PRACTICO N°1:

ESPECTROFOTOMETRÍA

Integrantes:
- Gabriel Mazo
- Felipe Cárdenas
Curso: Bioquímica CS1008C
Grupo: 1
Sección: 1
Introducción

La espectrofotometría es una de las técnicas analíticas experimentales más usadas para la

determinación de la concentración de un compuesto x en una solución, se basa en la
capacidad de absorber las radiaciones electromagnéticas que poseen las moléculas (Diaz et
al., 2010). Este método se caracteriza por su precisión, sensibilidad y aplicabilidad a
moléculas de distinta naturaleza, ya sean biomoléculas o contaminantes, independiente de
su estado de agregación (UPO, 2021). Para medir la espectrofotometría de una solución se
utiliza un espectrofotómetro, el cual tiene la capacidad de medir la cantidad de luz
absorbida por la solución a una determinada longitud de onda (Diaz et al., 2010).
Cuando un rayo de luz atraviesa perpendicularmente una disolución de un compuesto
químico que absorbe luz, el compuesto absorberá ciertas longitudes de onda y dejará pasar
otras, para explicar este fenómeno se utiliza la fórmula de I o = Ia + It, en la cual Io
corresponde a la luz inicial que se transmite hacia la solución, I a corresponde a las
longitudes absorbidas por esta, y por último I t se traduce como la luz restante (Diaz et al.,
2010).
Para el fenómeno anterior podemos definir 2 conceptos importantes, el de transmitancia (T)
y el de absorbancia (A), el primero de ellos nos da una medida física de la relación entre la
intensidad antes (Io) y después (It) de atravesar la solución, y es normalmente representado
en porcentajes por lo que acaba relacionado de la siguiente manera %T = (Io / It) * 100
(Diaz et al., 2010). Respecto a la absorbancia se puede decir que esta más relacionado con
la muestra, ya que, como su nombre nos indica, cuantifica la cantidad de luz absorbida por
esta y se define en base a la ecuación de A = Log 1/T = -Log T = -Log I t/ Io (Diaz et al.,
2010). Sin embargo, se puede dar el caso de que la intensidad de luz recibida y transmitida
sean iguales, en ese caso la transmitancia se dice que es del 100% por lo que la muestra no
está absorbiendo nada de luz a esa longitud de onda (Diaz et al., 2010).
La espectrofotometría se basa en 2 leyes principales, la ley de Lambert y la ley de Beer, la
primera de ellas establece que la potencia de una radiación electromagnética
monocromática que atraviesa perpendicularmente una superficie, disminuye
exponencialmente con el espesor de esta, lo que en palabras simples quiere decir que la
absorbancia está relacionada al espesor del medio atravesado, por otro lado la ley de Beer
propone que la potencia de la luz incidente disminuye exponencialmente al aumentar la
concentración, por lo que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración
(Bencomo et al., 2016).
Si combinamos la ley de Lambert y la ley de Beer obtenemos lo que se conoce como la ley
de lamber-Beer, que describe la disminución en la intensidad de la luz al atravesar una
sustancia con capacidades absorbentes, esta ley es aplicable incluso a soluciones en as que
hay más de una sustancia absorbente en el medio, teniendo en cuenta que cada sustancia
absorbente contribuye con su parte a una suma total de las absorbancias presentes en la
solución (Bencomo et al., 2016).
El anaranjado de metilo o naranja de metilo es un compuesto azoderivado, utilizado como
colorante e indicador de pH, su nombre científico es sal sódica del ácido (p-[[p-
(dimetilamino) fenil] azo] bencenosulfónico y su fórmula química C14H14N3NaO3S. El color
del anaranjado de metilo es rojo anaranjado, su zona viraje oscila entre 3,1 a 4,4. Por debajo
de 3,1 es rojo y por encima de 4,4 es amarillo anaranjado (Gil. 2019).
Entre sus características más distintivas este indicador de pH tiene un estado físico sólido y
puede disolverse en agua para formar una solución acuosa, tiene un punto de ebullición a >
de 300°C, una densidad de 1,28 g/cm3, es insoluble en alcohol y su masa molecular es de
327,34 g/mol (Gil. 2019).
Este colorante azoderivado tiene diversas aplicaciones, como por ejemplo el análisis de
sustancias químicas y farmacéuticas, especialmente en la titulación de ácidos y también
como colorante en productos textiles y tejidos biológicos (Gil. 2019).
Referente a su toxicidad, se debe evitar su contacto con la piel, mucosas, inhalación e
ingestión, ya que este tiene un efecto irritante, enrojeciendo la zona afectada. Según la
NFPA esta sustancia fue clasificada con un riesgo de salud 2, inflamabilidad 1, reactividad
0 y no hay ningún riesgo de esta en la naturaleza (Gil. 2019).
Un procedimiento analítico utilizado en análisis cuantitativo es la calibración, que conlleva
la construcción de una curva de calibración, la cual es una representación gráfica de una
propiedad cuantitativa en función de otra, generalmente la concentración del analito
(Fajardo et al., 2018).
La calibración tiene como objetivo seleccionar unos parámetros que permitan obtener una
linealidad en la curva, respecto a las 2 propiedades en estudio del analito, con el fin de
obtener resultados que sean directamente proporcionales a la concentración de dicho
compuesto en una muestra, en intervalos de tiempo determinado (Fajardo et al., 2018).
.
Objetivos

