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Artículo

La senescencia celular inducida por la obesidad genera

ansiedad y afecta la neurogénesis
Gráficamente abstracto Autores
Mikolaj Ogrodnik, Yi Zhu,
Larissa GP Langhi, ...,
Thomas von Zglinicki,
James L. Kirkland, Diana Jurk

Correspondencia
kirkland.james@mayo.edu (JLK),
diana.jurk1@ncl.ac.uk (DJ)

En breve
La obesidad, un problema de salud creciente en las
sociedades occidentales, se asocia con un aumento
de las células senescentes y trastornos
neuropsiquiátricos, como la ansiedad y la depresión.
Ogrodnik y sus colegas encontraron que la
eliminación de células senescentes en ratones
obesos alivia la ansiedad. Nuestro estudio
proporciona evidencia de prueba de concepto de
que los senolíticos son una nueva vía terapéutica
potencial para el tratamiento de trastornos
neuropsiquiátricos.

Reflejos
D La obesidad impulsa la senescencia en las células gliales en el LV de cerebros de
ratón

D La senescencia inducida por la obesidad impulsa los depósitos de grasa en las áreas PV del

cerebro

D El aclaramiento de células senescentes en la obesidad restaura la neurogénesis en la

SVZ

D La eliminación de células senescentes alivia el comportamiento similar a la ansiedad inducido por

la obesidad

Ogrodnik et al., 2019, Metabolismo celular29,1061–1077 7 de

mayo de 2019ª2019 Los Autores. Publicado por Elsevier Inc.
https://doi.org/10.1016/j.cmet.2018.12.008
Metabolismo Celular

Artículo

La senescencia celular inducida por la obesidad

genera ansiedad y afecta la neurogénesis
Mikolaj Ogrodnik,1,2,11Yi Zhu,2,11Larisa GP Langhi,2Tamar Tchkonia,2Patricio Kru €ger,1Eduardo Fielder,1
Estela Victorelli,1Rifqha A. Ruswhandi,1Nino Giorgadze,2Tamar Pirtskhalava,2Oleg Podgorni,3,4Grigori Enikolopov,3,4,5,6
Kurt O Johnson,2ming xu,2Cristina Inman,2Allyson K Palmer,2marissa schafer,2Moritz Weigl,2yuji ikeno,7
Terry C. Burns,8João F. Passos,1,10Thomas von Zglinicki,1,9James L. Kirkland,2,*y Diana Jurk1,2,10,12,*
1Instituto de Biociencias Celulares y Moleculares, Instituto de Envejecimiento de la Universidad de Newcastle, Campus para el Envejecimiento y la Vitalidad, Newcastle upon Tyne NE4 5PL,
Reino Unido
2Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, 200 First Street SW, Rochester, MN 55905, EE. UU.
3Departamento de Anestesiología, Facultad de Medicina de Stony Brook, 101 Nicolls Road, Stony Brook, Nueva York, NY 11794, EE. UU.
4Centro de Genética del Desarrollo, Universidad de Stony Brook, 100 Nicolls Road, Stony Brook, Nueva York, NY 11794, EE. UU.
5Departamento de Nanotecnología, Biotecnología de la Información y Ciencias Cognitivas, Instituto de Física y Tecnología de Moscú, Moscú, Rusia

6Laboratorio Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, Nueva York, NY, EE. UU.

7The Barshop Institute for Longevity and Aging Studies, San Antonio, Department of Pathology, The University of Texas Health Science Center at
San Antonio, Research Service, Audie L. Murphy VA Hospital (STVHCS), San Antonio, TX 78229, EE. UU.
8Departamentos de Cirugía Neurológica y Neurociencia, Mayo Clinic, 200 First Street SW, Rochester, MN 55905, EE. UU.
9Near East University, Facultad de Artes y Ciencias, Biología Molecular y Genética, Nicosia, Chipre del Norte POB 99138 Mersin 10, Turquía
10Departamento de Fisiología e Ingeniería Biomédica, Mayo Clinic, Rochester, MN 55905, EE. UU.
11Estos autores contribuyeron igualmente
12Contacto principal
* Correspondencia:kirkland.james@mayo.edu (JLK),diana.jurk1@ncl.ac.uk (DJ)
https://doi.org/10.1016/j.cmet.2018.12.008

RESUMEN
La senescencia celular implica una detención estable del ciclo
celular y un fenotipo secretor proinflamatorio, lo que contribuye al
envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad. La
1992), siendo este último uno de los rasgos conductuales más comunes en
pacientes obesos (Gariepy et al., 2010). Se ha informado un aumento del
comportamiento similar a la ansiedad en roedores genéticamente
predispuestos a desarrollar obesidad, por ejemplo,base de datos/base de
datosratones (Dinel et al., 2011), y en la obesidad inducida por una dieta alta

obesidad se asocia con una mayor carga de células senescentes y
trastornos neuropsiquiátricos, incluidas la ansiedad y la depresión.
Para investigar el papel de la senescencia en la disfunción
neuropsiquiátrica relacionada con la obesidad, utilizamos el modelo
de ratón INK-ATTAC, del cual p16Ink4a- se pueden eliminar las células
senescentes que expresan, y los fármacos senolíticos dasatinib y
quercetina. Encontramos que la obesidad da como resultado la
acumulación de células gliales senescentes en la proximidad del
ventrículo lateral, una región en la que ocurre la neurogénesis
adulta. Además, las células gliales senescentes exhiben depósitos
de grasa excesivos, un fenotipo que denominamos "acumulación de
lípidos en la senescencia". La limpieza de las células senescentes de
ratones obesos alimentados con alto contenido de grasa o con
deficiencia de receptor de leptina restauró la neurogénesis y alivió
el comportamiento relacionado con la ansiedad. Nuestro estudio
proporciona evidencia de prueba de concepto de que las células
senescentes son los principales contribuyentes a la ansiedad
inducida por la obesidad y que los senolíticos son una nueva vía
terapéutica potencial para tratar los trastornos neuropsiquiátricos.
INTRODUCCIÓN
La obesidad se asocia con una variedad de trastornos
neurodegenerativos y psiquiátricos, que incluyen depresión y ansiedad.
Gariepy et al., 2010; Hryhorczuk et al., 2013; Stunkard y Wadden,
en grasas (HFD) (Heyward et al., 2012; Mizunoya et al., 2013). Procesos como la
inflamación (Capurón y Miller, 2011; Lasselin y Capurón, 2014), señalización
hormonal alterada (Ulrich-Lai y Ryan, 2014) y disfunción de las células madre (
Anacker y Hen, 2017; Gao et al., 2017) se ha especulado que subyacen a la
ansiedad relacionada con la obesidad, pero no se han identificado los
mecanismos subyacentes. Aquí, investigamos la hipótesis de que el
comportamiento similar a la ansiedad en la obesidad puede ser causado por
una mayor carga de células senescentes.
La senescencia celular es una detención irreversible del ciclo celular
causada por una variedad de tensiones, incluida la disfunción de los
telómeros.d'Adda di Fagagna et al., 2003), estrés oxidativo (Passos et al.,
2010), inflamación (Jurk et al., 2014), acumulación intracelular de daño (
Ogrodnik et al., 2018) y disfunción metabólica (Wiley y Campisi, 2016).
Las células senescentes muestran una variedad de marcadores, incluidos
los focos de daño del ADN asociado a los telómeros (TAF) (Hewitt et al.,
2012), aumento de la actividad de los lisosomales asociados a la
senescenciaB-galactosidasa (Dimri et al., 1995), cambios en la cromatina
(focos de heterocromatina asociados a la senescencia, SAHF) (Narita et
al., 2003), y con frecuencia aumento de la expresión de las proteínas
inhibidoras de la cinasa dependiente de ciclina, p16Ink4ay p21Cip1.
Si bien la senescencia celular es un potente mecanismo de supresión
de tumores (Muñoz-Espín y Serrano, 2014), a largo plazo, la acumulación
de células senescentes puede impedir la regeneración y el
mantenimiento de tejidos renovables y, por lo tanto, contribuir al
envejecimiento de los tejidos. Además, las células senescentes secretan
una serie de citoquinas inflamatorias, quimioquinas y proteasas de
matriz (el fenotipo secretor asociado a la senescencia, SASP) (Coppé et
al., 2008). Se cree que el SASP ha evolucionado como un medio para que
las células senescentes se comuniquen con el sistema inmunitario en

Metabolismo Celular29, 1061–1077, 7 de mayo de 2019ª2019 Los Autores. Publicado por Elsevier Inc.1061
Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
Figura 1. Los ratones obesos exhiben un comportamiento similar al de la ansiedad que no está directamente relacionado con un aumento en la masa corporal Los
cambios de comportamiento se probaron en la cámara de campo abierto (OF). El rectángulo oscuro marca el área central (25% del área total). (A) Rastros de
movimiento representativos (líneas rojas) para ratones alimentados con dieta chow y alta en grasas (HFD) a los 10 meses de edad (línea de base).

(la leyenda continúa en la página siguiente)

1062Metabolismo Celular29, 1061–1077, 7 de mayo de 2019

para orquestar la eliminación de células senescentes y estimular las
células progenitoras para reparar tejidos (Chkonia et al., 2013). Sin
embargo, la exposición crónica al SASP provoca daños en las células
sanas vecinas, lo que contribuye a la disfunción tisular durante el
envejecimiento y en las enfermedades relacionadas con la edad.Acosta
et al., 2013; Nelson et al., 2012; Xu et al., 2018).
La acumulación de células senescentes se ha observado durante la
obesidad (Minamino et al., 2009; Ogrodnik et al., 2017; Schafer et al.,
2016), durante la crianza (Baker et al., 2016; Jurk et al., 2012; Wang et al.,
2009; Xu et al., 2015; Yousefzadeh et al., 2018), y en los sitios de
patogénesis en múltiples enfermedades crónicas y relacionadas con la
edad (Chkonia et al., 2013). La eliminación de las células senescentes
puede retrasar, prevenir o aliviar múltiples trastornos relacionados con
la edad (Kirkland y Tchkonia, 2017; Xu et al., 2018). Estos incluyen
disfunción cardíaca y vascular relacionada con la edad (Childs et al.,
2016; Roos et al., 2016), fragilidad (Baar et al., 2017; Baker et al., 2016; Xu
et al., 2018; Zhu et al., 2015), esteatosis hepática (Ogrodnik et al., 2017),
fibrosis hepática (Moncsek et al., 2018), osteoporosis (Farr et al., 2017),
artrosis (Jeon et al., 2017) y fibrosis pulmonar (Schafer et al., 2016), entre
otros. En el contexto del cerebro, informes recientes han demostrado
que la eliminación de células senescentes mejora los fenotipos en
modelos de ratón con enfermedad de Parkinson (Chinta et al., 2018) y
enfermedades neurodegenerativas dependientes de tau (Musi et al.,
2018; Bussian et al., 2018). Sin embargo, la relación entre la senescencia
y los trastornos neuropsiquiátricos como la ansiedad no se ha
investigado hasta el momento.
Aquí, demostramos que en la obesidad, las células gliales muestran un
aumento de los marcadores de senescencia celular en la región periventricular
del ventrículo lateral (LV), una región muy próxima al nicho neurogénico. Las
células gliales senescentes en ratones obesos muestran una acumulación
excesiva de grasa, un fenotipo que denominamos "acumulación de lípidos en
la senescencia" (ALISE). Es importante destacar que mostramos que la
eliminación de células senescentes alivia el deterioro relacionado con la
obesidad en la neurogénesis adulta y disminuye el comportamiento similar a
la ansiedad inducido por la obesidad. Nuestro trabajo sugiere que dirigirse a
las células senescentes puede representar una nueva vía terapéutica para
tratar la disfunción neuropsiquiátrica inducida por la obesidad.
RESULTADOS
Los ratones obesos muestran un mayor comportamiento similar a la ansiedad no
relacionado con la masa corporal
Con el fin de investigar la relación entre la obesidad y la ansiedad, se alimentó a
ratones C57Bl/6 de 8 meses de edad con una dieta HFD (60 % de las calorías de la
grasa) o con una dieta estándar durante 2 meses. Como era de esperar,
encontramos que el peso corporal y el contenido de grasa corporal aumentaron en
ratones HFD en comparación con los controles alimentados con chow (Figuras S1A
y S1B). Para medir el comportamiento similar a la ansiedad, primero
empleamos la prueba de campo abierto (OF). Esta prueba evalúa la tendencia
de los ratones a permanecer cerca de las paredes y evitar los espacios abiertos
(zona central), un fenómeno conocido como tigmotaxis, que se utiliza
ampliamente como indicador de un comportamiento similar al de la ansiedad (
Simón et al., 1994). Los ratones alimentados con HFD estaban menos
inclinados a explorar el área central de la cámara de prueba OF que la zona
periférica (Figuras 1A–1C yS1D), y del mismo modo, la distancia total recorrida
se redujo significativamente en los animales HFD durante la prueba (Figura S1
C). Para dar cuenta de la disminución de la actividad en animales obesos, se
analizaron las medidas de ansiedad en función de la distancia total recorrida
durante las pruebas experimentales (Figuras 1B y 1D). Como se ha
demostrado, la obesidad afecta la actividad y el comportamiento exploratorio
y contribuye al comportamiento similar a la ansiedad (Amigo et al., 2017;
Guillemot-Legris y Muccioli, 2017), luego investigamos si el peso corporal y la
composición corporal por sí solos podrían explicar el comportamiento similar
a la ansiedad observado. El análisis de regresión lineal no reveló una
correlación significativa entre el peso corporal o el porcentaje de masa grasa
con el comportamiento similar a la ansiedad en ratones alimentados con HFD (
Figuras 1D, 1E yS1E-SIJ). Esto indica que, si bien el aumento de peso se asocia
con la aparición de un comportamiento similar a la ansiedad, una vez que se
alcanza un cierto peso, no se encuentra una correlación entre el peso y la
ansiedad, lo que sugiere que factores distintos al aumento de peso deben
desempeñar un papel.
Como una medida adicional del comportamiento similar a la ansiedad, utilizamos
la prueba del laberinto en cruz elevado (EPM). El EPM se basa en el miedo natural de
los animales a las alturas y los espacios abiertos. El aumento del comportamiento
similar a la ansiedad en la prueba de EPM se manifiesta como una disminución en el
número de golpes en la cabeza y entradas con los brazos abiertos. Encontramos que
los animales en el HFD tenían menos entradas en los brazos abiertos del EPM
(frecuencia y tiempo) en comparación con los animales delgados (Figuras 1F-1H), que
es indicativo de un aumento del comportamiento similar a la ansiedad. De manera
similar a la prueba OF, no hubo correlaciones significativas entre la masa corporal y
grasa y los parámetros de ansiedad en animales alimentados con dieta magra o HFD
(Figuras 1yo, 1J,S1K y S1L).
La eliminación farmacogenética y farmacológica de las células
senescentes alivia los cambios de comportamiento relacionados con
la obesidad
Varios informes recientes han demostrado que la eliminación de células
senescentes puede aliviar una gran variedad de trastornos relacionados
con la edad (Kirkland y Tchkonia, 2017). La obesidad se ha asociado con
la acumulación de células senescentes en el tejido graso (Minamino et
al., 2009; Schafer et al., 2016; Chkonia et al., 2010) y el hígado (Ogrodnik
et al., 2017). Sin embargo, no se ha investigado un vínculo entre la
senescencia inducida por la obesidad y la ansiedad. Por lo tanto,
investigamos si las células senescentes pueden

