Transfección estable y transitoria

M en C. Hector Javier Villalpando Velazco

 La transfección es un procedimiento que
introduce ácidos nucleicos hacia las células.
 La transfección sirve para estudiar la función
de los genes o productos de los genes y
producir proteínas recombinantes en células
de mamífero.
 Transfección
 Transfección estable: el material genético introducido tiene un
gen marcador para la selección (transgenes) los cuales son
integrados en el genoma huesped y sostienen la expresión
incluso después de que la célula huésped se replica.
 Transfección transitoria: Estos genes transitoria transfectados
solo son expresados por un periodo de tiempo limitado y no son
integrados al genoma.
 Metodologia
 Hay métodos biológicos, químicos y físicos.
 El método ideal debe mostrar alta eficiencia de transfección, baja toxicidad de las
células, efectos mínimos en la fisiología normal, y además de ser reproducible y
fácil de usar
 Aplicaciones

Microscopía

Western Citometria
Blot de Flujo
Expresión Expresión
de de Gen
proteína
Actividad
PCR de
del Gen Analisis tiempo real
Reportero
 METODOS BIOLÓGICOS

 El método más utilizado es la transfección mediada por virus

 Es altamente eficiente, y es fácil de lograr una expresión
sostenible de la expresión in vivo de transgenes debido a la
naturaleza viral de la integración en el genoma huésped
Vector Viral Tamaño del Tipo Expresión Inconveniencias
Inserto de Celular
ADN
Retroviral 8 kb Celulas en Estable Sitios de
División inserción al azar
Lentivirus 9 kb Celulas en Estable Sitios de
divisón y sin inserción al
divisón
azar
Adenovirus 8 kb Celulas en Transitoria Altamente
divisón y sin inmunogenico
divisón
Vector Viral Tamaño del Tipo Expresión Inconveniencias
Inserto de Celular
ADN

Virus adeno- 5 kb Celulas en Estable, Requiere la

asociado divisón y sin localización ayuda de un virus
(AAV) divisón específica auxiliar para
de sitio crecer, dificultad
de remover el
virus auxiliar

Virus de 30-40 kb Celulas en Transitoria No hay expresión

Herpes divisón y sin de genes
simpléx divisón durante la
infección latente

Virus Vaccinia 25 kb Celulas en Transitoria Potenciales

divisón Efectos
citopatologicos
 Métodos Químicos

 Por lo general utilizan un polimero catiónico: fosfato de calcio,

lípido catiónico o un aminoácido catiónico.
 Los químicos cargados positivamente forman complejos
químicos/ácidos nucleicos con ácidos nucleicos cargados
negativamente.
 Estos complejos cargados positivamente son atraídos a las
membranas cargadas negativamente.
 Lipid-Mediated Gene Delivery
(Lipofección o Transfección de genes basados en liposomas)

• Utiliza lípidos para causar que la célula absorba ADN exógeno.

 .
• Transferencia de material genético hacia las células utilizando liposomas,
los cuales son vesículas que pueden fusionarse con la membrana celular
ya que ambos están hechos de una membrana de fosfolípidos
 Métodos Físicos

 Microinyección
 Biobalística
 Electroporación
 Transfección basada en laser
 Microinyección

 Inyección directa de ácidos nucleicos en el citoplasma o núcleos

 Este método demanda especialización y es costoso.
 Laborioso (una célula a la vez).
 Biobalística

 Emplea partículas de oro que se conjugan con ácidos

nucleicos.
 Estos conjugados son “disparados” a recipientes celulares a
alta velocidad
 Este método es directo y confiable pero causa daño físico a las
muestras
1. Precipite el ADN en las partículas de oro
2. Cargue el ADN/oro en los tubos
3. Rote los tubos para cubrir de ADN/oro en la superficie interna.
4. Corte los tubos en cartuchos
5. Cargue los cartuchos en la pistola de genes
6. Entregue el ADN a las células
1. Las partículas de oro recubiertas de ADN (microacarreador) son esparcidas
sobre el área central de un disco de plástico fino (macroacarreador).
2. El disco cargado de ADN es colocado en un soporte dentro del equipo.
3. El sistema usa helio de alta presión, liberado por un disco de ruptura y vacío
parcial para propulsar el macroacarreador cargado con el microacarreador
hacia las células .
4. El macroacarreador es detenido a corta distancia por una pantalla de
detención.
5. Las partículas de oro recubiertas de ADN continuan viajando hacia el
objetivo para penetrar las células.
6. La cámara de muestra esta sujeta a vacio parcial.
 Electroporación

 Un pulso eléctrico corto causa una disrupción en la membrana

celular y abre poros en la membrana, a través de los cuales los
ácidos nucleicos pueden pasar.