 Adquirir la habilidad de interpretar un espectro de absorción.

 Adquirir la habilidad para construir una curva de calibración.
 Adquirir la habilidad para calcular la concentración de una muestra problema, a
partir de la construcción de la curva de calibración.
Resultados

Preparación de solución stock de Anaranjado de metilo (A.M.)

A. Datos teóricos
a.- Concentración de solución stock de A.M: 0.1 mg/ml
10 mg% ≈ 0,1 mg/ml
10 mg  100 ml
X = 0,1 mg/ml
X  1 ml

b.- Parte-I Concentración de solución diluida de

er
1 dilución: 0,005 mg/ml A.M: 5 ml
0,005 mg  100 ml X = 0,5 mg%
X  1 ml

10 mg  100 ml
X = 5 ml de la solución patrón
0,5 mg  X

c.- Parte-II Concentración de solución diluida de A.M: 10 ml

Para la curva de calibración. (cálculos)

X = 0,02 mg 0,02 mg  100 ml

X = 0,2 mg%
X  100 ml

2) 1 mg  100 ml 0,04 mg  100 ml X = 0,4 mg%

X = 0,04 mg
X  4,0 ml X  100 ml

3) 1 mg  100 ml 0,06 mg  100 ml X = 0,6 mg%

X = 0,06 mg
X  6,0 ml X  100 ml
 5) 1 mg  100 ml 0,10 mg  100 ml
X = 0,10 mg X = 1,0 mg%
X  10,0 ml X  100 ml

I.- PARTE: Espectro de absorción del Anaranjado de Metilo

A.- TABLA DE DATOS EXPERIMENTALES
Tabla 1: Transmitancia (T%) y Absorbancia (A) de la solución patrón anaranjado de metilo

longitud de onda Transmitancia Absorbancia

(λ) (%T) (A)
400 63,24 0,199
420 54,08 0,267
440 47,97 0,319
460 44,06 0,356
480 46,45 0,333
500 57,94 0,237
520 75,86 0,120
540 90,78 0,042
560 96,83 0,014
580 98,63 0,006
600 99,31 0,003

Para los cálculos de transmitancia se utilizó la siguiente formula en el Excel:

T% = (1/10A) × 100
1) 1 mg  100 ml
1) 400 nm: (1/100,199) × 100 =63,24%
X  2,0 ml
2) 440 nm: (1/100,319) × 100 =47,97%
3) 460 nm: (1/100,356) × 100 =44,06%
4) 480 nm: (1/100,333) × 100 =46,45%
5) 500 nm: (1/100,237) × 100 =57,94%
6) 520 nm: (1/100,120) × 100 =75,86%
7) 540 nm: (1/100,042) × 100 =90,78%
8) 560 nm: (1/100,014) × 100 =96,83%
9) 580 nm: (1/100,006) × 100 =98,63%
10) 600 nm: (1/100,003) × 100 =99,31%