(B y C) Parámetros registrados y analizados en OF: (B) distancia recorrida en la zona central (en función de la distancia total recorrida) (t(54)= 2,359; p = 0,022) y (C) entradas en
la zona central (U = 187, p = 0,0006).
(D y E) No se encontraron correlaciones significativas (regresión lineal) en animales Chow o HFD entre (D) la masa corporal y la distancia normalizada que
recorrieron los ratones en el área central (r = 0.1024, p = 0.5972; r = -0.283, p = 0,1704) y (E) el número de entradas al área central (r = 0,09993, p = 0,606; r =
-0,2692, p = 0,1933).
(F) Mapas de calor representativos del tiempo que los ratones pasaron en el laberinto en cruz elevado (EPM) para ratones Chow y HFD. Los brazos cerrados del laberinto se indican mediante corchetes rosas. (G
y H) (G) La frecuencia de la cabeza asoma en los brazos abiertos (t(36.66)= 2,045; p = 0,048) y (H) el tiempo que los ratones pasan con la cabeza con los brazos abiertos (U = 230, p = 0,0209) disminuye
significativamente en los ratones HFD en comparación con los ratones alimentados con chow.
(I y J) No se encontraron correlaciones sustanciales entre la masa corporal y los parámetros de prueba de EPM en ratones Chow y HFD: (I) frecuencia de golpes de cabeza en los brazos
abiertos (r = -0.09171, p = 0.6361; r = -0.1927, p = 0,356) y (J) tiempo de brazos abiertos (r = 0,1477, p = 0,4444; r = -0,000444, p = 0,9983). Los datos son de n = 25–30 ratones por grupo. Media
± SEM trazado. *p % 0,05 y **p % 0,001.

Metabolismo Celular29, 1061–1077, 7 de mayo de 20191063

Figura 2. La eliminación farmacogenética y farmacológica de células senescentes de ratones obesos alivia los cambios de comportamiento relacionados con la
obesidad
(A) C57Bl/6 de ocho meses(TINTA-ATTAC)los ratones macho se dividieron en cuatro grupos y se asignaron a dietas chow (n = 24) o altas en grasas (HF, n = 30) y se trataron a los 10 meses de edad
con vehículo (n = 12 para chow y n = 15 para HF) o AP20187 (n = 12 para chow y n = 15 para HF) hasta los 13 meses de edad.
(B–D) (B) Prueba de campo abierto (OF): rastros de movimiento representativos (líneas rojas) de ratones INK-ATTAC delgados y obesos tratados con/sin AP20187 (AP) indica que el
comportamiento similar a la ansiedad de los ratones HFD puede ser aliviado por el tratamiento AP medido por (C) la distancia normalizada recorrida en el área central del cuadro OF (U = 36,
p = 0.0037; U = 64, p = 0.0453) y (D) mayor frecuencia de entradas en el centro área. El alivio del comportamiento similar a la ansiedad de los ratones HFD también se observó en la prueba
EPM (U = 10,5, p <0,0001; U = 64,5, p = 0,0463).
(E) Imágenes representativas del mapa de calor del tiempo que los ratones pasaron en secciones abiertas y cerradas del EPM. Los parámetros fueron registrados por el software EthoVision.
(F y G) (F) Frecuencia de golpes de cabeza en los brazos abiertos (U = 17,5, p < 0,0001; t(27)= 2,1; p = 0,0452) y el tiempo (G) que los ratones pasaron con la cabeza en el área abierta se
redujeron significativamente con HFD y aumentaron con AP (U = 26, p = 0,001; U = 59,5, p = 0,0472).
(H) Rastros de movimiento representativos (líneas rojas) debase de datos/base de datosy ratones control heterocigotos con o sin tratamiento con cóctel senolítico, dasatinib + quercetina
(D+Q) en la prueba OF durante un ensayo de 30 min.
(I y J) Los datos indican una mejora en el comportamiento similar a la ansiedad debase de datos/base de datosratones con tratamiento D+Q determinado por los parámetros de la prueba OF:
(I) distancia normalizada recorrida en el área media (t(7.259)= 2,269, p = 0,0562; t(21)= 3,001, p = 0,0068) y (J) frecuencia de entradas en la zona media de la caja OF (U = 1, p < 0,0001; U = 24,5, p =
0,009).
(K y L) En la prueba OF, INK-ATTAC;base de datos/base de datoslos ratones (K) mostraron una diferencia significativa en la distancia recorrida en el área central después del tratamiento con
AP20187 en comparación con el vehículo (U = 61; p = 0,0106), pero (L) el número de entradas en el área central no aumentó significativamente después tratamiento con AP (U = 85,5; p =
0,1096).
Los datos son de n = 12–15 ratones por grupo para (A)–(G); n = 8–12 ratones por grupo para (H)–(J); n = 5–9 ratones por grupo para (K)–(L). Media ± SEM trazado. *p % 0,05 y
* p % 0,001.

contribuir al comportamiento similar a la ansiedad durante la obesidad
mediante el uso del modelo de ratón INK-ATTAC. Este modelo permite la
ablación selectiva mediada por genes suicidas de p16Ink4aque expresan
células, muchas de las cuales son senescentes, tras la administración del
fármaco AP20187 (AP), que entrecruza la proteína de fusión ATTAC,
activando así su fracción caspasa 8 para inducir la apoptosis (Panadero
et al., 2011; Xu et al., 2015).
Tratamos repetidamente ratones de 10 meses de edad alimentados con
Chow y HFD con AP o vehículo (Figura 2A) a lo largo de 10 semanas, que no
produjo cambios significativos en el peso corporal (Figura S2A) o composición
corporal (datos no mostrados). Para medir el comportamiento similar a la
ansiedad, primero usamos la prueba OF y confirmamos nuestra observación
anterior de que los animales en el HFD estaban menos inclinados a explorar el
centro de la cámara de campo abierto que la periferia.
ery, medida por la distancia recorrida (Figura 2C) y entradas (Figura 2D)
en la zona central. Además, los ratones alimentados con HFD viajaron
significativamente menos durante la duración de las pruebas, cubriendo
una distancia total más pequeña (Figura S2C). Para tener esto en cuenta,
la mayoría de los parámetros medidos (como se indica) se expresaron en
función de la distancia total recorrida. Liquidación de p16Ink4a-Las células
positivas con AP redujeron el comportamiento similar a la ansiedad
inducido por HFD medido por la distancia recorrida en la zona central (
Figuras 2B yS2B) y las entradas a la zona central (Figura 2C). Sin
embargo, el tratamiento AP no afectó la distancia total recorrida (Figura
S2C) o cualquiera de los parámetros antes mencionados en los ratones
alimentados con chow (Figuras 2B–2D yS2C).
A continuación, evaluamos el comportamiento similar a la ansiedad con el EPM. Como se
señaló anteriormente, los animales obesos evitaron las entradas en los brazos abiertos

1064Metabolismo Celular29, 1061–1077, 7 de mayo de 2019

del EPM (mostrando menor frecuencia de entradas y menor tiempo de
permanencia) en comparación con los animales magros (Figuras 2E–2G,S2D y
S2E), lo que indica un aumento del comportamiento similar a la ansiedad. De
acuerdo con los datos de la prueba OF, el tratamiento con AP disminuyó
significativamente el fenotipo similar a la ansiedad en animales obesos, como
lo indica la frecuencia de entradas de la cabeza en los brazos abiertos del EPM
(Figuras 2E–2G,S2D y S2E). Otras funciones cognitivas, como la memoria a
corto plazo (Figuras S2F y S2G) medidos por la prueba del laberinto de Stone,
no fueron alterados por el tratamiento HFD o AP. En conjunto, estos
resultados muestran que la eliminación específica de p16Ink4a+-Las células
senescentes de ratones obesos INK-ATTAC alivian el comportamiento similar a
la ansiedad pero no tienen ningún efecto sobre el rendimiento de la memoria.
Para excluir los efectos no deseados del fármaco AP, los ratones C57Bl/6 de
tipo salvaje se trataron con el fármaco y se les realizó una prueba de
comportamiento similar a la ansiedad. De acuerdo con estudios previos, los
ratones de tipo salvaje mostraron una diferencia significativa entre Chow y
HFD en la prueba OF antes del inicio del tratamiento (Figura S2H), pero no se
observaron diferencias en los ratones alimentados con HFD después del
tratamiento con AP (Figura S2I).
Además de los ratones alimentados con HFD, realizamos experimentos
complementarios enbase de datos/base de datosratones en los que la obesidad es
causada por una mutación puntual en el gen del receptor de leptinaleproso, que
conduce a la diabetes tipo 2 espontánea (Wang et al., 2014). Tratamos a estos
ratones de forma intermitente durante 2 meses con el cóctel de fármacos senolíticos,
Dasatinib y Quercetina (D+Q) (Zhu et al., 2015).base de datos/base de datoslos
ratones han aumentado significativamente el peso corporal y el peso del depósito
adiposo en comparación con los magrosbase de datos+/-compañeros de camada
heterocigotos, pero curiosamente, el peso corporal no cambió durante el transcurso
del tratamiento D+Q (Figuras S2J y S2K).
Similar a los ratones alimentados con HFD,base de datos/base de datoslos
ratones exhibieron un aumento del comportamiento similar a la ansiedad según lo
evaluado por la prueba OF (Figuras 2H–2J). Observamos que la distancia total
recorrida (Figura 2I) y el número de entradas (Figura 2J) en la zona central se
redujeron enbase de datos/base de datosratones en comparación con sus no
obesos, base de datos+/-compañeros de camada heterocigotos, un fenotipo que
podría aliviarse significativamente mediante el tratamiento con D+Q. mientras obeso
base de datos/base de datoslos ratones recorrieron una distancia total más corta en
comparación con sus compañeros de camada delgados, el tratamiento D+Q no
cambió la distancia total recorrida en elbase de datos/base de datosobase de datos/
base de datos+/-ratones (Figuras S2K y S2L).
Finalmente, confirmamos estos resultados en una cohorte de doubletransgenic,
INK-ATTAC;base de datos/base de datosratones. De forma similar al tratamiento con
D+Q, aclaramiento genético de p16Ink4a-células senescentes positivas en INK-ATTAC;
base de datos/base de datoslos ratones no alteraron el peso corporal, la
composición corporal o la actividad (Figuras S2M-S2O). Es importante destacar que la
eliminación de p16Ink4a-células senescentes positivas en INK-ATTAC; base de datos/
base de datoslos ratones redujeron el comportamiento similar a la ansiedad según lo
analizado por la prueba OF (Figuras 2K y 2L). Para excluir los efectos secundarios del
fármaco AP,base de datos/base de datoslos ratones fueron tratados con AP y no se
observaron efectos fuera del objetivo en el comportamiento similar a la ansiedad en
las pruebas OF (Figura S2PAGS). De manera similar a nuestras observaciones
anteriores, el análisis de regresión lineal no mostró correlaciones significativas entre
el peso corporal y el comportamiento similar a la ansiedad en INK-ATTAC
alimentados con HFD (con y sin AP) obase de datos/base de datos(con o sin AP o
D+Q) ratones (Figuras S2Q–S2S).
En conclusión, nuestros datos muestran que la eliminación farmacológica o
farmacogenética de las células senescentes en dos modelos diferentes de obesidad
alivia significativamente el comportamiento similar a la ansiedad.
Los enfoques senolíticos farmacológicos y
farmacogenéticos reducen la carga de células
senescentes y alivian la inflamación sistémica
Para investigar la eficacia de la eliminación de células senescentes en
ratones HFD, medimos los marcadores de senescencia en el tejido
adiposo perigonadal, un tejido que previamente mostró un marcado
aumento en el número de células senescentes con la edad (Schafer et al.,
2016; Chkonia et al., 2010; Xu et al., 2015).
Encontramos que los marcadores de senescencia SA-B-Gal, p16 y TAF
aumentaron en ratones INK-ATTAC en HFD y se redujeron significativamente
con la administración de AP (Figuras 3A–3C). p21 ygramo-H2A.X aumentó en
animales HFD pero no cambió significativamente después del tratamiento con
AP (Figuras S3A y S3B). Del mismo modo, encontramos quebase de datos/base
de datoslos ratones tenían una mayor carga de células senescentes en la
grasa perigonadal (medida por SA-B-Frecuencia Gal y TAF) en comparación con
base de datos/base de datos+/-ratones. Esto se redujo significativamente con el
tratamiento con el cóctel senolítico, D+Q (Figuras 3D-3F).
Dado que los enfoques senolíticos que aplicamos actúan sistémicamente,
es posible que reduzcan los factores SASP proinflamatorios que pueden
penetrar la barrera hematoencefálica y, por lo tanto, impactar en el cerebro.
Para investigar esta posibilidad, analizamos el plasma sanguíneo en busca de
una gran variedad de factores SASP. La evaluación de las citoquinas
circulantes en el torrente sanguíneo de ratones INK-ATTAC alimentados con
comida y HFD reveló que HFD resultó en la regulación positiva de factores
SASP conocidos como G-Csf, Il-1ay Il-1B,Kc/Cxcl1, Mcp-1, Mig y Tnf-a,que luego
se regularon a la baja con el tratamiento AP (figura 3GRAMO). De manera
similar, los factores SASP en el plasma sanguíneo debase de datos/base de
datoslos ratones aumentaron en comparación con los delgados base de
datos/base de datos+/-compañeros de camada y se redujo después del
tratamiento con D+Q (figura 3h). Como se ha demostrado que las citocinas
derivadas de la periferia inhiben la neurogénesis y provocan ansiedad y
depresión (Anacker y Hen, 2017; Gao et al., 2017; Li et al., 2014),
correlacionamos la expresión de citoquinas en el torrente sanguíneo con
parámetros de comportamiento similar a la ansiedad medidos por la prueba
OF. Observamos correlaciones negativas significativas entre los niveles
plasmáticos de Cxcl1, G-Csf y Mig y diferentes mediciones similares a la
ansiedad en ratones HFD tratados con AP (Figuras 3I–3K y S3C) y tratados con
D+Qbase de datos/base de datosratones (Figuras S3D y S3E), mientras que no
se encontró correlación para Tnf-a,Il-6 y Mcp-1 (Figuras S3F–S3H). Estos
resultados nos llevaron a investigar más a fondo el impacto de los factores
sistémicos en el fenotipo de ansiedad observado. Como Cxcl1 es la citocina
que mejor se correlaciona con el comportamiento similar a la ansiedad y se ha
asociado previamente con la obesidad.Nunemaker et al., 2014), inyectamos
animales delgados con Cxcl1 murino recombinante. Como era de esperar, la
inyección de Cxcl1 condujo a un aumento de los niveles de Cxcl1 circulante (
Figura S3I). Además, el aumento de Cxcl1 en plasma resultó en una ligera
disminución en el peso corporal pero no alteró la composición corporal (
Figuras S3J y S3K). Examen del comportamiento similar a la ansiedad usando el
OF (Figura S3L) y EPM (Figura S3M) las pruebas no mostraron diferencias entre
los animales tratados y no tratados. Para examinar más a fondo el papel de
Cxcl1 en el comportamiento similar a la ansiedad, tratamos ratones HFD con
reparixina, que inhibe los receptores Cxcl1 Cxcr1 y Cxcr2. Los ratones con
reparixina tuvieron un pequeño aumento en el peso corporal (Figura S3N),
pero ninguna diferencia en la grasa corporal (Figura S3O), en comparación con
los ratones no tratados. Nuevamente, no observamos ninguna diferencia en el
comportamiento entre los grupos tratados y no tratados cuando los animales
fueron probados en la caja OF (Figura S3P) o la EPM (Figura S3Q). Estos
resultados
Metabolismo Celular29, 1061–1077, 7 de mayo de 20191065
Figura 3. La eliminación de células senescentes de animales obesos reduce los niveles de citoquinas circulantes
(A) Cuantificación del porcentaje de beta-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-B-Gal)-células positivas en tejido adiposo perigonadal muestra valores aumentados en animales
alimentados con HFD y rescate completo después del tratamiento con AP20187 (t(11)= 5,563, p = 0,0002; t(12)= 5,739, p < 0,0001).
(B y C) Marcadores de senescencia (B) p16 (medido por RT-PCR) (U = 5, p = 0,0221; t(13)= 2,631, p = 0,0208) y (C) focos de daño en el ADN asociados a los telómeros (TAF) (t(11)=
9,495, p < 0,0001; t(13)= 2,913, p = 0,0121) muestran un patrón similar.
(D y E) (D) Imágenes representativas y (E) cuantificación de SA-B-Actividad de Gal en el tejido adiposo perigonadal debase de datos/base de datosybase de datos/+ratones muestra que el porcentaje de SA-B-Las
células gal positivas aumentan enbase de datos/base de datosratones en comparación conbase de datos/+y se reduce significativamente tras el tratamiento con el cóctel senolítico D+Q (t(17)= 5,615, p < 0,0001; t
(21)= 2,504, p = 0,0206).
(F) Frecuencias de células TAF positivas en tejido adiposo perigonadal debase de datos/base de datoslos ratones aumentaron significativamente en comparación condb/+ ratones y disminuyó después del
tratamiento D+Q (t(dieciséis)= 2,612, p = 0,0189; t(21)= 5,937, p < 0,0001).
(G) Expresión de proteína de citoquinas [cambio de veces] en plasma sanguíneo de animales HFD tratados con/sin AP20187.
(H) Expresión de citoquinas [cambio de pliegue] en plasma sanguíneo debase de datos/base de datosanimales tratados con/sin AP20187.

