Cátedra de química clinica

Universidad de Ciencias Medicas

23 de Agosto del 2017
Laboratorio 1
Espectrofotometría
(Andrés Vargas Quesada)

Resumen

La espectrofotometría hace referencia a una manera práctica y precisa de

conocer la concentración de una solución, las concentraciones obtenidas por
medio del método de espectrofotometría, son determinadas por la elaboración
del espectro de absorción, una curva de calibración a 640 nm y por último la
cuantificación de azul de metileno.

En la curva de calibración los patrones fueron de 25, 50, 100, 150 y 200
mg/dL, del analito presenta una alta similitud con el valor del patrón, con un
porcentaje de que ronda entre 0,04-0,2%, lo cual evidencia la buena técnica
analítica, con el objetivo de cuantificar en una muestra la concentración
incógnita de azul de metileno.

Introducción

La espectrofotometría hace referencia a una manera práctica y precisa de

conocer la concentración de una solución, basado en medir el efecto que tiene
una concentración sobre la intensidad de un haz de luz luminoso que incide
sobre ella (Facultad de Farmacia y Bioquímica. (2017)).

Al medir soluciones con el analito cuya concentración se desea conocer, esta es

irradiada con luz monocromática, parte de esta intensidad de luz será
absorbida por las moléculas que están en dicha solución, otra parte se reflejará
y por último otra parte será transmitida (Facultad de Farmacia y Bioquímica,
2017).

Dependiendo de la muestra a analizar se debe de elegir una longitud de onda a

la cual la sustancia en estudio absorba considerablemente la luz incidente, en
otras palabras, donde la sustancia presente el pico más alto de absorbancia, de
esta manera, aunque el analito se encuentre en bajas concentraciones
lograremos obtener valores de absorbancia diferentes a cero (Facultad de
Farmacia y Bioquímica. (2017)).

El espectro de absorción es una gráfica de absorbancia con respecto a la

longitud de onda, este tipo de gráficas son características para una molécula
determinada y en ocasiones como auxiliares en la identificación o confirmación
de la identidad de especies particulares, el color de una disolución está
relacionada con su espectro de absorción (Skoog, D., West, D., James, F. y
Stanley, C. (2015)).

Al elegir una longitud de onda de trabajo en el cual la sustancia tenga un

máximo de absorbancia confiere mayor sensibilidad en las lecturas, un límite
de detección más bajo y un menor error en las mediciones (Facultad de
Farmacia y Bioquímica. (2017)).

Al realizar una curva de calibración se basa en la existencia de una relación

proporcional entre dicha concentración y la absorbancia dada por el equipo de
espectrofotometría, esta curva se obtiene por la preparación de patrones a
diferentes concentraciones, sucesivamente se mide la señal analítica
proporcionada por los mismo (en este caso absorbancia), al mismo tiempo
gracias a la ley de Beer se obtiene una relación entre absorbancia y
concentración (Departamento de química analítica. (2016)) (Skoog, D. et al
(2015)).

Toda concentración obtenida por esta metodología está ligada a un porcentaje

de error, que relaciona el valor teórico con el experimental obtenido en la
práctica, con el fin de indicar la calidad de una medida (Skoog, D. et al 2015).

El objetivo principal es determinar la concentración de azul de metileno de una

muestra incógnita marcada con el numero 75, y su respectivo porcentaje de
error, posterior a la confección del espectro de absorción y de la curva de
calibración.

Metodología

Primero se preparó un espectro de absorción con un rango de longitud de onda

de 450-750 nm a partir de un patrón de azul de metileno de 100 mg/dL,
realizando mediciones cada 10 nm para obtener sus respectivas absorbancias,
posteriormente se grafica la longitud de onda en el eje de las X y absorbancia
en el eje de las Y, con el fin de determinar el pico de mayor absorción del
analito (Facultad de Farmacia y Bioquímica. (2017)).

Posteriormente se procedió a realizar una curva de calibración a partir de

patrones de concentración conocida de azul de metileno preparados con sus
respectivos factores de dilución, se usaron valores de 25, 50, 100, 150, 200
mg/dL, sus respectivas absorbancias se midieron a una longitud de onda
determinada y posteriormente se graficó la concentración en el eje de las X y
la absorbancia en el eje de las Y.
Seguidamente se obtuvieron las concentraciones correspondientes a cada
absorbancia de los patrones por medio de cálculos respectivos con la Ley de
Beer, posteriormente este resultado es analizado para evaluar la calidad de
este por medio del porcentaje de error (Skoog, D. et al 2015).

Al finalizar se analizó de igual manera una muestra incógnita rotulada como

75, se midió su absorbancia en el espectrofotómetro y se calculó su
concentración para realizar su debido reporte.

