PRÁCTICA 1

DETERMINACIÓN DE
AZUCARES REDUCTORES
Y PROTEÍNAS
SALUDABLES.

UEA: LABORATORIO INTEGRAL DE INGENIERIA BIOQUIMICA

PROFESORA: FLOR DE MARÍA CUERVO LÓPEZ

EQUIPO 1

 CAMPOS MARTINEZ KAREN YAEL

 MALVAEZ AGUILAR ALEXIS JESUS
 MORALES BAUTISTA XOCHITL KETZALY
 VENCES HERNÁNDEZ JESSICA ALEJANDRA
PRÁCTICA 1. “DETERMINACIÓN DE AZUCARES REDUCTORES Y
PROTEÍNAS SALUDABLES”
INTRODUCCIÓN.
“Un procedimiento analítico muy utilizado en análisis cuantitativo es el llamado de
calibración que implica la construcción de una “curva de calibración”. Una curva de
calibración es la representación gráfica de una señal que se mide en función de
la concentración de un analito. La calibración incluye la selección de un modelo
para estimar los parámetros que permitan determinar la linealidad de esa curva.
y, en consecuencia, la capacidad de un método analítico para obtener resultados
que sean directamente proporcionales a la concentración de un compuesto en
una muestra, dentro de un determinado intervalo de trabajo” (Dosal, 2008).

Así mismo, determinar la concentración de proteínas y/o azúcares en una muestra

biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de
purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad
específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades,
así como para otros muchos propósitos.

“Uno de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la

espectroscopía, en general, y la espectroscopía ultravioleta-visible, en particular.
Se pueden identificar y cuantificar biomoléculas en solución y en muestras
biológicas, con el empleo de reactivos específicos que reaccionan con el
compuesto a analizar y forman un producto coloreado que permite detectarlo en
muestras complejas. La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica
que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en
que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la
cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración, de
acuerdo con la ley de Lambert-Beer. Para hacer este tipo de medidas se emplea
un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz
que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma”
(Díaz & Barcenas, 2008).
Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas y azúcares. Muchos
de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca para absorber luz, que
puede ser medida con ayuda de un espectrofotómetro, b) para la formación de
derivados químicos, o c) la capacidad que tienen de unirse ciertos colorantes.

La determinación de proteínas puede llevarse a cabo mediante diferentes

métodos, siendo, de acuerdo con Stoschek (1990), el ensayo de Bradford uno de
los más sencillos, rápidos y bastante exactos para muestras que van de 1μg a
20μg.

“La cuantificación de azúcares puede ser resuelta utilizando el ensayo con ácido
3,5-dinitrosalicílico, el cual reacciona con aquellos azúcares que son reductores
(poseen su grupo carbonilo intacto, y que a través de este pueden reaccionar
como reductores con otras moléculas). El producto formado de esta reacción
absorbe fuertemente la longitud de onda de 540 nm y por tanto las muestras
pueden ser leídas en un espectrofotómetro” (Bedford, 2000).

En el procedimiento de construcción de la curva de calibración se compara una

propiedad del analito con la de estándares de concentración conocida del mismo
analito (o de algún otro con propiedades muy similares a éste). La etapa de
calibración analítica se realiza mediante un modelo de línea recta que consiste en
encontrar la recta de calibrado que mejor ajuste a una serie de “n” puntos
experimentales. La recta de calibrado se encuentra definida por una ordenada al
origen (b) y una pendiente (m), mediante la ecuación y = mx + b, donde “y”
representa la respuesta provocada por un cambio de la concentración de analito
“x”.
OBJETIVOS.

 Que el alumno conozca la técnica para la determinación cuantitativa de

azúcares reductores y proteína soluble por método colorimétrico y lo
aplique para conocer la concentración de cada una de ellas en una
muestra.
METODOLOGÍA.
RESULTADOS.
Azucares Reductores.

Tubo Concentraci Absorbanc Absorbanc Absorbanc Absorbanc

ón (mg/L) ia 1 ia 2 ia 3 ia
Promedio
1 0 0 0 0 0
Blanc
o)
2 100 0.007 0.004 0.003 0.00467
3 200 0.044 0.023 0.028 0.03167
4 300 0.073 0.081 0.067 0.07367
5 400 0.125 0.127 0.171 0.14100
6 500 0.131 0.141 0.260 0.17733
7 600 0.143 0.228 0.272 0.21433
8 700 0.182 0.333 0.383 0.29933
9 800 0.261 0.380 0.337 0.32600
10 900 0.434 0.516 0.517 0.48900
11 1000 0.572 0.399 0.376 0.44900
TABLA 1. Concentración y Absorbancias del triplicado de la curva del patron para azucares
reductores.Valores de absorbancia obtenidos a diferentes concentraciones de glucosa cada
uno.
 Absorbancia 1
0.7
0.6

Absorbancia a 575 nm
0.5
0.4 f(x) = 0.000650833333333333 x − 0.182916666666667
R² = 0.831065663640577
0.3
0.2
0.1
0
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

Concentracion (mg/L)

GRAFICA 1.1 Curva de calibración de la primera repetición.Se observan los valores de la

absorbancia obtenida de la primera repetición a 575nm contra las diferentes
concentraciones de glucosa de la tabla 1, para asi obtener R^2=0.8311.