(la leyenda continúa en la página siguiente)

1066Metabolismo Celular29, 1061–1077, 7 de mayo de 2019

sugieren que Cxcl1 solo no es suficiente para inducir un fenotipo similar
a la ansiedad; sin embargo, no excluyen la posibilidad de que otros
factores SASP solubles estén involucrados en el proceso.
Recientemente, se ha demostrado que el trasplante de cantidades
relativamente bajas de células senescentes en animales jóvenes resultó
en una disfunción física medida por el rendimiento de Rotarod, la fuerza
de agarre o la resistencia en comparación con el trasplante de células no
senescentes.Xu et al., 2018). Es importante destacar que este estudio
mostró que el trasplante de células senescentes produjo efectos
sistémicos duraderos en tejidos ubicados distantes de donde se
inyectaron las células senescentes.
Para probar la hipótesis de que las células senescentes pueden inducir un
comportamiento similar a la ansiedad a través de efectos sistémicos,
trasplantamos células senescentes o no senescentes en ratones delgados y
evaluamos el comportamiento y la función física 6 y 12 semanas después (
Figura S3R). Confirmamos nuestras observaciones previas de que las células
senescentes trasplantadas reducían la función física (Xu et al., 2018), medido
por Rotarod (Figura S3S), pero no tuvo efecto sobre el comportamiento similar
a la ansiedad usando la prueba OF (Figuras S3T–S3W). Juntos, estos
experimentos sugieren que la presencia de células senescentes en otras
partes del cuerpo no es suficiente para inducir un fenotipo similar a la
ansiedad en ratones.
El tratamiento senolítico reduce la frecuencia de las células
senescentes en la amígdala y el hipotálamo, pero no en otras
regiones del cerebro
Nuestros resultados anteriores nos llevaron a plantear la hipótesis de
que la obesidad podría inducir la senescencia específicamente en el
cerebro, contribuyendo así a un fenotipo similar a la ansiedad. Dada la
aparición informada de marcadores de senescencia en neuronas y
células gliales de ratones envejecidos en la corteza, el cerebelo y el
hipocampo (Jurk et al., 2012; Kang et al., 2015), primero evaluamos los
marcadores de senescencia en estas regiones del cerebro de ratones
INK-ATTAC obesos y delgados tratados con y sin AP. No encontramos
diferencias en los marcadores senescentes p21, p16,gramoH2A.X, o TAF
entre cualquiera de los grupos experimentales (Figuras S4A–S4D). Esto
es consistente con la ausencia de diferencias en la memoria y el
aprendizaje entre cualquiera de los grupos experimentales evaluados
por el laberinto de Stone (Figuras S2F y S2G).
Curiosamente, la evaluación de las células senescentes en la amígdala, una
región del cerebro asociada con respuestas emocionales como la ansiedad y el
miedo (Adhikari et al., 2015), reveló un aumento significativo en el número de
p16Ink4a-células positivas en ratones alimentados con HFD (Figura 4A). Las
neuronas positivas para TAF en la capa basomedial de la amígdala
aumentaron significativamente en ratones HFD y disminuyeron
significativamente con el tratamiento con AP (Figuras 4B–4D). A continuación,
analizamos la carga de células senescentes en el hipotálamo cerca de los 3rd
ventrículo y encontró que NeuNnegativo(Figuras 4E y 4F) y NeuNposición(Figuras S4
E y S4F) las células senescentes aumentaron significativamente en HFD en
comparación con ratones delgados y disminuyeron significativamente con el
tratamiento de ratones alimentados con HFD con AP.
Juntos, estos datos indican que HFD no induce la senescencia en
las regiones del cerebro implicadas en el aprendizaje, la memoria
(I-K) El análisis de regresión lineal entre los marcadores de ansiedad y las citocinas en el plasma sanguíneo mostró una correlación negativa significativa entre (I) Cxcl-1 (r =
-0,4663, p = 0,0188), (J) G-Csf (r = -0,3507 , p = 0,079), (K) Mig (r = -0,4205, p = 0,0325) y la distancia recorrida en la zona central de la caja OF en ratones alimentados con HFD.
Los datos son de n = 6–9 ratones por grupo para (A)–(C) y (G); n = 7–12 ratones por grupo para (E), (F) y (H); n = 27 ratones por grupo para (I)–(K). Media ± SEM trazado. *p %
0,05 y **p % 0,001.
control de las neuronas motoras, como la corteza, el cerebelo y el hipocampo.
Sin embargo, HFD induce la senescencia en el hipotálamo y la amígdala, lo que
puede contribuir a sus efectos sobre el comportamiento similar a la ansiedad,
y el tratamiento con AP redujo la abundancia de células senescentes y atenuó
estos cambios de comportamiento.
La eliminación de células senescentes disminuye la
acumulación periventricular de glía cargada de lípidos en
animales obesos
Se ha demostrado que las células senescentes se acumulan en la
obesidad (Minamino et al., 2009; Ogrodnik et al., 2017; Schafer et al.,
2016; Chkonia et al., 2010), y su prevalencia se ha relacionado con la
acumulación de grasa ectópica (Ogrodnik et al., 2017). Recientemente, se
ha informado que las células que acumulan gotitas de lípidos en el
cerebro se encuentran muy cerca de los ventrículos, y el número de
estas células aumenta en ratones con la edad.Shimabukuro et al., 2016),
en pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD), y en modelos de ratón
de AD (Hamilton et al., 2015). Estos datos nos llevaron a investigar la
conexión entre la senescencia y la acumulación de grasa en el cerebro.
El análisis de la expresión de perilipina 2 (Plin2) (una proteína que rodea las
gotas de lípidos) en el cerebro de ratones alimentados con HFD reveló un
aumento significativo en Plin2+células (Figura S5A) ubicado muy cerca del LV
en comparación con los controles alimentados con comida (Figuras 5A y 5B).
Plin2+También se detectaron células alrededor de los 3rdy 4el
ventrículos y en la sustancia gris periacueductal (PAG) (Figura S5B),
pero no en otras regiones del cerebro (datos no mostrados). La
doble tinción para Plin2 y los marcadores específicos de tipo celular,
vimentina (Vim), Iba1 y NeuN, indicó que Plin2+Las células son en su
mayoría astrocitos (41%) y microglía (19%) (Figuras 5C y 5D).
Para investigar si Plin2+las células tienen características de
senescencia, analizamos el marcador de senescencia TAF en
combinación con inmunotinción de Plin2. Encontramos frecuencias
más altas de TAF en Plin2+células (Figura 5E), mientras que el daño
total del ADN no cambió (Figura S5C). Juntos, nuestros hallazgos
indican que un HFD contribuye a un mayor número de células
senescentes en la región periventricular del cerebro y que estas
células acumulan preferentemente grasa. Dado que previamente
observamos un fenómeno similar en hepatocitos y fibroblastos
senescentes (Ogrodnik et al., 2017), denominamos a este fenotipo
''acumulación de lípidos en la senescencia'' (ALISE).
Para investigar más a fondo el impacto de las células senescentes en la
acumulación de grasa en el cerebro, utilizamos el modelo de ratón INK-ATTAC (Baker
et al., 2011). El tratamiento de ratones INK-ATTAC alimentados con HFD con AP
resultó en una reducción significativa de Plin2+células (Figuras 5F y 5G), así como
células portadoras de marcadores de senescencia (Figura 5h). Además, analizamos el
área ocupada por las gotas de lípidos en las células ependimarias y el marcador de
senescencia TAF en la glía muy cerca del LV debase de datos/base de datosanimales
Encontramos que estos aumentaron significativamente enbase de datos/base de
datosen comparación conbase de datos/base de datos-/+animales y se redujo
significativamente después del tratamiento con el cóctel senolítico, D+Q (Figuras S5
D–S5F). Además, evaluamos la neuroinflamación mediante la realización de
hibridación in situ de ARN.
Metabolismo Celular29, 1061–1077, 7 de mayo de 20191067
Figura 4. Los marcadores de senescencia en la amígdala se reducen después del tratamiento con AP20187
(A) Las células positivas para p16 se midieron mediante RNA-ISH en la capa basomedial de la amígdala (t(9)= 2,627, p = 0,0275; t(12)= 2,918, p = 0,0129).
(B) Imágenes representativas que muestran focos de daño en el ADN asociado a los telómeros (TAF), (azul = DAPI, rojo = telómeros, verde =gramo-H2A.X, la flecha blanca indica TAF; barras de escala, 5metrom)
en 3-metroSecciones de cerebro incrustadas en parafina de m de espesor.
(C y D) (C) Número medio de TAF (t(9)= 2,221, p = 0,0535; t(12)= 2,874, p = 0,014) y (D) porcentaje de NeuNposicióncélulas con 2 o más TAF (t(4.298)= 3,943, p = 0,0147; t(11)
= 3,854, p = 0,0027) aumentó en ratones HFD INK-ATTAC y se redujo significativamente después del tratamiento con AP20187 en la capa basomedial de la
amígdala.
(E y F) (E) Número medio de TAF (t(11)= 4,449, p = 0,001; U = 2, p=0.0062) y (F) porcentaje de NeuNnegativocélulas con 2 o más TAF (t(11)= 4,501, p = 0,0009; U = 1, p = 0,0031)
aumentaron en ratones HFD INK-ATTAC y se redujeron significativamente después del tratamiento con AP20187 en el hipotálamo muy cerca de los 3rdventrículo. Los datos
son de n = 5–6 ratones por grupo para (B)–(D); Media ± SEM trazado. *p % 0,05 y **p % 0,001.