Resultados

El espectro de absorción se realizó con un rango de longitud de onda de 450-

750 nm, ejecutando una medición de absorbancia cada 10 nm, con estos datos
obtenemos el pico máximo de absorción que equivale a 650 nm que podemos
observar en la figura 1.

0.900

0.800

0.700

0.600
Absorbancia

0.500

0.400

0.300

0.200

0.100

0.000
400 450 500 550 600 650 700 750 800
Longitud de onda
Figura 1. Espectro de absorcion del azul de metileno.

Se procede a realizar una curva de calibración con cuatro patrones a diferentes

concentraciones de 25, 50, 150, 200 mg/dL, preparados con sus respectivas
diluciones de un patrón madre, cada uno fue medido para obtener la
absorbancia correspondiente y posteriormente graficar concentración contra
absorbancia, obteniendo la ecuación de la recata (y = 0,0038x - 4E-16) y un
respectivo R2=1, que se puede observar en la figura 3.
 0.900
0.800 y = 0.0038x
R² = 1 Series1
Absorbancia 0.700
0.600
0.500
0.400 Linear
(Series1
0.300
)
0.200
0.100
0.000
0 50 100 150 200 250
Concentración

Figura 1. Curva de calibracion de azul de metileno

Posteriormente se realizó el porcentaje de error a cada uno de los patrones

para evaluar la calidad de la medición, que relaciona el valor teórico con el
experimental, como podemos observar en el cuadro 1 (Skoog, D. et al 2015).

Cuadro 1. Porcentaje de error relacionado con cada patrón de la curva de

calibración.

Concentración Porcentaje de
(Teórica) error
25 0,2 %
50 0,04 %
100 0,2 %
150 0,2 %
200 0,2 %

Al final se realizó la determinación de la concentración de una muestra

incógnita por espectrofotometría de azul de metileno rotulada como 75, con un
equivalente a 177 mg/dL, no se pudo determinar el porcentaje de error debido
a que se desconoce el valor teórico.
Discusión

Las concentraciones obtenidas por medio del método de espectrofotometría,

son determinadas por la elaboración del espectro de absorción, una curva de
calibración y por último la cuantificación de azul de metileno.

En el espectro de absorción para este analito al ser una sustancia coloreada de

azul presenta rango de longitud de onda máxima absorbida según la literatura
de 620-700 nm y según estudios se confirma al obtener picos de 663-665 nm,
podemos observar que nuestro resultado se encuentra dentro de estos valores
(ver figura 1) y por lo tanto en este caso tendremos una buena sensibilidad, un
límite de detección más bajo y un menor error en las mediciones (Liu, J., Li, E.,
You, X., Hu, C. y Huang, Q. (2016)) (Moreno, A., Figueroa, D. y Hormaza, A.
(2017)). (Facultad de Farmacia y Bioquímica. (2017)) (McPherson, R. y Pincus,
M. (2017)).

En cuanto a la curva de calibración los patrones fueron de 25, 50, 100, 150 y
200 mg/dL, al analizarlos en un espectro de absorción de 640 nm que
representa el pico máximo de absorción para el analito, la ecuación de la recta
presenta un R2 muy cercano a uno, por lo tanto de evidencia la buena precisión
y exactitud al realizar el procedimiento, la concentración de azul de metileno
presenta una alta similitud entre el valor del patrón y el valor obtenido
experimentalmente (ver figura 2.) por lo que los porcentajes de error presenta
un valor bastante pequeño que ronda entre 0,04-0,02% lo cual se interpreta
como una buena técnica al realizar el análisis de cuantificación de azul de
metileno.

Referencias

Facultad de Farmacia y Bioquímica. (2017). Espectrofotometría. Fundamento

de la espectrofotometría. Universidad de Buenos Aires.

Facultad de Farmacia y Bioquímica. (2017). Espectrofotometría. Elección de

longitud de onda óptima de trabajo. Universidad de Buenos Aires.

Skoog, D., West, D., James, F. y Stanley, C. (2015). Propiedades de la

radiación electromagnética. Fundamentos de química analítica. 9th ed. México:
Abril Vega Orozco.

Skoog, D., West, D., James, F. y Stanley, C. (2015). Errores en el análisis

químico. Fundamentos de química analítica. 9th ed. México: Abril Vega Orozco.
Departamento de química analítica. (2016). Calibración. Universidad de
Valencia.

Liu, J., Li, E., You, X., Hu, C. y Huang, Q. (2016). Adsorption of methylene
blue on an agro-waste oiltea shell with and without fungal treatment. Scientific
Reports.

Moreno, A., Figueroa, D. y Hormaza, A. (2017). Adsorción de azul de metileno

sobre cascarilla de arroz. Producción+Limpia. Vol. 7(9).

McPherson, R. y Pincus, M. (2017). Analysis: Principles of instrumentation.

Henry´s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 25th ed.
St. Louis, Missouri: ELSEVIER.