Absorbancia 2
0.6
Absorbancia a 575 nm

0.5
0.4 f(x) = 0.000519909090909091 x − 0.0570454545454545
R² = 0.920679147705745
0.3
0.2
0.1
0
0 200 400 600 800 1000 1200
Concentracion (mg/L)

GRAFICA 1.2. Curva de calibración de la segunda repetición.Se observan los valores de la

absorbancia obtenida de la segunda repetición a 575nm contra las diferentes
concentraciones de glucosa de la tabla 1, para asi obtener R^2=0.9207
 Absorbancia 3
0.6

Absorbancia a 575 nm
0.5
0.4 f(x) = 0.000508727272727273 x − 0.0349090909090909
R² = 0.902993424903703
0.3
0.2
0.1
0
0 200 400 600 800 1000 1200

Concentracion (mg/L)

GRAFICA 1.3. Curva de calibración de la tercera repetición.Se observan los valores de la

absorbancia obtenida de la tercera repetición a 575nm contra las diferentes concentraciones
de glucosa de la tabla 1,para asi obtener R^2=0.903.

Absorbancia Promedio
0.60000

0.50000
Absorbancia a 575 nm

f(x) = 0.000543878787878788 x − 0.0785333333333334

0.40000
R² = 0.962019402879239
0.30000

0.20000

0.10000

0.00000
0 200 400 600 800 1000 1200

Concentracion (mg/L)

GRAFICA 1.4. Curva de calibración del absorbancia promedio.Se observan los valores de la
absorbancia promedio obtenida de las tres repeticiónes a 575nm contra las diferentes
concentraciones de glucosa de la tabla 1, para asi obtener nuestro R^2 promedio =0.962.

CALCULOS PARA LA CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA LECHE ALPURA PARA

AZUCARES REDUCTORES.
Para nuestra dilución tenemos la siguiente formula:
(V ¿¿ 1) ( C 1 )=(V ¿¿ 2) ( C 2 ) ¿ ¿

Con los valores qué tenemos debemos despejar el V1 qué sera el volumen de la
muestra de leche alpura
Datos:
48 g/L Azucares =48000 mg/L
(V ¿ ¿ 2) ( C 2)
V 1= ¿
C1

Al sustituir nuestra formula obtenemos lo siguiente:

(0.1 L) ( 500 mg/ml )
V 1= =0.001 L=1 ml
48000 mg/ml

Muestra de Leche Concentración (mg Absorbancias

Alpura /L)
Blanco 0 0
1 500 1.293
2 500 1.365
3 500 1.307
TABLA 1.1. Concentración y Absorbancias de la muestra de la Leche Alpura para azucares
reductores.Valores de absorbancia obtenidos a una concentracion de 500 mg/L de glucosa.

Absorbancias de las Muestras

1.6
Absorbancia a 575 nm

1.4
1.2 f(x) = 0.00264333333333333 x
1 R² = 0.997780175563894
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 100 200 300 400 500 600

Concentración (mg/L)
 GRAFICA 1.5. Curva de calibración de la muestra elegida.Se observan los valores de la
absorbancia obtenida de la muestra a 575nm contra la concentración de 500 mg/L de
glucosa de la tabla 1.1,para asi obtener R^2=0.9978

Proteína Soluble.

Tubo Concentraci Absorbanc Absorbanc Absorbanc Absorbanc

ón (mg/L) ia 1 ia 2 ia 3 ia
Promedio
1 0 0 0 0 0
Blanc
o)
2 2 0.192 0.125 0.105 0.1407
3 4 0,188 0.114 0.205 0.1690
4 6 0.219 0.205 0.164 0.1960
5 8 0.221 0.047 0.110 0.1260
6 10 0.096 0.048 0.063 0.0690
7 12 0.166 0.147 0.120 0.1443
8 14 0.059 0.132 0.116 0.1023
9 16 0.147 0.177 0.176 0.1667
10 18 0.172 0.170 0.169 0.1703
11 20 0.256 0.223 0.165 0.2147
TABLA 2. Concentración y Absorbancias del triplicado de la curva del patron para proteinas
solubles.Valores de absorbancia obtenidos a diferentes concentraciones de abulmina de
huevo cada uno.