contra los factores SASP Cxcl1 e Il-6 en combinación con
inmunotinción para Plin2 en estrecha proximidad al LV de ratones
HFD (Figura 5I). Curiosamente, encontramos que más del 80% de
Plin2+las células también fueron positivas para Cxcl1 e Il-6 (Figuras 5
J y 5K).
Finalmente, los marcadores de ansiedad en animales HFD, como la
distancia recorrida en la zona central y las entradas a la zona central, se
correlacionaron negativamente con la abundancia de Plin2+células muy
próximas al VI (Figuras 5L y 5M). Juntos, estos datos respaldan un vínculo
causal entre la acumulación de células gliales senescentes cargadas de
lípidos en animales obesos y el comportamiento similar a la ansiedad.
La supresión del fenotipo ALISE reduce la acumulación de
fragmentos de cromatina citosólica y el SASP
Para investigar más a fondo el impacto de la acumulación de grasa en la
senescencia celular, utilizamos fibroblastos adultos de ratón (MAF) y
senescencia inducida por irradiación de rayos X como se describió
anteriormente (Jurk et al., 2014; Ogrodnik et al., 2017). Cultivamos células
senescentes en presencia o ausencia de fuentes externas de lípidos (FBS
normal versus FBS privado de lípidos). Descubrimos que, en ausencia de
lípidos extracelulares, las células que muestran ALISE
fenotipo (evaluado por colorante lipofílico, Nile Red) se redujeron (
Figuras 6A y 6B). A continuación, investigamos el impacto de la
acumulación de grasa en diferentes marcadores de senescencia
celular (Figuras 6C–6K yS6A). Recientemente, se ha informado que
las células senescentes contienen fragmentos de cromatina
citoplasmática (CCF) (Ivanov et al., 2013), que activan la vía cGAS-
STING de detección de ADN, un importante impulsor del SASP (Dou
et al., 2017). Curiosamente, encontramos que la anulación del
fenotipo ALISE redujo significativamente el CCF en células
senescentes (Figuras 6C y 6D), pero no el número promedio de
focos de daño en el ADN (Figuras 6E y 6F) o binuclearidad (Figura S6
A). De acuerdo con la hipótesis de que el depósito de lípidos
mejorado afecta a CCF y SASP, descubrimos que privar a las células
de lípidos resultó en una reducción drástica de varios componentes
clave de SASP, como Il-6, Kc (Cxcl-1), Ip-10 (Cxcl-10) y Lix (Cxcl-5) (
Figuras 6G–6K). Para investigar si estos hallazgos estaban
restringidos a MAF, realizamos experimentos similares en astrocitos
primarios de ratón. De manera similar a los MAF, encontramos una
mayor acumulación de grasa, un aumento de TAF y un mayor
número de CCF en astrocitos senescentes (Figuras 6L–6O).
Con base en estos datos, proponemos que un exceso de ALISE puede
contribuir a la inestabilidad genómica, lo que resulta en la liberación de
fragmentos de cromatina y la activación de SASP.

1068Metabolismo Celular29, 1061–1077, 7 de mayo de 2019

Figura 5. La acumulación de gotas de lípidos relacionada con la obesidad en la glía periventricular senescente se reduce con la eliminación de células senescentes
(A) Imágenes representativas de la tinción de perilipina 2 (Plin2) que muestran la acumulación de células que exhiben una acumulación de gotas de lípidos muy cerca del ventrículo lateral (LV) de ratones
obesos de mediana edad en comparación con sus compañeros de camada delgados. Barras de escala, 200metrom/50metrom (para magn.)
(B) Cuantificación de frecuencias de Plin2+celdas en la proximidad (hasta 250metrom desde la capa de células ependimales) al LV en dieta alta en grasas (HFD) y ratones magros (t(11)=
4,48, p = 0,0009).
(C) Imágenes representativas que muestran Plin2+células que se ubican junto con marcadores de microglía (Iba1; panel superior izquierdo) y astrocitos (vimentina [Vim]; panel superior derecho), pero no con
marcadores neuronales (NeuN; panel inferior, barras de escala, 20metrometro).
(D) El gráfico circular muestra la composición de tipo celular de Plin2+células, determinadas después de la inmunotinción para Plin2 y diferentes marcadores de tipo celular, como se muestra en (C).

(E) Periventricular Plin2+las células gliales muestran un mayor número del marcador de senescencia, focos asociados a telómeros (TAF). Cuantificación del número medio de
TAF por célula en no neuronal (NeuNnegativo) Plin+y plin-células (t(10)= 2,475, p = 0,0328).
(F) Las imágenes representativas muestran el LV de chow (panel superior) y ratones tratados con HFD AP20187 teñidos con Plin2, que muestran gotas de lípidos reducidas. Barras de escala, 200metrom/50
metrom (para magn.)
(G) Cuantificación de células que contienen gotitas de lípidos (Plin2+) en el área periventricular de ratones delgados HF INK-ATTAC con o sin tratamiento con AP20187 (t(11)=
4,48, p = 0,0009; t(9.362)= 3,28, p = 0,0091).

(la leyenda continúa en la página siguiente)

Metabolismo Celular29, 1061–1077, 7 de mayo de 20191069

La neurogénesis deteriorada en animales HFD se rescata mediante la
eliminación de células senescentes
Se ha demostrado que la acumulación ectópica de gotas de lípidos en los
cerebros con AD induce la disfunción de las células madre neurales que
residen dentro de la zona subventricular (SVZ), suprime la neurogénesis adulta
y causa deterioro cognitivo.Hamilton et al., 2015).
En ratones HFD, observamos que Plin2+Las células gliales senescentes se
encuentran con frecuencia muy cerca de las células que expresan doblecortina
(Dcx), un marcador de células precursoras neuronales y neuronas inmaduras.
Figura S7A). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la presencia de
células gliales ALISE podría afectar la neurogénesis adulta en la SVZ.
Para probar esta hipótesis, tratamos ratones INK-ATTAC delgados y
obesos con o sin AP, como se describió anteriormente. Después de la
recolección de órganos, obtuvimos suspensiones de células individuales
de un hemisferio cerebral y las analizamos mediante citometría por
tiempo de vuelo (CyTOF), lo que permite mapear y discriminar entre
diferentes células cerebrales, incluidos astrocitos, oligodendrocitos,
microglía, neuronas, células ependimarias, pericitos y células
endoteliales. Reservamos el segundo hemisferio cerebral para análisis
histológicos (Figuras 7A y 7B).
Encontramos que los cerebros de los ratones alimentados con HFD no
exhibieron cambios significativos en las frecuencias de los
oligodendrocitos (CNPase+o OSP+), microglía (CD11b+, CD45-), neuronas
maduras (NeuN+), o células endoteliales (CD31+o CD146+) (Figuras 7C y S7
B–S7M). Sin embargo, las poblaciones de células precursoras neuronales
(Nestin+), neuronas inmaduras (Dcx+) y células ependimales (CD133+)
disminuyeron significativamente en animales sometidos a alimentación
HFD (Figuras 7C-7G). El aclaramiento de células senescentes por AP no
alteró las frecuencias de oligodendrocitos (CNPase+
o OSP+), microglía (CD11b+, CD45-), neuronas maduras (NeuN+), o células
endoteliales (CD146+) (Figuras 7C yS7B-S7M), pero aumentó significativamente
las células precursoras neuronales, las neuronas inmaduras y las células
ependimales (Figuras 7C-7G). CD133+Se ha informado que las células
ependimarias poseen propiedades de las células madre neurales y dan lugar a
Dcx+neuroblastos e interneuronas en el bulbo olfatorio (Luo et al., 2015). El
tratamiento con AP fue suficiente para inducir la recuperación parcial del
agotamiento de células madre relacionado con la obesidad (Figuras 7C y 7E) y
para reponer CD133+y Nestin+abundancia celular (Figuras 7F y 7G). Análisis de
poblaciones celulares en el cerebro debase de datos/base de datoslos ratones
mostraron un patrón similar al de los ratones alimentados con HFD.
Marcadores de neuronas inmaduras (Dcx+), células ependimarias (CD133+) y
células precursoras neuronales ( Nestin+) se regularon significativamente
después del tratamiento senolítico con D+Q (Cifras S7N–S7P).
Validamos estos hallazgos realizando inmunotinción para Dcx
(Figuras 7H y 7I) en el bulbo olfativo y marcaje de pulso EdU (
Cifras S7S y S7T) en la SVZ de animales HFD. Análisis
de DCX+células en el bulbo olfativo (realizado en los mismos ratones que
en el experimento CyTOF) mostró una correlación positiva entre el área
ocupada por Dcx+células en la capa de células granulares del bulbo
olfatorio y la frecuencia de Dcx+células detectadas por CyTOF (Figura 7J).
Cuantificación de Dcx+células (Cifras S7U y S7V) y EdU+células (Figura S7
W) en la zona subgranular (SGZ) del hipocampo no mostró ningún efecto
del tratamiento con AP (datos no mostrados), lo que implica que la
neurogénesis adulta en la SVZ, pero no en la SGZ, se ve afectada por la
presencia de células senescentes . Curiosamente, la eliminación de
células senescentes condujo a un aumento significativo en la población
de astrocitos.Cifras S7G–S7I) en animales obesos, mientras que no se
detectaron diferencias entre animales delgados y obesos. Este hallazgo
fue confirmado por inmunotinción para Gfap (Cifras S7Q y S7R) y puede
estar relacionado con una mayor plasticidad cerebral que apoya la
neurogénesis (Choi et al., 2016). Finalmente, encontramos que las
frecuencias de Plin2+glía correlacionada negativamente con los
marcadores de células ependimales y marcadores de neurogénesis
adulta, Nestin+(Figura 7K) y DCX+(Figura 7L). De igual forma, las
diferencias individuales en la distancia recorrida en la zona central se
correlacionaron positivamente con las frecuencias de Dcx+y Nestin+
células (Figuras 7M y 7N).
En resumen, nuestros datos indican que las células senescentes desempeñan un
papel causal en el deterioro de la neurogénesis inducido por la obesidad. Dirigirse a
las células senescentes en ratones obesos alivia el comportamiento similar a la
ansiedad relacionado con la obesidad como resultado de la eliminación de la
acumulación de grasa periventricular y la restauración de la neurogénesis adulta.
DISCUSIÓN
La obesidad es un trastorno complejo y un factor de riesgo importante para
muchas enfermedades y problemas de salud, como enfermedades cardíacas,
diabetes, accidentes cerebrovasculares, presión arterial alta, cáncer,
osteoartritis y deterioro cognitivo.Frasca et al., 2017). Además, la disminución
de la memoria espacial, la ansiedad y la depresión se han relacionado con la
inflamación cerebral asociada con la obesidad (Guillemot-Legris y Muccioli,
2017). Estudios previos han informado que la obesidad inducida
genéticamente y HFD en ratones da como resultado un comportamiento
similar a la ansiedad (Dinel et al., 2011; Heyward et al., 2012; Mizunoya et al.,
2013). Sin embargo, al igual que otros fenotipos impulsados por la obesidad,
como la inactividad física (Amigo et al., 2017), el comportamiento similar a la
ansiedad no es causado simplemente por el aumento de la masa corporal.
Curiosamente, la pérdida de peso corporal por sí sola no siempre se
corresponde con mejoras en la salud mental, por ejemplo, después de la
cirugía bariátrica (Canetti et al., 2016; Cunningham et al., 2012; Fischer et al.,
2017; Kouidrat et al., 2017; Matini et al., 2014). Por lo tanto, la

(H) Cuantificación de frecuencias de NeuNnegativo, células positivas para TAF en la región periventricular de ratones magros/HFD y tratados con vehículo o AP20187 (t(10)= 3,128,
p = 0,0107; t(13)= 2,693, p = 0,0184).
(I) Imágenes representativas que muestran tinción doble para CXCL1 (ARN-ISH en rojo) y Plin2 (verde) en el área periventricular de ratones HF INK-ATTAC. Las flechas blancas indican células positivas dobles
CXCL1 y Plin2 (barras de escala, 50metrom/10metrom para mag.). Las células ampliadas en el panel 4 rodeadas por un círculo rojo muestran tinción positiva para Plin2 y CXCL1, mientras que las células con
borde blanco no son doblemente positivas.
(J y K) Cuantificación de células positivas para (J) Cxcl1 (t(10)= 8.017, p < 0.0001) y (K) Il-6 (t(10)= 8.298, p < 0.0001) teñidos por RNA-ISH indican que Plin+las células muestran
niveles de expresión significativamente más altos de los factores SASP, Il-6 y Cxcl1, que Plin-células.
(L y M) La acumulación de grasa en la región periventricular del cerebro evaluada mediante tinción con Plin2 se correlaciona significativamente con parámetros asociados con el
comportamiento similar a la ansiedad: (L) porcentaje de distancia recorrida en la zona central (porcentaje de zona central) (r = -0,6475 , p = 0,0005) y (M) número de entradas en la zona
central (entradas) en la prueba OF (r = -0,6976, p = 0,0001).
Los datos son de n = 5 a 8 ratones por grupo para (B), n = 6 ratones por grupo para (E), (J) y (K), n = 4 a 8 ratones por grupo para (G) y ( H), y n = 25 ratones por grupo para (L) y
(M). Media ± SEM trazado. *p % 0,05 y **p % 0,001.

