GENOTECAS DE cDNA

GENOTECAS DE cDNA

No representan todo el
genoma sino los genes que se
expresan en un momento
determinado en un tipo celular
o tejido.

Suelen construirse en
vectores de expresión, que
permiten rastreo mediante
anticuerpos o actividad
enzimática.
DNA polymerase I
o Klenow

S1
T4 DNA polymerase
GENOTECAS DE cDNA

Purificación del mRNA

 GENOTECAS DE cDNA

Adición de linkers para insertar el

cDNA en el vector
 GENOTECAS DE cDNA

Problema de sesgo por sobrerrepresentación de extremos 3’

Vector de expresión
Permiten la expresión de la proteína codificada por el cDNA clonado en la célula hospedadora
 MÉTODOS DE RASTREO DE
UNA GENOTECA DE cDNA

- Hibridación. Método convencional mediante

hibridación Vectores
duales
- Rastreo con un anticuerpo. Cuando se ha procariota/
eucariota
purificado la proteína y se han obtenido
anticuerpos, o bien si están disponibles
anticuerpos contra la proteína homóloga de
otro organismo.
- Rastreo por unión a un ligando. Cuando se
trata de una proteína a la cual se une un
ligando
- Rastreo a través de la actividad enzimática
de la proteína. Cuando existe un método de
detección de dicha actividad que pueda
analizarse en placa.
- Rastreo por complementación. Reversión al
fenotipo silvestre (gen mutado, genes
supresores)
SCREENING (RASTREO) DE UNA
GENOTECA MEDIANTE HIBRIDACIÓN
RASTREO DE UNA GENOTECA DE cDNA MEDIANTE ANTICUERPOS
SCREENING (RASTREO) DE UNA
GENOTECA DE cDNA MEDIANTE
UNIÓN A UN LIGANDO
 SCREENING (RASTREO) DE UNA GENOTECA DE cDNA
MEDIANTE BIOENSAYO O ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Halo de inhibición de crecimiento

microbiano

Cambio de color al formarse un producto

a partir de un sustrato en el medio
SCREENING (RASTREO) POR COMPLEMENTACIÓN,
CLONACIÓN DE GENES SUPRESORES
- Se parte de una cepa mutante que es transformada con la genoteca. Se basa en la
complementación funcional del gen mutante, se seleccionan transformantes que revierten al
fenotipo silvestre.
- Gen correspondiente a la mutación
- Gen supresor
- Se necesita un vector con un marcador de selección para la especie en estudio. Preferible que el
plásmido sea autorreplicativo y no integrativo para poder recuperarlo mediante una lisis alcalina.
TRANSFORMACIÓN EN PLANTAS
Transformación en
plantas
 Agrobacterium invade
aprovechando los cortes

Transferencia a placas con agar

Placas con agar, hormonas

y kanamicina

Las plantas, resistentes a kanamicina,

contienen el gen “extraño”

Regeneración de las plantas

Planta transformada con el gen para la GFP (proteína verde fluorescente)
TRANSFORMACIÓN EN ANIMALES
Transformación mediante Biobalística