Absorbancia 1
0.3

0.25
Absorbancia a 595 nm

0.2

0.15 f(x) = 0.000357142857142857 x + 0.162357142857143

R² = 0.000698636262016605
0.1

0.05

0
4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Concentración (mg/L)
 GRAFICA 2.1. Curva de Calibración DO1.Se muestra un grafico de dispercion para cada par
de datos entre la concentración de albumina de huevo contra la DO1 a 595nm de la tabla 2,
para calcular la curva de calibración y se obtuvo su correspondiente coeficiente R^2=0.0007.

Chart Title
0.25
Absorbancia a 595 nm

0.2
f(x) = 0.00651363636363636 x + 0.0611363636363637
0.15 R² = 0.382870753626431

0.1

0.05

0
0 5 10 15 20 25

Concentración (mg/L)

GRAFICA 2.2. Curva de Calibración DO2. Se muestra un gráfico de dispersión para

cada par de datos entre la concentración de albumina de huevo contra la DO2 de la
tabla 2, para calcular la curva de calibración y se obtuvo su correspondiente
coeficiente R^2=0.3829

Absorbancia 3
0.25
Absorbancia a 595 nm

0.2

0.15 f(x) = 0.00412727272727273 x + 0.0853636363636364

R² = 0.218972999675975
0.1

0.05

0
0 5 10 15 20 25

Concentración (mg/L)

GRAFICA 2.3. Curva de Calibración DO3. Se muestra un gráfico de dispersión para

cada par de datos entre la concentración de albumina de huevo contra la DO3 de la
tabla 2, para calcular la curva de calibración y se obtuvo su correspondiente
coeficiente R^2=0.219
 Absorbancia Promedio
0.25
Absorbancia a 595 nm
0.2
f(x) = 0.00474772727272727 x + 0.0879318181818182
0.15 R² = 0.269762056163119

0.1

0.05

0
0 5 10 15 20 25

Concentración (mg/L)

GRAFICO 2.1. Curva de calibración DO-promedio. En este caso se muestra un grafico de dispercion
para cada par de datos entre la concentración de albumina de huevo contra la DO promedio, de la tabla
2, para calcular la curva de calibracion y se obtuvo su correspondiente coeficiente R^2=0.2698.

CALCULOS PARA LA CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA LECHE ALPURA PARA

PROTEINAS SOLUBLES.

Para nuestra dilución tenemos la siguiente formula:

(V ¿¿ 1) ( C 1 )=(V ¿¿ 2) ( C 2 ) ¿ ¿

Con los valores qué tenemos debemos despejar el V1 qué sera el volumen de la
muestra de leche alpura
Datos:
31 g/L Proteina =31000 mg/L
(V ¿ ¿ 2) ( C 2)
V 1= ¿
C1

Al sustituir nuestra formula obtenemos lo siguiente:

(0.1 L) ( 500 mg/ml )
V 1= =0.001 L=1 ml
31 000 mg/ml

Muestra de Leche Concentración (mg Absorbancias

Alpura /L)
Blanco 0 0
 1 500 0.149
2 500 0.156
3 500 0.172
TABLA 2.1. Concentración y Absorbancias de la muestra de la Leche Alpura para proteinas
solubles.Valores de absorbancia obtenidos a una concentracion de 500 mg/L de abulmina
de huevo.

Absorbancias de las Muestras

0.2
0.18
Absorbancia a 595 nm

0.16
0.14 f(x) = 0.000318 x
0.12 R² = 0.985549996751348
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 100 200 300 400 500 600

Concentración (mg/L)

GRAFICA 2.5. Curva de calibración de la muestra elegida.Se observan los valores de la

absorbancia obtenida de la muestra a 595nm contra la concentración de 500 mg/L de
abulmina de huevo de la tabla 2.1,para asi obtener R^2=0.9855.

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

CONCLUSIÓN.
Se cuantificaron azucares reductores por medio del DNS y la cuantificación de las
proteínas por el método de Bradford, en el cual se realizaron curvas de calibración
y se tomaron en cuenta las curvas con el coeficiente R2 lo más cercano a la
unidad para trabajar con nuestra muestra problema (Leche Alpura 1L). Tomamos
en cuenta solo 2 regresiones una para los azucares fue; y=0.0005x -0.057 con un
92.07% y una para las proteínas fue: y= 0.0065x + 0.0608 con un 38.36%.

Este es uno de los métodos sencillos, accesibles útiles y utilizados sin embargo es
un poco complejo ya que si se llega a confundir en algún momento puede afectar
mucho los resultados obtenidos.

Las concentraciones que obtuvimos son muy parecidas dados los resultados que
obtuvimos, ya que es una muestra experimental, mientras que el valor real de
nuestra muestra podría ser mucho mayor dado que ellos llevan un procedimiento
mucho mas experimentado y mas estricto dentro la empresa que se está
realizando.