1070Metabolismo Celular29, 1061–1077, 7 de mayo de 2019

Figura 6. El fenotipo ALISE impulsa la acumulación de CCF y el SASP
Similar a la glía en los cerebros de ratones obesos, los fibroblastos adultos de ratón (MAF) muestran un fenotipo de acumulación de lípidos en senescencia (ALISE).
(A–F) El agotamiento de los lípidos de los medios de cultivo reduce el área de las gotitas de lípidos en los MAF. (A) El fenotipo ALISE en MAF se caracteriza por un área aumentada de gotitas de
lípidos rodeadas por vesículas Plin2 (barras de escala, 20metrometro). (B) Cuantificación de la tinción positiva con rojo Nilo en MAF jóvenes no senescentes (usted) y senescentes (sen) (p <
0,0001, p = 0,0004). (C y D) La supresión del fenotipo ALISE reduce las frecuencias de fragmentos de cromatina citoplasmática (CCF) en fibroblastos senescentes (p < 0,0001, p = 0,0006)
(barras de escala, 10metrom), pero (E) y (F) no afectan el número de focos de daño en el ADN de 53BP1 (p = 0,0973) (barras de escala, 10metrometro).
(G-K) Los fibroblastos senescentes muestran una mayor secreción de componentes SASP, incluidos Il-6, KC (Cxcl1) e Ip-10 (Cxcl10), que se alivia con la supresión del fenotipo
ALISE. (G) El mapa de calor muestra el cambio de pliegue en la secreción de componentes SASP en medios de cultivo celular durante un período de tiempo de 72 horas en
comparación con fibroblastos no senescentes cultivados con medios que contienen lípidos. Cada cuadrado representa una réplica biológica separada, es decir, MAF aislados
de un donante de ratón diferente. Concentración de componentes SASP en medios de cultivo con y sin lípidos (supresión del fenotipo ALISE) para (H) Il-6 (p = 0,0003, p <
0,0001), (I) Ip-10 (Cxcl10) (p = 0,0002, p = 0,0008) ), (J) Vegf (p = 0,6407, p = 0,003) y (K) Kc (Cxcl1) (p = 0,0114, p = 0,0075).
(L) Las imágenes muestran la acumulación de gotitas de lípidos en astrocitos positivos para GFAP senescentes pero no no senescentes (barras de escala, 20metrometro).
(M–O) Caracterización de la senescencia en astrocitos. Los astrocitos senescentes muestran (M) el fenotipo ALISE medido mediante tinción con rojo Nilo (t(2.034)= 11,32, p = 0,0073), (N)
frecuencias aumentadas de disfunción de los telómeros medidas como la frecuencia de células con 1 o más focos de daño en el ADN asociados a los telómeros (TAF) (t(4)= 12,45, p = 0,0002), y
(O) aumento de las frecuencias de CCF (t(2)= 7,551, p = 0,0171). La senescencia se indujo mediante irradiación con rayos X (10 Gy) y se estableció entre 14 y 21 días después de la irradiación.

Los datos son de n = 3–6 ratones por grupo. Media ± SEM trazado. *p % 0,05 y **p % 0,001.

Metabolismo Celular29, 1061–1077, 7 de mayo de 20191071

 (leyenda en la página siguiente)

1072Metabolismo Celular29, 1061–1077, 7 de mayo de 2019

La base mecánica del comportamiento similar a la ansiedad inducido por la obesidad aún no se
comprende completamente.
HFD induce la senescencia en múltiples órganos, predominantemente
en el tejido adiposo perigonadal (Schafer et al., 2016; Chkonia et al.,
2010; Xu et al., 2015) sino también en otros órganos, incluido el hígado (
Ogrodnik et al., 2017). Hasta ahora, el papel de HFD en la inducción de la
senescencia en el cerebro no se ha estudiado en gran medida.
Recientemente, varios estudios han descubierto un papel de las células
gliales senescentes en enfermedades neurodegenerativas como la
patología dependiente de tau y la enfermedad de Parkinson.Bussian et
al., 2018; Chinta et al., 2018; Musi et al., 2018).
Nuestros datos que demuestran un vínculo entre la obesidad, la senescencia y el
comportamiento similar a la ansiedad brindan un respaldo fundamental para la
factibilidad potencial de administrar senolíticos para tratar el comportamiento
similar a la ansiedad asociado con la obesidad, siempre que los ensayos clínicos
validen este enfoque.
Cabe mencionar que nuestra estrategia experimental no distingue qué
tipos de células senescentes son responsables de inducir un comportamiento
similar a la ansiedad. Sin embargo, descubrimos que las células gliales
proinflamatorias senescentes se encuentran con frecuencia muy cerca de
áreas del cerebro que expresan marcadores de células precursoras
neuronales y neuronas inmaduras, lo que sugiere que pueden ejercer efectos
negativos sobre las células madre. Si bien la senescencia puede afectar a las
células madre de manera autónoma al afectar su proliferación y
diferenciación.Xu et al., 2015), se había sugerido previamente que la
senescencia puede afectar a las células madre de forma no autónoma a través
del SASP (Krtolica et al., 2011; Pricola et al., 2009). De acuerdo con esta
hipótesis, encontramos que los factores SASP en el plasma sanguíneo y
específicamente en el cerebro aumentaron durante la obesidad y se redujeron
significativamente después de la eliminación farmacogenética y farmacológica
de las células senescentes. No obstante, ni la inyección del principal factor
SASP Cxcl1 (que aumentó durante la obesidad) ni la inhibición de sus
receptores tuvo un impacto en el comportamiento similar a la ansiedad.
Además, el trasplante de células senescentes, que previamente se ha
demostrado que induce efectos sistémicos y provoca una disfunción física
duradera en ratones, no tuvo un impacto en el comportamiento similar a la
ansiedad. Estos datos sugieren que los fenotipos similares a la ansiedad
provocados por la obesidad pueden ser una consecuencia de la senescencia
que ocurre localmente en regiones específicas del cerebro. Sin embargo,
dado el hecho de que todavía no existen medios para eliminar las células
senescentes de regiones específicas del cerebro, esta hipótesis sigue siendo
altamente especulativa.
Disfunción de periféricos (Ambrosi et al., 2017; Cignarelli et al., 2012;
Matsushita y Dzau, 2017) y células madre neurales (Li et al., 2014) se ha
relacionado con la obesidad y el síndrome metabólico y la inflamación, y se ha
postulado que se encuentran entre los factores que conectan la disfunción de
las células madre neurales adultas con la obesidad (Li et al., 2014). Sin
embargo, los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros. Anteriormente
informamos que la reducción de la abundancia de células senescentes que se
acumulan con el envejecimiento restaura el tejido adiposo (Xu et al., 2015) y la
función de las células madre óseas (Farr et al., 2017). De manera similar, otros
han informado una mejora en la función de las células madre
hematopoyéticas y del folículo piloso (Chang et al., 2016; Yosef et al., 2016) y
neurogénesis en un modelo de enfermedad de Parkinson (Chinta et al., 2018)
tras varios tratamientos senolíticos. Aquí, utilizando el etiquetado CyTOF y
EdU-pulse, demostramos que la eliminación de células senescentes en ratones
obesos restaura parcialmente el conjunto de células madre neurales.
Se ha establecido previamente un vínculo entre el comportamiento similar
a la ansiedad en ratones y la función de las células madre neurales (Drew y
Huckleberry, 2017; Siopi et al., 2016). Nuestros datos sugieren que el eje del
bulbo olfatorio de la zona subventricular está involucrado en los efectos
terapéuticos del aclaramiento de células senescentes. Se demostró que la
inactivación funcional del epitelio olfatorio principal es suficiente para inducir
un comportamiento similar a la ansiedad en ratones.Glinka et al., 2012).
Además, los adultos con antecedentes de estrés infantil o trastornos
depresivos mayores muestran un volumen reducido del bulbo olfatorio (Croy
et al., 2013; Negoias et al., 2010).
Aunque mostramos que la expresión de los marcadores de neurogénesis se
asocia negativamente con un comportamiento similar a la ansiedad, no
podemos excluir la posibilidad de que sea la propia ansiedad la que
perjudique la neurogénesis. En un estudio reciente, se demostró que la
administración crónica de corticosterona contribuye a la ansiedad y la
depresión y fue suficiente para inducir déficits olfativos y afectar la
neurogénesis adulta.Siopi et al., 2016).
En nuestro estudio, también hicimos la novedosa observación de que las
células gliales senescentes acumulan lípidos, un fenotipo que también ocurre
en fibroblastos senescentes y astrocitos cultivadosin vitro, que denominamos
ALISE.Hamilton et al. (2015)han demostrado que el

Figura 7. La eliminación de las células senescentes revierte parcialmente el agotamiento de las células progenitoras neurales inducido por la obesidad
(A) Cada hemisferio de los cerebros de ratones INK-ATTAC magros y con alto contenido de grasa (HF) se disoció en una suspensión unicelular o se procesó para IHC/IF. Las células cerebrales
disociadas se marcaron con anticuerpos conjugados con metales y se procesaron para citometría por tiempo de vuelo (CyTOF).
(B y D) Se realizó un análisis de progresión de árbol de expansión de eventos normalizados por densidad (SPADE) en poblaciones de células cerebrales identificadas por marcadores que se muestran en las
micrografías. El mapa de calor muestra la intensidad de la señal del anticuerpo y el tamaño de cada mancha está determinado por la cantidad de células dentro de esta población.
(C) CyTOF muestra diferencias en las poblaciones de células cerebrales de ratones alimentados con INK-ATTAC chow y HFD, que se trataron con vehículo o AP20187.
(E–G) Frecuencias de células que expresan los marcadores (E) doblecortina (Dcx) (t(13)= 3,057, p = 0,0092; t(15)= 2,236, p = 0,041), (F) CD133 (t(6.291)= 3,339, p = 0,0146;
t(9.674)= 3.383, p = 0.0073), y (G) Nestin (t(13)= 4,405, p = 0,0007; t(15)= 2.217, p = 0.0425) fueron cuantificados.
(H) Imágenes representativas de la tinción de Dcx en el bulbo olfativo de ratones alimentados con Chow y HFD tratados con vehículo o AP20187 (barras de escala, 250metrometro). Los cuadros blancos
muestran regiones ampliadas (barras de escala, 200metrometro).
(I y J) (I) Análisis cuantitativo del área positiva para Dcx de la capa granular en el lóbulo olfativo de ratones INK-ATTAC delgados y obesos (t(6)= 2,707, p = 0,0352; U
= 1, p = 0.0476) y (J) correlación entre área ocupada por Dcx+células en la capa granular del bulbo olfativo y frecuencias de Dcx+células de todo el cerebro
medidas por CyTOF (r = 0,616, p = 0,0111).
(K y L) Correlaciones (análisis de regresión lineal) entre frecuencias de glía periventricular que muestran acumulación de gotitas de lípidos y frecuencias de células que
expresan marcadores de neurogénesis y células ependimales (determinadas por CyTOF): (K) Nestin (r = -0,5887, p = 0,002) y (L) Dcx (r = -0,5022, p = 0,0105). (M y N)
Correlaciones (análisis de regresión lineal) entre la distancia recorrida en la zona central y las frecuencias de las celdas que expresan (M) Nestin (r = 0,487, p = 0,0074) y (N) Dcx
(r = 0,5749, p = 0,0011 ) (determinado por CyTOF).
Los datos son de n = 5–9 ratones por grupo para (C)–(G); n = 2–6 ratones por grupo para (I); n = 11 ratones por grupo para (J); n = 29 ratones por grupo para (K)–(N). Media ± SEM trazado.
* p % 0,05 y **p % 0,001.

Metabolismo Celular29, 1061–1077, 7 de mayo de 20191073

la acumulación de gotitas de lípidos en la SVZ se produce en modelos de ratón BRotarod
de AD y pacientes humanos con AD. También informaron que estos lípidos se BLaberinto en T de Stone

derivan del líquido cefalorraquídeo y que la presencia de gotitas de lípidos BRT-PCR

está asociada con la disfunción de las células madre neuronales en un modelo BBeta-galactosidasa asociada a la senescencia celular
de ratón con AD (Hamilton et al., 2015). Nuestros datos muestran que es la (SA-B-Gal) Actividad
presencia de células senescentes que contienen lípidos, en lugar de la BCitometría de masas/CyTOF en el cerebro

acumulación de lípidos per se, lo que contribuye al deterioro de la Bcitoquinas

neurogénesis. Nuestros datos implican que es la eliminación de las células BExperimentos de EdU
senescentes, en lugar de la reducción de la disponibilidad de lípidos, lo que BFocos
de inmunotinción y asociados a telómeros (TAF)
mejora la neurogénesis y alivia el comportamiento similar a la ansiedad del y Cuantificación
ratón. BInmuno y tinción con rojo Nilo para MAF y As-
Mecanicistamente, la acumulación de lípidos en las células senescentes se trocitos
ha relacionado con la disfunción mitocondrial y la alteración de la oxidación de BIHC para GFAP
ácidos grasos.Ogrodnik et al., 2017). Datos recientes han demostrado que la BHibridación in situ de ARN (ARN-ISH)
disfunción mitocondrial durante la senescencia es un efector clave de la DCUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO

senescencia celular, desempeñando un papel en la estabilización de la DDISPONIBILIDAD DE DATOS Y SOFTWARE

detención del crecimiento.Passos et al., 2010) y la inducción del SASP (Correia-
Melo et al., 2016). Según estos hallazgos y nuestros datos, especulamos que INFORMACIÓN SUPLEMENTARIA
cuando los lípidos están disponibles, las células senescentes no pueden
metabolizarlos de manera efectiva, lo que a su vez da como resultado una La información complementaria incluye siete cifras y una tabla y se puede encontrar
con este artículo en línea enhttps://doi.org/10.1016/j.cmet.2018.12.008.
mayor inestabilidad genómica, liberación de CCF e inducción de SASP.

