rhea ARNi, impidiendo que codifique la
proteína talina, evitando así la unión de las integrinas y las lamininas.

En ninguna de las tres tablas se observan fenotipos más fuertes que el Fenotipo 4. En los
cruzamientos con UAS-lamA ARNi, se observa una distribución equilibrada entre los fenotipos
5 y 4 en los cruces con 6991 y 1151 Gal4, lo que indica que el desarrollo ha alcanzado estadios
avanzados o completos. Con mef2 y 6990 Gal4, el fenotipo wild type predomina con un 73,53%
en ambos casos. De igual manera, los cuatro cruces con UAS-lanB1 ARNi presentan únicamente
estos dos fenotipos. Destaca el cruce con 6990 con un 70,59% de individuos con fenotipo 4,
con variaciones en el grado de desarrollo, pero sin la presencia del engrosamiento en el área
apical característico del fenotipo “en maza”.

En la última tabla se representan los mutantes UAS-rhea ARNi donde se contempla un alto
porcentaje de individuos con fenotipo salvaje, excepto en el caso en que el interferente es
expresado con la línea 6990-Gal4, en cuyo caso encontramos un porcentaje de 70,59% de
individuos con el fenotipo 4. (Figura 12

DISCUSIÓN

En este estudio se ha intentado comprender qué papel desempeñan distintas proteínas que
forman parte de la Matriz Extracelular en Drosophila en los procesos de formación y desarrollo
del sistema reproductivo masculino adulto. Para ello, previamente se ha analizado los patrones
de expresión de los genes determinados en los testículos y el vas deferens.
En estudios se ha llegado a la conclusión de que el desarrollo de los testículos depende del
contacto de las gónadas con los derivados del disco genital. Se ha visto también que la secuencia
de desarrollo de los testículos es, en primer lugar, la elongación, dónde perdían esa morfología
redondeada y posteriormente se enrollaban dos vueltas y media. (Olivera, 2017; Rothenbusch-
Fender et al., 2017).

Se investigó asimismo si la morfología que adquieren los testículos estaba relacionada con la
presencia de células musculares que los rodean, ya que únicamente habían sido estudiados
morfológicamente hasta entonces (Susic-Jung et al., 2012). Parece que las células musculares
desempeñan un papel importante como “escultoras” de la forma final del testículo. Esta
hipótesis se basa en dos observaciones: en primer lugar, se ha observado que en ausencia de
migración de los miocitos no ocurre la elongación del testículo; en segundo lugar, cunado la
migración de los miocitos es incompleta, se ha observado que la elongación también es limitada.
El límite de migración de las células musculares coincide con el límite de elongación de todo
el testículo, lo que da como resultado la morfología previamente descrita como “en maza”
(Olivera, 2017).

Se han llevado a cabo investigaciones sobre el papel de la MEC en procesos de desarrollo y

diferenciación de tejidos en Drosophila, incluyendo el ala y otros tejidos, dónde se ha
demostrado que participaba en procesos de migración celular y eliminación de la matriz. Se ha
demostrado que el papel de la MEC es clave en el desarrollo del músculo liso. Las integrinas
se adhieren a la MEC y contactan entre otras, con la actina, proteína principal en la estructura
del sarcómero al igual que la miosina II, que se ensambla gracias a la talina (Rothenbusch-
Fender et al., 2017). Tanto la miosina como la talina son esenciales para definir si el músculo
es liso o estriado y por ello es un área de estudio interesante en el testículo de Drosophila, único
lugar dónde se ha descrito músculo liso en este animal.

En el análisis de los resultados obtenidos se ha observado que en todos los fenotipos mutantes
el contacto entre los derivados del disco genital y las gónadas se había producido. En algunos
cruces aparecen fenotipos mutantes con menor grado de desarrollo del habitual. Recordemos
que el fenotipo 4 es aquel en el que la morfología del testículo es la correcta pero la elongación
es incompleta. En los experimentos en los que se reduce la función de las lamininas se
encontraron porcentajes llamativos de fenotipo 4, como en el cruce de lanB con c855a-Gal4,
en el que el 70,59% (Figura 12) de los individuos habían tenido un desarrollo incompleto. No
hay uniformidad en los resultados de las lamininas, pero la media del porcentaje en lamA y lanB
de fenotipo 4 es de 42,14% (Figura 12) lo que puede hacer indicar que las lamininas son
importantes en el desarrollo completo de los testículos pero no en su desarrollo inicial en las
primeras fases. Estos resultados se sostienen mejor con el estudio de falta de función de rhea,
que evita la unión de las lamininas con las integrinas en fases tempranas y en los resultados se
comprueba que el desarrollo de los testículo es completo (wild type) o considerablemente
avanzado (Figura 12).