 Es capaz de transfectar una gran cantidad de células en un

periodo corto de tiempo, una vez que las condiciones optimas de
electroporación son alcanzadas
1. La electroporación expone a la célula a
un campo eléctrico de alta intensidad
que desestabiliza temporalmente a la
membrana

2. Durante este tiempo la membrana es

altamente permeable a moléculas
exógenas presentes en el medio

3. El ADN se mueve hacia la célula a

través de estos poros.

4. Cuando el campo eléctrico es apagado,

los poros de la membrana se resellan,
encerrando al ADN dentro de la célula
 Factores que afectan la transfección

 En la célula huésped: salud de la célula, cultivo

celular

 Del material genético: Calidad y cantidad del ADN

 Salud Celular
 Las células deben de crecer en medio adecuado con todos los
factores necesarios
 Los cultivos deben estar libres de contaminación
 Medio fresco debe ser utilizado si este contiene componentes
químicos inestables como timina
 Las células deben ser incubadas a 37°C con un porcentaje de CO2
de 5 a 10% y un 100% de humedad relativa
 Cultivo Celular

 Muy pocas células causan que el cultivo celular crezca

pobremente sin contacto el contacto de célula a célula.
 Por el contrario, muchas células resultan en inhibición por contacto,
haciendo a las células resistentes al consumo de ADN y otras
macromoléculas.
 Es decir, las células deben ser transfectadas a un 40 a 80% de
confluencia.
 Cultivo Celular

Las células en división asimilan el ADN mejor. (El rompimiento y

perforación de la membrana nuclear durante la mitosis habilita la
entrega nuclear)
 Cultivo Celular

 El número de pasajes debe de ser bajo (<50)

 Las características de las células pueden cambiar con el tiempo

con líneas celulares inmortalizadas y las células pueden no
responder a las mismas condiciones de transfección.
 Calidad y Cantidad del ADN
 Usar plásmidos de ADN de alta calidad que estén libres de
proteína, ARN y químicos para las transfecciones. (La remoción
de endotoxinas debe ser parte del procedimiento de
preparación).

 Por lo general el ADN es suspendido en agua estéril o buffer

TE a una concentración final de 0.2-1 mg/mL

 La cantidad óptima de ADN puede variar dependiendo del tipo

de ADN, método/reactivo de transfección, línea celular y
número de células
 Microinyección

El DNA purificado es inyectado directamente en el pronúcleo masculino de un cigoto, utilizando un

micromanipulador acoplado a una pipeta con presión negativa y otro micromanipulador acoplado a una aguja
de inyección.
El pronúcleo masculino es inyectado con picolitros de DNA purificado (1ug/ml), mientras el cigoto es
inmovilizado por la presión negativa de la pipeta. El éxito de la inyección depende del tiempo de la
fertilización y de la precisión en el proceso.
Luego de la microinyección, 20-30 cigotos son implantados en el oviducto de una hembra pseudopreñada
(recientemente apareada con un macho vasectomizado). Esto resulta, 19 días más tarde, en la generación
de 5-8 crías,. Los animales transgénicos son identificados mediante análisis de PCR a partir de DNA extraído
de las colas a las tres semanas de vida. Los transgénicos son, posteriormente, verificados mediante
Southern blots.
Los ratones positivos para el ensayo de PCR son cruzados con animales controles para identificar los
fundadores, es decir, aquellos que contienen el DNA integrado en su línea germinal, lo que da lugar a un
patrón Mendeliano de herencia del transgen.
Regiones enhancer que controlan la expresión tejido-específica de un gen pueden ser utilizadas para
dirigir la expresión de un gen foráneo en tejidos de interés. Este esquema ilustra como el promotor de un
gen expresado en la próstata puede ser utilizado para generar ratones transgénicos que son modelos del
cáncer de próstata.
TRANSFERENCIA NUCLEAR

Esquema de la clonación de la oveja

Dolly, utilizando el material
genético derivado de células
aisladas de la glándula mamaria de una
oveja adulta.
(tasa de éxito:1 de 227)