A pesar de la creciente evidencia de que la ansiedad se asocia con una
menor calidad de vida, mayor depresión y suicidio en la obesidad.
Wagner et al., 2013), actualmente no hay tratamientos basados en
mecanismos disponibles. Aquí, mostramos que la senescencia celular
proporciona una explicación potencial para el aumento de la ansiedad en
las personas obesas y que apuntar a las células senescentes es
prometedor como estrategia terapéutica.
Limitaciones de estudio
Si bien nuestro estudio muestra que las células senescentes tienen un impacto
EXPRESIONES DE GRATITUD
DJ está financiado por una beca de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad
de Newcastle (Reino Unido) y la Academia de Ciencias Médicas SBF003\1179 (Reino
Unido). Este trabajo fue apoyado por Connor Group (JLK), NIH grant AG13925 (EE.
UU.) (JLK), un premio BIG de Glenn/American Federation for Aging Research (AFAR)
(EE. UU.) (JLK), Robert y Theresa Ryan (JLK), las fundaciones Ted Nash Long Life y
Noaber (EE. UU.) (JLK), NIH NRCDP K12 (EE. UU.) (TCB), Regenerative Medicine
Minnesota (TCB) y Humor for the Tumor (EE. UU.) (TCB) y Cancer Research UK
(CRUK) ) C12161/A24009 (TVZ) y BBSRC BB/ 1020748/1 (TVZ) (Reino Unido).
Agradecemos a Andrew Kingston por sus consejos y apoyo con respecto a las
estadísticas.

en la ansiedad, nuestra estrategia experimental no fue capaz de distinguir qué

tipos de células senescentes son responsables. Otros estudios que utilicen CONTRIBUCIONES DE AUTOR

modelos animales en los que las células senescentes se puedan eliminar de
una manera específica para el tipo de célula podrán abordar este escollo
particular. La obesidad afecta la locomoción (los animales obesos se mueven
más lentamente y tienden a congelarse más), lo que puede inducir algunos
artefactos en el análisis del comportamiento similar a la ansiedad. Los
estudios futuros pueden utilizar ensayos no basados en la locomoción, como
el enterramiento de canicas.
MO realizó la mayoría de los experimentos y recopiló datos; YZ, LGPL,
TT, PK, EF, NG, TP, OP, GE, MX, KOJ, CI, MS, AKP, MW y YI realizaron y evaluaron
experimentos individuales; DJ y JLK con la ayuda de TT, JFP y TvZ diseñaron y
supervisaron el estudio; DJ preparó cifras y escribió el manuscrito con
contribuciones de
MO, TCB, TvZ, JLK y JFP
DECLARACIÓN DE INTERESES

ESTRELLA+MÉTODOS JLK, YZ, TT, MX, TP y NG tienen un interés financiero relacionado con esta investigación. Las
patentes de medicamentos senolíticos (PCT/US2016/041646) están en manos de Mayo Clinic.
Esta investigación ha sido revisada por la Junta de Revisión de Conflictos de Interés de Mayo
Los métodos detallados se proporcionan en la versión en línea de este
Clinic y se llevó a cabo de conformidad con las políticas de Conflicto de Intereses de Mayo
documento e incluyen lo siguiente: Clinic.

DTABLA DE RECURSOS CLAVE Recibido: 19 de marzo de 2018

DCONTACTO PARA COMPARTIR REACTIVOS Y RECURSOS Revisado: 23 de octubre de 2018
DMODELO EXPERIMENTAL Y DETALLES DEL SUJETO Aceptado: 5 de diciembre de 2018
Banimales Publicado: 3 de enero de 2019; corregido en línea: 24 de enero de 2019

BCultivo de células
BExperimentos de privación de lípidos
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1074Metabolismo Celular29, 1061–1077, 7 de mayo de 2019

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Metabolismo Celular29, 1061–1077, 7 de mayo de 20191077
ESTRELLA+MÉTODOS

TABLA DE RECURSOS CLAVE

REACTIVO o RECURSO FUENTE IDENTIFICADOR

anticuerpos

Lexa 555-azida tecnologías de la vida Gato: #A20012

Anticuerpo monoclonal de ratón anti-Nestina (para CyTOF) Abcam N.º de gato ab6142; RRID: AB_305313

Anticuerpo monoclonal de rata anti-CD133 (para CyTOF) Bioleyenda N.º de gato 141202; RRID: AB_10896423

Anticuerpo monoclonal de ratón anti-Doublecortin Abcam N.º de gato ab135349; Clon: 2G5
(para CyTOF)

Anticuerpo policlonal de conejillo de indias anti-perilipina 2 PROGEN péptido sintético (aa 1-12 N-terminal de
adipofilina/PLIN2 humana)
Anticuerpo policlonal de conejo anti-53BP1 Productos biológicos Novus N.º de gato NB100-304; RRID: AB_10003037

Anticuerpo policlonal de cobayo anti-GFAP (para IHF) Sistemas sinápticos N.º de gato 173 004; RRID: AB_10641162

Anti-gramo-Anticuerpo monoclonal de conejo H2A.X Tecnología de señalización celular N.º de gato 9718; RRID: AB_2118009

Anticuerpo de conejo anti-Doublecortin (para IHF) Tecnología de señalización celular N.º de gato 4604; RRID: AB_561007

Proteína ácida fibrilar antiglial (GFAP) conejo Fabricante original: Dako; N.º de gato N1506; RRID: AB_10013482
anticuerpo (para IHC) Ahora: Agilent Technologies
Anti-CD11b (Mac-1) fluidigm Gato: #3154006B
Anti-CD45 fluidigm Gato: #3089005B
Anti-CD31 fluidigm Gato: #3165013B
Anti-CD146 fluidigm Gato: #3141016B
Antivimentina Abcam Gato:# ab8978

Anti-ACSA-2 miltenyi biotec Gato:# 130099138

Anti-GFAP ebiociencia Gato:# 14-9892-82
Anti-NeuN Abcam Gato:# ab177487
Anti-CNPasa Abcam Gato:# ab53041
Anti-OSP Abcam Gato:# ab53041

Sustancias químicas, péptidos y proteínas recombinantes

AP20187 MCEMedchemExpress.com Gato: # HY-13992/CS-1953

EdU tecnologías de la vida Gato: #E10187
Dasatinib Laboratorios LC Gato: # D-3307
quercetina Sigma Gato: # Q4951

CXCL1 recombinante Peprotech N.° de catálogo 250-11

Sal de reparixina L-lisina MedChemExpress Gato: # HY-15252

Ensayos comerciales críticos

Kit de disociación cerebral para adultos Miltenyi Biotec, CA Gato: #130-107-677
Matriz de citoquinas de ratón / Matriz de quimioquinas 31-Plex Tecnologías de Eva; Canadá MD31
Kit de transcriptasa inversa M-MLV Tecnologías de la vida N.º de gato 28025013

CyTOF para conjugar anticuerpos con metales fluidigm Cat#:201300

kit de ARN-ISH Acdbio Gato: #322350

Datos depositados

datos CyTOF Mendeley.com http://dx.doi.org/10.17632/w4gnsvjdf6.2

Modelos Experimentales: Líneas Celulares

Ratón primario (oreja) Fibroblastos adultos (MAF) Ogrodnik et al. (2017); Jurk et al. N/A
(2014)
Astrocitos embrionarios primarios de ratón verDetalles del métodosección N/A

(Continúa en la siguiente página)

e1Metabolismo Celular29, 1061–1077.e1–e8, 7 de mayo de 2019

Continuado
REACTIVO o RECURSO FUENTE IDENTIFICADOR

Modelos Experimentales: Organismos/Cepas

Ratón: C57BL/6 INK-ATTAC panadero et al. (2011) N/A

Ratón: BKS.Cg-Dock7m Homocigoto Leprdb/J (base de datos/ Laboratorios Jackson Número de inventario: 000697

base de datos) y BKS.Cg-Dock7m Heterocigoto Leprdb/J (base

de datos/+)

Ratón: C57BL/6 INK-ATTACbase de datos/base de datosybase de datos/+ratones Mayonesa N/A

Ratón: ratones C57BL/6 (Wt) Laboratorios Jackson Número de inventario: 000664

Ratón: ratones C57BL/6 Luc+ Laboratorios Jackson Número de inventario: 025854

Ratón: ratones C57BL/6 (Wt) (trasplante) Laboratorio del Dr. Kirkland (Mayo) N/A

oligonucleótidos
Cebadores para p16 (CDKN2A) Biosistemas Aplicados N.º de cat. 4331182; Identificación del ensayo: Mm00494449_m1

Cebadores para p21 (CDKN1A) Biosistemas Aplicados N.º de cat. 4331182; Identificación del ensayo: Mm04205640_g1

Cebadores para la proteína de unión a TATA (TBP) Biosistemas Aplicados N.º de cat. 4331182; Identificación del ensayo: Mm01277042_m1

Nucleido peptídico TelC-Cy3 específico de telómero panagen N.° de catálogo F1002

sonda de ácido

Sondas de ARN-ISH Adcbio Gato: # 407721 (Cxcl1), Gato: # 315891 (IL-6),

Gato: # 400281 (eGFP)

Software y Algoritmos
Graphpad Prisma 5 y 7 Software GraphPad https://www.graphpad.com/
scientificsoftware/prisma/
ANÁLISIS DEL ÁRBOL DE ESPADAS citobanco https://www.cytobank.org/
Otro
Suero bovino fetal (FBS) América del Sur, Biooeste N.° de catálogo S181L-500

deplecionado en lípidos

Nilo rojo Sigma-Aldrich N.° de cat. N3013

Dieta para roedores con 60 kcal% de grasa Investigación de dietas N.° de cat. D12492

Dieta de comida para roedores Lab Diet (Suministros de laboratorio, Fort Worth, TX, N.º de gato 5053

EE. UU.)

Mezcla maestra de PCR universal rápida TaqMan Tecnologías de la vida N.º de gato 4352042

CONTACTO PARA COMPARTIR REACTIVOS Y RECURSOS

La información adicional y las solicitudes de recursos y reactivos deben dirigirse y serán cumplidas por el contacto principal, Diana Jurk (
jurk.diana@mayo.edu).

MODELO EXPERIMENTAL Y DETALLES DEL SUJETO

animales
Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Mayo Clinic (protocolo A26415).
TINTA-ATTAC+/-ratones transgénicos fueron generados y genotipados como se describió previamente (Baker et al., 2011) basado en estrategias
experimentales ideadas por JLK, TT, J. van Deursen y D. Baker en Mayo Clinic. Brevemente, los ratones INK-ATTAC fueron producidos y fenotipados en
Mayo Clinic. Los controles para los experimentos INK-ATTAC fueron ratones de fondo C57BL/6 INK-ATTAC-null criados en paralelo. C57BL/6 db/db y
base de datos/+ los ratones se adquirieron de Jackson Laboratories.
Los ratones se alojaron de 2 a 5 ratones por jaula, a 22 +/- 0,5-C en un ciclo día-noche de 12-12 horas y provisto de alimentos y aguaad libitum. Las jaulas y las camas
(Enrich-o'Cobs (The Andersons Incorporated) tratadas en autoclave) se cambiaron una vez por semana. Para los estudios de obesidad inducida por una dieta rica en grasas,
los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos alimentados con comida o HFD. Los ratones fueron alimentados con una dieta rica en grasas durante 2 a 4 meses antes de
que comenzaran los experimentos. Los alimentos ricos en grasas se compraron en Research Diets (n.º de cat. D12492). El 60% de las calorías de esta dieta alta en grasas
provienen de las grasas. La dieta estándar de comida para ratones se obtuvo de Lab Diet (cat no #5053). En todos los experimentos, los compañeros de camada del mismo
sexo fueron asignados aleatoriamente a los grupos experimentales.
A ratones INK-ATTAC se les inyectó por vía intraperitoneal (ip) AP20187 (10 mg/kg) (MCE MedchemExpress; Cat: # HY-13992/CS-1953) o vehículo (4
% de etanol, 10 % de PEG-400 y 2 % de Tween- 20 en agua destilada) durante 3 días cada 2 semanas durante un total de 8-10 semanas.

Metabolismo Celular29, 1061–1077.e1–e8, 7 de mayo de 2019e2

 Tratado con senolíticobase de datos/base de datoslos ratones fueron alimentados por sonda con Dasatinib (D; 5 mg/kg) (LC Laboratories; Cat: # D-3307) y
Quercetina (Q; 50 mg/kg) (Sigma; Cat: # Q4951) o vehículo (60 % Phosal, 10 % etanol y 30% PEG-400) durante 5 días cada 2 semanas durante 8 semanas.
Para mediciones de efectos fuera del objetivobase de datos/base de datosy los ratones alimentados con HDF (HFD durante 2 meses antes del tratamiento) se inyectaron por vía
intraperitoneal (ip) con 10 mg/kg de AP21087 o vehículo durante 3 días cada 2 semanas durante 8 semanas.
Se administró CXCL1 recombinante (Peprotech, #250-11) o vehículo (PBS) a C57BL/6 pobrevíainyección ip (5metrog/kg en PBS) diariamente durante 7 días.
Dos horas después de la última inyección, los ratones se ensayaron en campo abierto y en un laberinto en cruz elevado y se diseccionaron después.
Sal de reparixina L-lisina (MedChemExpress, n.º HY-15252) o clorhidrato de L-lisina (MedChemExpress, n.º HY-N0470) disuelta en H2Se administró O
a ratones obesos C57BL/6 (alimentados durante 2 meses con HFD)víainyección subcutánea (30 mg/kg) dos veces al día durante 2 semanas. Dos horas
después de la última inyección, los ratones se probaron en campo abierto y en un laberinto en cruz elevado y se diseccionaron después.
Los tejidos de los ratones sacrificados en los puntos de tiempo indicados se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido para estudios bioquímicos o se fijaron en
paraformaldehído (PFA) al 4 % durante 24 horas antes del procesamiento y la inclusión en parafina. Los tejidos incluidos en parafina se cortaron a las 3metrom o 10metrom
intervalos.