En trabajos previos sobre metaloproteinasas en Drosophila se ha observado que la ausencia de

estas proteínas conduce a una falta de organización tisular en la genitalia interna y a unas
gónadas de tamaño reducido (Pearson et al., 2016). En este trabajo, estudiamos la ausencia de
función de las metaloproteinasas en la región de unión disco-testículo mediante ARNs de
interferencia dirigidos por las líneas Gal4 que se expresan en las células musculares del epitelio
terminal, vas deferens y a lo largo del testículo. Entre los resultados predominan los fenotipos
salvajes tanto en los cruces con 1151-Gal4 como con mef2-Gal4 (Figura 9), indicando que muy
probablemente las metaloproteinasas no son requeridas en la estirpe derivada del músculo, al
menos desde la fase de Larva 3, en la que hacemos el cambio de temperatura; esto concuerda
con las expresiones de mmp1 (Figura 6.5) y mmp2, que muestran niveles muy bajos o no
detectables en las células musculares del testículo (Figura 8). Sin embargo, al pasar los cruces
a 29º en etapas anteriores (embrión, E), eliminamos o reducimos la función de las
metaloproteinasas desde una etapa previa al estadio larvario (L3). Se observa un aumento del
fenotipo “en maza” en los cruces con las líneas mef2-Gal4, pasando de 0% a 4% (Figura 9).
También, un incremento en el porcentaje del fenotipo 4 con 1151, aumentando del 24% a
36,67% (Figura 9). Estos patrones se repiten con las metaloproteinasas tipo 2, donde se registra
un crecimiento del fenotipo 4 tanto con mef2-Gal4, incrementando de 2,95% a 3,85% (Figura
9), como con 1151 pasando de 8,33% a 17,02% (Figura 9), resultado de ese adelanto en el
cambio de temperatura en la fase embrionaria. Esto indica que las metaloproteinasas sí son
requeridas, si bien es posible que sea suficiente una mínima cantidad de ellas. A diferencia de
las lamininas, que parecen ser necesarias en etapas más avanzadas, estos resultados indicarían
que, en contraste, las metaloproteinasas podrían tener un requerimiento temprano en el
desarrollo del testículo.

La sobreexpresión ectópica de Timp con las líneas 1151-Gal4, mef2-Gal4, Mj12a-Gal4 y c855a-
Gal4 evitaría la acción de ambas metaloproteinasas y se observaron resultados llamativos a la
luz de los anteriores. En el cruce con mef2-Gal4, aparece un 18,75% (Figura 10) de la población
con fenotipo “en maza” de los testículos. En esta condición genética se comprueba que la unión
disco-testículo no está afectada, sin embargo el testículo no elonga ni espiraliza adecuadamente,
fenómeno que se relaciona con una limitación en la migración muscular.

Hay una disparidad de fenotipos entre la inhibición de una de las metaloproteinasas únicamente
o de las dos, observando las Figura 9 y Figura 10 se comprueba que incrementa el porcentaje
de aparición del fenotipo 4. Por ejemplo, en el caso de mmp1-ARNi los porcentajes pasan de
8,70% (mef2) y 24% (1151) (Figura 9) a 59,38% y 44,12% respectivamente (Figura 10). Este
hecho podría deberse a un rescate parcial entre estos genes. Dado que mmp1 y mmp2 son
funcionalmente similares, es posible que compensen funcionalmente la pérdida de un solo gen
en contextos en los que las dos metaloproteinasas están presentes, lo que sería suficiente para
que el testículo pueda desarrollarse. Esto concuerda con la redundancia funcional que se ha
señalado para estos dos genes ya que ambas metaloproteinasas de matriz de Drosophila tienen
formas liberadas y ancladas a la membrana, pero tienen sustratos diferentes (Jia et al., 2014;
LaFever et al., 2017).

En esta línea, cuando se inhiben las dos metaloproteinasas, la migración se detiene en un

porcentaje total de casos del 37,57% (Figura 10), dando lugar a fenotipos con un desarrollo
incompleto: 44,12% en 1151, 78,13% en mef2, 24,24% en 6990 y 41,38% en 6991 (Figura 10).

Con las integrinas ocurre un suceso similar al de las lamininas, predomina el fenotipo 5 por
encima de los demás 87,5% en 1151-ARNi, 62,5% en mef2-ARNi, 58,82% en 6991 (Figura 11)
y no aparece ningún fenotipo inferior al 4 (Figura 11). En los casos de pérdida de función de
Mys con Mys-ARNi bajo el control de 6990-Gal4 como ocurría con lamB-ARNi, hay un
porcentaje de 70,59% (Figura 11) de fenotipo 4 en los que los que el desarrollo no se ha
completado. Esto podría indicar que las integrinas son imprescindibles en los procesos iniciales
de formación en el epitelio de la genitalia interna en machos. Estos resultados se correlacionan
con estudios previos en los que se observa también un desarrollo incompleto, cuando se reducen
los niveles de integrinas en las células epiteliales del vas deferens (Wright, 1960).