4) 1 mg  100 ml 0,08 mg  100 ml

X = 0,08 mg X = 0,8 mg%
X  8,0 ml X  100 ml
 B.- CON LOS DATOS EXPERIMENTALES, GRAFIQUE
0.400 D.O. (A) v/s
0.350
longitud de onda (λ).

0.300
Absorbancia (A)

0.250

0.200

0.150

0.100

0.050

0.000
400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600
Longitud de onda (nm)

Figura 1: Grafico de absorbancia v/s Longitud de onda (nm)

100.00

90.00 %T v/s longitud de

80.00
onda (λ)

70.00
Transmitancia (%T)

60.00

50.00

40.00

30.00

20.00

10.00

0.00
400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600
Longitud de onda (nm)

Figura 2: Grafico de transmitancia (T%) v/s Longitud de onda (nm)

C.- DE ACUERDO CON EL ESPECTROGRAMA COMPLETE:
 Absorbancia máxima: 0,356 A
 Transmitancia mínima: 44,06%
 Longitud de onda de trabajo: 460 (nm)
II.- PARTE: Curva de calibración
A.- TABLA DE DATOS EXPERIMENTALES
Tabla 2: % Transmitancia, Absorbancia (D.O.) y Concentración (mg%) de 5 disoluciones a una longitud de
onda de 460 nm

Tubo N° % Transmitancia Absorbancia (D.O.) Concentración (mg%)

1 54.95 0.130 0,2
2 46.67 0.331 0,4
3 32.21 0.492 0,6
4 23.07 0.637 0,8
5 17.46 0.758 1,0
Para los cálculos de transmitancia y concentración se utilizaron las siguientes formulas

T% = (1/10A) × 100 Y = mx + n
Tubo 1: (1/100,130) × 100 = 54.95%

Tubo 2: (1/100,331) × 100 = 46.67%

Tubo 3: (1/100,492) × 100 = 32.21%

Tubo 4: (1/100,637) × 100 = 23.07%

Tubo 5: (1/100,758) × 100 = 17.46%

Incluir todos los cálculos, de transmitancia y concentración.

 0.8
f(x) = 0.781 x + 0.000999999999999945
0.7 R² = 0.990851098046924

0.6
Absorbancia (A)

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1
Concentración (mg%)

Figura 3: Grafico curva de calibración de Absorbancia (A) v/s Concentración (mg%)

IV.- Parte: Muestra problema

a) N° de muestra: 4
b) % de transmitancia: 57,68
c) Absorbancia (D.O.): 0,239
d) Concentración de la solución problema de Anaranjado de Metilo: 0,304 mg%

Para el cálculo de la concentración de la muestra problema se utilizó la fórmula

de:
Y= mx + n
Basados en los valores de la grafico 3 donde Y es la absorbancia y X es la
concentración, lo que resulta en:
0,239 = 0,781x + 0,001
0,238 = 0,781x
0,238/0,781 = x
0,304 = x