Cultivo de células
Fibroblastos adultos de ratón (MAF)
Los MAF se extrajeron de ratones C57BL/6 macho de 3-5 meses de edad. Los recortes de oreja se transportaron y almacenaron (no más de 1 h) en DMEM sin
suero en hielo. Los sacabocados se lavaron 3 veces con medio sin suero, se cortaron finamente y se incubaron durante 2-3 h a 37ºC.-C en DMEM que contenía 2
mg/ml de colagenasa A. Se obtuvo una suspensión unicelular mediante pipeteo repetido y pasándola a través de una aguja fina de 24 G. Las células se
centrifugaron durante 10 min a 1000 rpm y se cultivaron en Advanced D-MEM/F-12 (DMEM, Invitrogen) más 100 UI/ml de penicilina/estreptomicina, L-glutamina
2 mM y FBS al 10 % (Sigma) en O2 al 3 %.2y 5% CO2a los 37-C. Cada cepa celular se derivó de un ratón donante por separado y se expandió hasta generar
suficientes células para congelar alícuotas. Los MAF se descongelaron al menos una semana antes de realizar los experimentos. Para cada experimento, se
sembraron MAF a una densidad de 30000 células por pocillo de una placa de 12 pocillos en cubreobjetos esterilizados de vidrio de 19 mm (diámetro), se dejaron
crecer durante 24 h y luego se fijaron en PFA al 2 % (células jóvenes) o X- rayo irradiado con 10 Gy utilizando un PXI X-Rad 225 (RPS Services Ltd) para inducir la
senescencia celular. El medio se cambió dos veces por semana. El último cambio de medio se realizó el día 20 después de la inducción de la senescencia (IR) y las
células se fijaron en PFA al 2 % al día siguiente.
Para las mediciones de citoquinas, los medios de cultivo de las últimas 24 h (antes de la fijación celular) se enviaron a Eve Technologies para la
evaluación de SASP (Mouse Cytokine Array / Chemokine Array 31-Plex (MD31)).

Experimentos de privación de lípidos

En condiciones normales, los MAF se mantuvieron en Advanced DMEM/F-12 (DMEM, Invitrogen) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 %
(Sigma), 100 UI/ml de penicilina/estreptomicina y L-glutamina 2 mM. Para reducir el contenido de lípidos en los medios de cultivo de tejidos, se utilizó
FBS privado de lípidos (Biowest). Los medios que contenían FBS estándar (con lípidos) se designaron como "LÍPIDOS" y los medios que contenían FBS
sin lípidos se designaron como "SIN LÍPIDOS". Las células jóvenes (control no senescente) se mantuvieron durante al menos 7 días en condiciones
"SIN LÍPIDOS" antes de que se recogieran o se indujera la senescencia.

Astrocitos neocorticales de ratón

Los astrocitos se extrajeron de cerebros de embriones de 16 días de edad de ambos sexos. En el día 16 de embarazo, se sacrificaron los ratones y se
diseccionaron los cerebros de los embriones. Neocortex se aisló y homogeneizó pipeteando a través de una pipeta Pasteur recubierta con FBS, pulida
al fuego. Se aislaron por sedimentación piezas más grandes del neocórtex y se centrifugó el sobrenadante para aislar los astrocitos. Los cultivos de
astrocitos se sembraron a una densidad de 0,53106células/ml en placas de cultivo previamente recubiertas con 15metrog/ml poli-l-ornitina durante la
noche y posteriormente se lava con H2O y PBS. Los astrocitos se mantuvieron en medio DMEM/F12 suplementado con HEPES 5 mM, glucosa 33 mM,
bicarbonato de sodio 13 mM, suero bovino fetal al 10 %, glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y 100metrog/ml de estreptomicina (todas de
Invitrogen). Las células se cultivaron a 37-C en una atmósfera humidificada de 5% CO2y 3% O2. La inducción de la senescencia y la evaluación de los
marcadores de senescencia y el fenotipo ALISE se realizaron como para los MAF.

DETALLES DEL MÉTODO

Trasplante de células jóvenes y senescentes

Se obtuvieron ratones C57BL/6 de tipo salvaje del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA) y se mantuvieron en una instalación libre de
patógenos de 23 a 24-C bajo un régimen de 12 h de luz, 12 h de oscuridad con alimentos y aguaad libitum. El trasplante de células se realizó como se
describió anteriormente (Xu et al., 2018). Brevemente, se anestesiaron ratones de 18 meses con isoflurano y se les inyectó por vía intraperitoneal 150
metrol PBS a través de una aguja de 22 G que contiene 106control no senescentes o preadipocitos de ratón senescentes o solo PBS. Los preadipocitos
se obtuvieron de la grasa inguinal de ratones C57BL/6 transgénicos que expresan luciferasa jóvenes del Jackson Laboratory Harbor, (Bar, ME; código
RS 025854). La senescencia fue inducida por radiación de cesio de 10 Gy. La prueba de campo abierto se llevó a cabo 2 y 6 semanas después del
trasplante y el rendimiento de Rotarod se probó 2 y 12 semanas después del trasplante.

Composición corporal
Las masas magra y grasa de ratones individuales se determinaron mediante resonancia magnética nuclear cuantitativa utilizando un analizador EchoMRI
(Houston, TX) y se expresaron en función del peso corporal. Los animales no anestesiados se colocaron en un tubo de plástico que se introdujo

e3Metabolismo Celular29, 1061–1077.e1–e8, 7 de mayo de 2019

en el instrumento EchoMRI. La composición corporal, que comprende masa grasa y masa magra, se determinó en aproximadamente 90 segundos
por animal.

Pruebas de campo abierto

La actividad locomotora y el comportamiento similar a la ansiedad de los ratones se evaluaron en cámaras de actividad rectangulares con aislamiento acústico
(Med Associates, St Albans, VT, EE. UU.: W3L3profundidad = 27 cm327cm320 cm con ventiladores, láseres infrarrojos y sensores en funcionamiento continuo).
Las roturas de haz se evaluaron en intervalos de 2 min durante 30 min, se convirtieron automáticamente a la ubicación actual del ratón y la distancia recorrida
(cm) y se registraron en una computadora con el software Med-PC versión 4.0. Antes de la prueba, los ratones se aclimataron a la habitación durante 1-1,5 h
antes de introducirlos en las cámaras. Los ratones se habituaron durante 5 minutos en la cámara de campo abierto (sin registro) y luego se colocaron durante
otros 5 minutos en la jaula de la casa. Posteriormente, los ratones se volvieron a introducir en las cámaras y se registraron todos los movimientos del ratón
durante 30 min. La ansiedad se cuantificó por la distancia recorrida por los ratones en el 25% central de la cámara (zona 1) en función de la distancia total
recorrida por los ratones y por las frecuencias de entrada en la zona 1.

Laberinto superior elevado

Se utilizó un aparato de laberinto en cruz elevado de color gris. Dos brazos abiertos (2535 cm) y dos brazos cerrados (2535 cm) estaban unidos en ángulo recto a
una plataforma central (535cm). El aparato se colocó a 40 cm del suelo. Los ratones primero se aclimataron a la habitación durante 1-1,5 h y luego se colocaron
individualmente en la plataforma central con la espalda hacia uno de los brazos abiertos. Antes de la prueba, los ratones se habituaron al laberinto durante 1
minuto y luego se volvieron a colocar en la jaula durante 5 minutos. Los ratones se probaron durante 5 minutos, durante los cuales pudieron explorar
libremente el aparato. El software de seguimiento (Ethovision) reconoció la cabeza del ratón, el punto central del cuerpo y la base de la cola. La ansiedad se
cuantificó por la frecuencia y el tiempo dedicado a los golpes/inmersiones de la cabeza hacia los brazos abiertos. Una mayor ansiedad está indicada por una
menor frecuencia de movimiento con los brazos abiertos y menos tiempo allí.

Rotarod
La prueba de rendimiento de Rotarod evalúa el equilibrio del ratón y la coordinación motora. Los ratones se llevaron a la sala de pruebas un día antes de la
prueba y se habituaron durante la noche. Para las pruebas de referencia, los ratones se entrenaron primero en Rotarod (3375-M5; sistemas TSE) durante tres
días consecutivos. Los ratones se colocaron (de espaldas al experimentador) en la varilla giratoria de 4,0 cm de diámetro. Los ratones se entrenaron para
permanecer en la barra durante 200 segundos a una velocidad constante por día, aumentando la velocidad cada día de 4 rpm, 6 rpm a 8 rpm. Si un ratón se caía
durante el entrenamiento, se volvía a colocar en la barra. Para la prueba del cuarto día, el Rotarod se puso en marcha a 4 rpm y se aceleró constantemente a 40
rpm durante un intervalo de 5 min. Las velocidades a las que caían los ratones se registraron en 4 ensayos consecutivos. Dos y 12 semanas después de las
mediciones iniciales, los ratones se probaron nuevamente, habituándose durante la noche anterior al día de la prueba. El promedio se normalizó a la línea de
base y se tomó como un indicador del equilibrio del ratón y la coordinación motora.

Laberinto en T de Stone
Se utilizó una versión motivada por el agua del laberinto en T de Stone para medir la memoria murina a corto plazo. Se colocó un tramo recto (para el entrenamiento previo) o el laberinto en
T de Stone en una bandeja de acero llena de agua a una profundidad de aproximadamente 3 cm, de modo que la mitad de la altura de las paredes interiores del laberinto estuvieran bajo el
agua. Los techos de la pista recta y del laberinto se cubrieron con acrílico transparente para evitar que los ratones salieran del agua. Estas dimensiones crearon una situación que permite a
los ratones mantener el contacto con el suelo mientras mantienen la cabeza fuera del agua. Los ratones se colocaron en una caja de inicio y se empujaron hacia el interior del laberinto
utilizando un panel deslizante. Al final de la recta o del laberinto había una portería que contiene una rampa a un piso seco, lo que permite a los ratones escapar del agua al completar con
éxito la carrera recta o el laberinto. El primer día, los ratones se sometieron a un entrenamiento de carrera directa para establecer el concepto de que avanzar les permite escapar del agua al
alcanzar una meta sin agua. La finalización exitosa de esta fase requiere que los ratones alcancen el cuadro objetivo en 10 segundos o más rápido en 8 de cada 10 intentos. Los ratones que
no alcanzaron este criterio fueron excluidos de más pruebas. El entrenamiento del laberinto comenzó al día siguiente. Los ratones tuvieron que completar 9 ensayos de adquisición de
laberintos en un solo día. Todos los ratones por grupo realizaron una prueba antes de realizar la siguiente. Las ejecuciones con entre 6 y 8 ratones dieron como resultado intervalos entre
pruebas (ITI) de aproximadamente 5 a 12 minutos. Durante el ITI, los ratones se colocaron en una jaula de contención que contenía una toalla seca que se calentó adicionalmente con una
lámpara de calor roja. Las medidas primarias de aprendizaje y memoria fueron la latencia para alcanzar la meta y el número de errores cometidos. Un error se definió como la entrada
completa de la cabeza del ratón o de todo el cuerpo en una ruta incorrecta. Durante la fase de adquisición, si algún ratón no lograba alcanzar la casilla objetivo en 5 minutos, la prueba
finalizaba y se calificaba como un fracaso. Cualquier ratón que tuviera 3 fallos se eliminó de los ensayos posteriores. Ninguno de los ratones fue excluido de este estudio. si algún ratón no
lograba alcanzar la meta dentro de los 5 minutos, la prueba se terminaba y se calificaba como un fracaso. Cualquier ratón que tuviera 3 fallos se eliminó de los ensayos posteriores. Ninguno
de los ratones fue excluido de este estudio. si algún ratón no lograba alcanzar la meta dentro de los 5 minutos, la prueba se terminaba y se calificaba como un fracaso. Cualquier ratón que
tuviera 3 fallos se eliminó de los ensayos posteriores. Ninguno de los ratones fue excluido de este estudio.

RT-PCR
El ARN total se extrajo del tejido adiposo blanco y del cerebro usando Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA) y se transcribió inversamente
a ADNc con un kit de transcriptasa inversa M-MLV (Life Technologies). La PCR en tiempo real se realizó en un sistema de PCR en tiempo real
7500 Fast (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Life Technologies) y cebadores y sondas
prediseñados de Applied Biosystems (ID de ensayo: Mm00494449_m1 [CDKN2A] ; Mm04205640_g1 [CDKN1A]). La expresión del gen diana
se expresó como 2-DDCT por el método CT comparativo y normalizado a la expresión de la proteína de unión a TATA (TBP) (ID del ensayo:
Mm01277042_m1 [TBP]).

Metabolismo Celular29, 1061–1077.e1–e8, 7 de mayo de 2019e4

Beta-galactosidasa asociada a la senescencia celular (SA-B-Gal) Actividad
El día del sacrificio, se fijó un pequeño trozo de tejido adiposo con PFA al 2 % y glutaraldehído al 0,5 % (Sigma) durante 15 minutos a temperatura
ambiente antes de incubarlo durante la noche en SA-B-solución Gal (NaCl 150 mM (Sigma), MgCl 2 mM2(Sigma), ácido cítrico 40 mM (Sigma), NaPO 12
mM3(Sigma), 400metrog/ml de X-gal (Thermofisher), 2,1 mg/ml de trihidrato de hexacianoferrato(II) de potasio y 1,65 mg/ml de trihidrato de
hexacianoferrato(III) de potasio (Sigma), pH 6,0) a 37-C durante la noche. Los trozos de grasa se lavaron con PBS tres veces y se almacenaron en PBS
a 4-C protegido de la luz. En 3 días, el tejido adiposo se tiñó con solución de Hoechst (1:5000; Thermofisher), se aplastó ligeramente entre dos
portaobjetos de vidrio de 1x3 pulgadas y se tomaron imágenes con un microscopio óptico. Se capturaron de 10 a 20 campos visuales aleatorios con
un aumento de 20x con exposiciones de luz idénticas para todas las muestras. Las imágenes se cuantificaron por conteo manual de SA-B-Células
positivas para Gal por un evaluador ciego y los datos se expresaron como porcentaje del total de células positivas para DAPI.

Citometría de masas/CyTOF en el cerebro

Esta técnica combina de manera única la espectrometría de masas de tiempo de vuelo con la tecnología de marcaje de metales para permitir la detección de hasta 40 proteínas objetivo por célula. Se diseñó un

panel de anticuerpos basado en marcadores de superficie, factores de transcripción y citoquinas (consulte la tabla a continuación) para la citometría de masa cerebral/citometría por tiempo de vuelo (CyTOF).