Comparando los diferentes estudios previos y nuestros datos, encontramos cierta disparidad en
la evidencia de requerimientos para los diferentes elementos de la MEC en la organogénesis
testicular.

Es cierto que los genes estudiados, que codifican para las proteínas de matriz mencionadas en
el trabajo, se expresan en los testículos, como se ha comentado en las tinciones realizadas en la
sección de resultados. Sin embargo, no es posible concluir con certeza la importancia relativa
de cada una de estas proteínas en el proceso, salvo para los casos citados.
Así, de los datos obtenidos en el trabajo podríamos deducir que ninguna de ellas parece
absolutamente indispensable para el contacto entre el testículo y los derivados del disco, y de
igual forma el desarrollo general y la elongación del testículo no parecen verse gravemente
afectados en los distintos contextos mutantes salvo para el caso de las metaloproteinasas, en el
que se evidencia que para que el desarrollo completo del testículo se dé con éxito, su
participación es indispensable.

Sin embargo, la falta de fenotipos más penetrantes y expresivos pueden deberse a otros factores
accesorios a los requerimientos funcionales de los genes:

a) Redundancia funcional. Si bien el genoma de Drosophila, más compacto que el humano,

cuenta con un número de genes notablemente inferior para cada función, ruta metabólica
o vía de señalización concreta, encontramos también casos en los que varios genes
contribuyen conjuntamente a determinada función, por un mecanismo de redundancia.
Es el caso que hemos citado de las dos metaloproteinasas, en el que la ausencia de una
de ellas puede ser reemplazada por la presencia de la otra.

b) Condición mutante. Todas las condiciones utilizadas se basan en el sistema Gal4- UAS,
sobreexpresando bien genes o bien líneas interferentes; este sistema es muy versátil y
que permite afectar específicamente a los tejidos de interés, pero también tiene sus
inconvenientes, ya que no podemos estar seguros de que la sobreexpresión de una línea
RNAi sea equivalente a una pérdida completa de la función del gen. Técnicamente, esa
condición será siempre un hipomorfo más o menos fuerte, lo que dependerá de la fuerza
de expresión relativa tanto del propio UAS como, sobre todo, de las líneas de expresión
Gal4.

c) Falta de concordancia entre el patrón de expresión del gen de interés y el de la línea Gal
que usamos para dirigir la pérdida (o ganancia) de función. Este era el caso de rhea
(Figura 6.2) y mmp2, que no mostraban la señal en el vas deferens que sí mostraban las
líneas 1151-Gal4, 6990-Gal4 y 6991-Gal4 (Figura 8). Los reporteros de las
metaloproteinasas mmp1-GFP y mmp2-GFP no presentaban señal de expresión en el
testículo, salvo en la región del epitelio terminal (Figura 6.5), mientras que en las líneas
1151-Gal4, mef2-Gal4 y 6991-Gal4 sí se detectaba expresión (Figura 8).
Resulta evidente que las proteínas de la MEC participan de alguna manera en el proceso de
formación del testículo; así lo demuestran los porcentajes de fenotipos no salvajes encontrados
y este hallazgo sugiere un campo de investigación de gran interés en proyectos futuros.

Al revisar los diseños experimentales de este trabajo, se considera la posibilidad de ampliar los
resultados modificando la etapa del desarrollo a la que se inactiva el sistema Gal80ts con todas
las proteínas, al igual que se ha hecho con las metaloproteinasas. Esta modificación permitiría
obtener un mayor rango de estudio y comprender mejor el impacto de la MEC en diferentes
momentos del desarrollo. Para complementar los resultados obtenidos, sería recomendable
ampliar el número de genes estudiados dado que la MEC es un entramado estructural de
proteínas que interactúan entre sí, explorar estos genes daría una visión más detallada.

Finalmente, un estudio en profundidad de estos genes requerirá el empleo de otras líneas Gal
que complementen su mapa funcional (por ejemplo, líneas Gal4 dirigidas por los genes Hox
AbdB y abdA), así como el empleo de otras condiciones mutantes, no necesariamente basadas
en la tecnología de ARN de interferencia. Sería adecuado monitorizar los niveles de expresión
de los genes de interés en los tejidos estudiados para cada una de esas condiciones mutantes, y
su correlación con los fenotipos que observamos.

En conclusión, el trabajo ha contribuido a ampliar el conocimiento y la comprensión acerca de

la importancia de las proteínas de la MEC en los procesos de migración y morfología celular
durante la organogénesis testicular en machos adultos de Drosophila, abriendo al mismo tiempo
nuevas oportunidades para proyectos futuros que permitan profundizar en este área y explorar
nuevas perspectivas.
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