Respecto al porcentaje de transmitancia se utilizo la formula descrita

anteriormente como:
T% = (1/10A) × 100

De modo que
(1/100,239) × 100 = 57,68 %
Discusión
En este experimento, los resultados de los análisis espectrofotómetros aplicados a nuestras
diferentes soluciones, así como la formación de gráficos y tablas en base a los datos
teóricos y obtenidos. Fueron usados para poder determinar el espectro de absorción del
Anaranjado de metilo (Solución patrón 10 mg%) y posteriormente construir una curva de
calibración
Teniendo como primera tabla, la Transmitancia (T%) y Absorbancia (A) de la solución
patrón anaranjado de metilo a diferentes longitudes de onda (Tabla 1), en donde se puedo
determinar la longitud de onda de trabajo (460 nm), la Absorbancia máxima (0,356 A) y
Transmitancia mínima (44,06%), a su vez se hizo la representación gráfica de los datos
experimentales de D.O. (A) vs longitud de onda y %T vs longitud de onda. Esto se asemeja
bastante al experimento realizado por Angelica María Caez (2005) en donde también hace
uso de un espectrofotómetro y utiliza anaranjado de metilo, dando como resultado una
mayor absorbancia a los 460 nm, lo cual coincide con nuestros resultados, por otro lado, las
diferencias más notables respecto a esta misma se deben a su concentración, pues la
solución utilizada en nuestro experimento se diluyo en agua destilada mientras que en el
experimento de Angelica (2005) se utilizaron otras condiciones, sin embargo, la tendencia
referente a la disminución en la absorbancia se mantiene al alejarse de los 460 nm.
Luego teniendo como longitud de onda trabajo (460 nm) se hizo una segunda tabla (Tabla
2) con los mismos procedimientos anteriores, con la diferencia de que se agregó la
concentración (mg%) de las cinco disoluciones preparadas obtenidas mediante una
ecuación y con los datos experimentales de la absorbancia (A) y concentración (mg%) se
construyó una curva de calibración, donde la curva de la línea de tendencia es totalmente
representativa con los comportamientos de los datos dado que su R 2 es 0,9909. Esta
curvatura se parece bastante a la realizada por Saguma & Vidal (2012) donde utilizaron la
absorbancia (A) y Concentración (mg%) para poder graficar la curva de calibración, con la
diferencia de que su longitud de onda trabajo es de 466 nm, lo cual es bastante cercana a la
utilizada en nuestro experimento, a su vez la curva de línea de tendencia es totalmente
representativa con los comportamientos de los datos dado que su R2 es 1
Conclusión

A partir de los resultados obtenidos se puede concluir que el anaranjado de metilo posee
una mayor absorbancia al ser expuesto a una luz cuya longitud de onda es de 460 nm, por
otro lado, es importante mencionar que la espectrofotometría es método que permite
determinar tanto la absorbancia y la transmitancia, lo que a su vez posibilita el sacar la
concentración de una muestra con facilidad si nos basamos en los principios de las leyes de
Lambert y de Beer, además de que, si nos referimos a la solución, mientras mayor sea la luz
que esta absorbe (absorbancia), menor es la luz que pasa a través de esta (transmitancia).
Bibliografía

 Bencomo, S., Villazana, S., & Salas, B. (2016). Diseño y construcción de un

oxímetro de pulso. Revista Ingeniería UC, 23(2), 162-171.
 Cáez Pérez, A. M. (2005). Decoloración del anaranjado de metilo a través de un
proceso de fotocatálisis con clorofila activada.
 Díaz, N. A., Ruiz, J. A. B., Reyes, E. F., Cejudo, A. G., Novo, J. J., Peinado, J.
P., ... & Fiñana, I. T. (2010). Espectrofometría: Espectros de absorción y
cuantificación colorimétrica de biomoléculas. Universidad de Córdoba, 1-8.
 Fajardo, J. J., Caicedo, R., & Pinilla, J. P. (2018). CURVA DE CALIBRACIÓN.
 Gil, Marielsa. (20 de mayo de 2019). Naranja de metilo: características, síntesis y
aplicaciones. Lifeder. Recuperado el 10 de Septiembre de 2022 de Naranja de
metilo: características, síntesis y aplicaciones (lifeder.com)
 Saguma Moreno, T. M., & Vidal Urquiza, W. H. (2012). Degradación de
anaranjado de metilo con radiación solar en presencia de zno.
 Universidad Pablo de Olavide Sevilla (18 de marzo de2021). UPO. Practica 4.
Espectrofotometría. Recuperado el 10 de Septiembre de 2022 de Microsoft Word -
FUNDAMENTOS_QUIMICA_P4.doc (upo.es)