Por lo que nuestros resultados se pudieron ver afectados en algún momento, y por
esa cuestión no pudimos obtener los mismos valores, aunque muchas veces un
pequeño cambio por muy mínimo que sea puede ser caótico.

CUESTIONARIO.

1. ¿Cuál es el fundamento de la determinación de azúcares reductores

por el método de DNS? ¿Cuál es la reacción que se lleva a cabo entre
los reactivos y el azúcar reductor?

El método del ADNS se basa en una reacción entre los azúcares reductores y el
ácido 3,5-dinitrosalicílico, donde se produce la reducción de este en ácido 3-
amino-5-nitrosalicílico, resultando en un complejo de color naranja cuantificable
colorimétricamente (Akbar et al., 2006).

2. Explique en qué consiste la ley de Lambert y Beer y por qué se debe

leer la densidad óptica en un intervalo de absorbancia menor a 1.
La ley se fundamenta en la capacidad de ciertos compuestos para absorber
energía, específicamente hablando de la luz, los fotones a una cierta longitud de
onda, a esta capacidad se le llama absortividad molar (ε). Esta misma ley dice que
la absorbancia o la densidad óptica (A), es directamente proporcional a la
concentración (c) de la especie absorbente: Donde b es el paso óptico.

Las soluciones concentradas no son recomendadas para ser medidas en el

espectrofotómetro, puesto que las moléculas de soluto interaccionan entre sí
debido a su proximidad. Cuando las moléculas del soluto se acercan unas a otras,
sus propiedades, como la absortividad molar, cambian y los solutos se convierten
prácticamente en disolventes.

3. ¿Cuáles son los fundamentos de los métodos de Lowry y de Bradford

para la determinación de proteínas? ¿Cuál es la reacción que se lleva
a cabo entre los reactivos y las proteínas en ambos métodos?

Método de Lowry

El principio del método se basa en la utilización de una mezcla que contiene

molibdato, tungstato y ácido fosfórico que sufre una reducción cuando reacciona
con proteínas, en la presencia del catalizador cobre (II). Esto produce un
compuesto con absorción máxima a 750 nm. Esta reducción ocurre directamente a
través de las cadenas laterales de algunos aminoácidos (tirosina, triptófano,
cisteína, asparagina e histidina), que contribuyen con cuatro electrones, o a través
de la eliminación de dos electrones de cada unidad tetrapeptídica de las proteínas,
que es facilitada por la formación del quelato entre el cobre (II) y las proteínas. De
este modo, el método de Lowry envuelve dos reacciones químicas. La primera
reacción es la reducción ácido fosfórico del ión cobre (II) en condiciones alcalinas
(básicas), formando un complejo con enlaces peptídicos, denominado reacción de
Biuret. La segunda reacción envuelve la reducción del complejo cobre-enlace
peptídico, causando un cambio en la coloración de la solución para azul.
(Marques, M, 2008)

Método de Bradford
Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue)
a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y
otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo
proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre.
Este método es sensible (1-15 µg), simple, rápido, barato y pocas sustancias
interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los
detergentes y las soluciones básicas. (BENSADOUM, A. 1976)

4. Diga cuales son las limitantes de las técnicas de Lowry y de Bradford

y qué compuestos químicos interfieren con ellas.

Método de Lowry

Es incompatible con reactivos como el Tris, EDTA, DDT, 2-mercaptoetanol,

carbohidratos

Método de Bradford

Es incompatible con reactivos como detergentes y proteínas poco densas. (N.d,

2024).

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

 Dosal, M. (2008). INTRODUCCIÔN A LA METROLOGÎA QUÎMICA CURVAS

DE CALIBRACIÓN EN LOS MÉTODOS ANALÍTICOS. México, D.F, México:
Departamento de Química de la UNAM.
 Diaz, N., & Barcenas, J. (2008). Espectrofometría: Espectros de absorción y
cuantificación colorimétrica de biomoléculas. Verazcruz, México:
Universidad de Córdoba.
 Bredford, M. (2000). Enzymes in farm animal nutrition. Cambridge, U.K:
Bittles Ltd.
 Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69
(1990).
 Akbar, A.; S. Sinegani and G. Emtiazi. 2006. The relative effects of some
elements on the DNS method in cellulase assay. J. Appl. Sci. Environ. Mgt.
10 (3): 93-96
 Marques, M. (2018, November 1). Método de Lowry. Knoow.net.
https://knoow.net/es/ciencias-tierra-vida/biologia-es/metodo-de-lowry/
 BENSADOUM, A., y WEIXSTEIN, D., «Assay of iproteins in the presence of
intenfering materials», Anal. Biochem., 70, 241 (1976).
 (N.d.). Abyntek.com. Retrieved March 17, 2024, from
https://www.abyntek.com/5-metodos-para-cuantificar-proteinas/