Cada anticuerpo se marcó con un isótopo de metal raro y se verificó su función mediante citometría de masas de acuerdo con el manual del fabricante (Multi Metal labeling Kits, Fluidigm, CA). Se usó un

citómetro de masas CyTOF-2 (Fluidigm, South San Francisco, CA) para la adquisición de datos. Los datos adquiridos se normalizaron en base a perlas de normalización (Ce140, Eu151, Eu153, Ho165 y Lu175). Se

disoció un solo hemisferio cerebral en una suspensión de una sola célula usando kits de disociación de tejido cerebral siguiendo las instrucciones del fabricante. (Kit de disociación de cerebro adulto, Miltenyi

Biotec, CA). Las células recolectadas se incubaron con anticuerpos conjugados con metales en tampón de tinción celular (ProductMaxpar Cell Staining Buffer, Fluidigm, CA) y, para analizar las proteínas

intracelulares, incluidos los factores de transcripción y las citocinas, se realizó la fijación y la permeabilización de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Transcription Factor Staining Buffer Set,

eBioscience, San Diego, CA). Los datos de CyTOF fueron analizados por Cytobank (Santa Clara, CA). la fijación y la permeabilización se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Transcription

Factor Staining Buffer Set, eBioscience, San Diego, CA). Los datos de CyTOF fueron analizados por Cytobank (Santa Clara, CA). la fijación y la permeabilización se realizaron de acuerdo con las instrucciones del

fabricante (Transcription Factor Staining Buffer Set, eBioscience, San Diego, CA). Los datos de CyTOF fueron analizados por Cytobank (Santa Clara, CA).

Anticuerpos utilizados en CyTOF

Nombre de un antígeno Empresa productora de anticuerpos Número de catalogo Isótopos Metálicos Dilución

CD11b (Mac-1) fluidigm 3154006B 154Sm 1:200

CD45 fluidigm 3089005B 89Y 1:400
anidando Abcam ab6142 148nd 1:100
Dcx Abcam ab135349 173Yb 1:100
vimentina Abcam ab8978 161Dy 1:100
CD133 Bioleyenda 141202 153Eu 1:100
ACSA-2 miltenyi biotec 130099138 142nd 1:100
Gfap ebiociencia 14-9892-82 172Yb 1:100
CD31 fluidigm 3165013B 165Ho 1:100
NeuN Abcam ab177487 169Tm 1:50
CD146 fluidigm 3141016B 141Pr 1:100
CNPasa Abcam ab53041 151Eu 1:200
OSP Abcam ab53041 159Tb 1:200

citoquinas
Los MAF y los astrocitos se colocaron en placas en cubreobjetos de 19 mm (diámetro) y, al final de los experimentos, se lavaron brevemente con PBS y se fijaron
durante 10 min con paraformaldehído al 2% disuelto en PBS. Las células se permeabilizaron durante 5 min con TRITON X-100 al 0,5 % diluido en PBS. Las células
se incubaron con tampón de bloqueo (suero de cabra normal al 5% (S-1000, Vector Laboratories) en PBS) durante 60 min a temperatura ambiente. Los
anticuerpos Plin2 (PROGEN #GP46, 1:250), 53BP1 (Novus Biologicals, #NB100-304, 1:250) y GFAP (Synaptic Systems, #173 004, 1:1000) se diluyeron en tampón de
bloqueo y se aplicaron durante la noche a 4-C. Al día siguiente, las células se lavaron 3 veces con PBS y se incubaron durante 60 min con anticuerpo anti-conejillo
de indias de cabra Alexa Fluor 647 secundario (1:1000) para la tinción de Plin 2; Alexa Fluor 488, cabra, anti-conejo (1:1000) para tinción 53BP1 o Alexa Fluor 647,
cabra, anti-conejillo de indias (1:1000) para tinción GFAP. Para la cuantificación de los marcadores de senescencia, los cubreobjetos se lavaron 3 veces en PBS y
luego se montaron en Vectashield, medio de montaje que contenía DAPI. Para evaluar la acumulación de lípidos, las células se lavaron 3 veces con PBS antes y
después de la solución de DAPI (PARTEC), que se añadió durante 30 min a temperatura ambiente. 2metrol de solución de rojo Nilo (Rojo Nilo (Sigma N3013) 150
metrogramos ml-1en acetona) se añadieron a 1 ml de glicerol al 80 % (en agua Milli-Q) y se mezclaron bien. 20metroSe añadieron directamente l de Nile Red/
glicerol a cada muestra de células y se montaron en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Las imágenes se tomaron inmediatamente después del montaje
utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio Leica DM5500 con una lente de objetivo de 20x. El área de las gotitas de lípidos se cuantificó usando
ImageJ (herramienta ''Analizar partículas'') en >50 células enR10 imágenes por réplica biológica.

e5Metabolismo Celular29, 1061–1077.e1–e8, 7 de mayo de 2019

Experimentos de EdU
Para los experimentos de EdU, se inyectó EdU (Life Technologies; Cat: #E10187) a ratones HFD y control INK-ATTAC alimentados con chow-fed tratados con AP a
una dosis de 123 mg/kg con una concentración final de 6,15 mg/mL, disueltos en agua estéril. PBS (pH 7,4, Fisher Scientific), 2 horas antes de la perfusión. Hubo
un intervalo de 15 minutos entre las inyecciones de ratón para permitir el tiempo necesario para perfundir cada ratón. Los animales se anestesiaron
profundamente con 90 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina en PBS estéril antes de la perfusión. La perfusión transcardíaca con PBS fue seguida por una
perfusión con paraformaldehído al 4% en PBS enfriado en hielo. Los cerebros se recogieron y se posfijaron durante la noche en paraformaldehído al 4 % en PBS
a 4-C, se lavó con PBS y se almacenó a 4-C para seccionamiento con vibratomo. Secciones sagitales del cerebro de 50metrom se cortaron en un vibratomo y se
recogieron secuencialmente en 6 pocillos de placas diferentes, un total de 13 secciones, 250metrom aparte en cada pocillo, lo que representa 1/6 del hemisferio
cerebral. Las secciones se tiñeron de forma flotante en placas de 12 pocillos y todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente en un volumen de
500metrol en cada pozo. Las secciones se permeabilizaron inicialmente en Triton X-100 al 4 % (Sigma-Aldrich) en PBS durante 1 h con 3 lavados posteriores con
PBS. La reacción de clic se realizó para la visualización de EdU, incluido L-ascorbato de sodio (+) 20 mM (Sigma-Aldrich), 10metroM Alexa 555-azida (Life
Technologies) y sulfato de cobre 4 mM (Sigma-Aldrich) en PBS. Las secciones se incubaron con agitación suave durante 15 min seguido de lavado con PBS. Se
recogieron secciones de cerebro y se colocaron en portaobjetos de vidrio gelatinizado. Todas las preparaciones se montaron con medio de montaje fluorescente
(DAKO) y se cubrieron con cubreobjetos.

Para la evaluación de la neurogénesis del hipocampo, EdU+Se tomaron imágenes de los portaobjetos de células utilizando un microscopio de fluorescencia Leica DM5500B
con apilamiento Z en profundidad. Las células se contaron manualmente en la capa basal de la circunvolución dentada en las 13 secciones y se multiplicaron por 6 para
obtener una estimación del número de células en división por hemisferio.
Para la evaluación de la neurogénesis en la zona subventricular (SVZ), 13 sagital, 50metroSe tomaron imágenes de secciones de m de espesor utilizando un
microscopio de fluorescencia Leica DM5500B. Se utilizó el apilamiento Z en profundidad (las imágenes se capturaron como pilas separadas por 4metrom con un
objetivo de 10x). La cantidad de células positivas se contó manualmente en la SVZ ventral utilizando ImageJ y el número total de células se normalizó con el
número de imágenes tomadas.

Inmunotinción y focos asociados a telómeros (TAF) y cuantificación

Las secciones de parafina se desparafinizaron con Histoclear y se hidrataron en un gradiente de etanol seguido de agua y PBS. El antígeno se recuperó mediante
incubación en tampón de citrato 0,01 M (pH 6,0) a 95ºC.-C durante 10 min. Los portaobjetos se colocaron en tampón de bloqueo (suero de cabra normal 1:60
[S-1000, Vector Laboratories] en BSA/PBS al 0,1 %) durante 60 min a temperatura ambiente. Para la tinción de TAF, los portaobjetos se bloquearon
adicionalmente con avidina/biotina (Vector Lab, #SP-2001) durante 15 minutos cada uno. Los anticuerpos primarios utilizados (tabla a continuación) se diluyeron
en tampón de bloqueo y se aplicaron durante la noche a 4-C. Al día siguiente, los portaobjetos se lavaron 3 veces con PBS y se incubaron durante 30 min con
anticuerpo secundario anti-conejo de cabra (1:200; Vector Laboratories #BA-1000) para tinción TAF o durante 60 min con anticuerpo secundario Alexa (tabla
anterior ). Para la tinción TAF, se aplicó fluoresceína-avidina en PBS (1:500; #A-2011, Vector Lab) a cada muestra durante 20 min. Los portaobjetos se lavaron 3
veces en PBS, seguido de FISH para la detección de TAF. Brevemente, los tejidos se entrecruzaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 min y se
deshidrataron en etanol graduado. Las secciones se desnaturalizaron durante 10 min a 80-C en tampón de hibridación (70 % formamida (Sigma), 25 mM MgCl2,
Tris 0,1 M (pH 7,2) y reactivo de bloqueo al 5 % [Roche]) que contiene 2,5metrogramos ml-1Sonda de ácido nucleico peptídico específica de telómero marcada con
Cy-3 (CCCTAA) (Panagene), seguida de hibridación durante 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Los portaobjetos se lavaron dos veces con formamida al
70 % en 23SSC durante 15 min, seguido de lavados en 23SSC y PBS durante 10 min. Las secciones se montaron en medios de montaje que contenían Vectashield
DAPI y se tomaron imágenes.
un solo, 3metroSe usó una sección de m de espesor por ratón para la tinción TAF, mientras que la tinción Dcx y Plin2 se realizó 80metrom-apart en tres 10
metrosecciones de m de espesor. Para cuantificar la acumulación de lípidos periventriculares, se tomaron de 10 a 30 imágenes en la región periventricular
utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio DM5500 de Leica con un objetivo de 10x (para la frecuencia de glía periventricular positiva para
ALISE) o x40 (para la evaluación del fenotipo ALISE de células ependimales). lente. El número de células positivas para Plin2 (para la frecuencia de glía
periventricular positiva para ALISE) o el área de vesículas positivas para Plin2 (para el fenotipo ALISE de células ependimales) se evaluó utilizando el software
ImageJ. Para la evaluación de la identidad de las células Plin2+, 10metroLas secciones de m de espesor se tiñeron con una combinación de anticuerpos para Iba1
(anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488), Plin2 (anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 594) y vimentina (anticuerpo secundario
conjugado con Alexa Fluor 647) y se cuantificaron para la frecuencia de Astrocitos Plin2+ (Iba1-, Vim+) y microglia (Iba1+) en la región periventricular. Se usaron
tinciones separadas para Plin2 (anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 594) y NeuN (anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 647) para
determinar la frecuencia de neuronas Plin2+ en la región periventricular. Para la cuantificación de TAF, se utilizó el apilamiento Z en profundidad (las imágenes
se capturaron como pilas separadas por 0,4metrocon363) seguido de análisis ImageJ.

Niveles séricos de las citoquinas Eotaxina, G-Csf, Tnf-a,Il-6, Ifn-gramo,Il-1a,Il-1B,Il-17, Il-2, Kc/Cxcl1, Mcp-1, M-Csf, Mig, Mip-1a,y Mip-1Bse
determinaron utilizando un ensayo de microesferas láser multiplexado (Mouse Cytokine Array/Chemokine Array 31-Plex (MD31), Eve
Technologies; Canadá). Se extrajo sangre de los ratones pinchando la vena submandibular el día de la disección antes de sacrificar un
animal. 50metroL de suero se envió a Eve Technologies en hielo seco. Debido a la alta variabilidad de los datos, se realizó una eliminación
imparcial de valores atípicos utilizando el método de ROUT (Graphpad 7 Prism). El mismo panel se usó para detectar factores SASP en MAF
y 50metroSe enviaron l de medios a Eve Technologies en hielo seco.

Metabolismo Celular29, 1061–1077.e1–e8, 7 de mayo de 2019e6

Inmuno y tinción con rojo Nilo para MAF y astrocitos

Anticuerpos utilizados en la inmunotinción

Empresa Productora de
Anticuerpo Primario y Catálogo Anticuerpo primario: Anticuerpo Secundario: Origen y Anticuerpo terciario o
Número origen y concentración Concentración Sistema de desarrollo

gramo-H2A.X Señalización celular, #9718S Conejo, 1:250 Anti-conejo, biotinilado, Cabra, 1:200 DSC-fluoresceína
(Laboratorio de vectores)

Perilipina 2 (Plin2) Sistemas sinápticos, #GP46 Conejillo de Indias, 1:250 Anti-conejillo de indias, Alexa 594 o 488,
Cabra, 1:1000

Iba1 Abcam, #ab5076 Cabra, 1:250 Anti-cabra, biotinilado, burro, 1:1000

S100B Sistemas sinápticos, #287006 Pollo, 1:1000 Anti-conejillo de indias, Alexa 594 o 647,
Cabra, 1:1000

vimentina Abcam, #ab24525 Pollo, 1:1000 Anti-conejillo de indias, Alexa 647, Cabra, 1:1000

Dcx (doblecortina) Señalización celular #4604 Conejo, 1:250 Anti-conejo, Alexa 594, Cabra, 1:1000
NeuN/FoxO Abcam ab104224 Ratón, 1:500 Anti-ratón, Alexa 647, Cabra, 1:1000
Gfap Sistemas sinápticos, #173004 Conejillo de Indias, 1:500 Anti-conejillo de indias, Alexa 647, Cabra, 1:1000

EdU Tecnologías de vida #E10187 Alex555-azida, 10metrom, #A20012

53BP1 productos biológicos novus, Conejo 1:250 Anti-conejo, Alexa 488, Cabra, 1:1000
#NB100-304

IHC para GFAP

La distribución tisular de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en el cerebro se evaluó mediante inmunohistoquímica utilizando una estación de trabajo de
análisis de imágenes después de la tinción con anticuerpos. Las secciones de cerebro fueron pretratadas con 0.3% H2O2metanol durante 1 hora a temperatura
ambiente y con suero de cabra normal durante 1 hora a temperatura ambiente. Cada muestra se incubó con el anticuerpo primario durante la noche a 4-C. El
anticuerpo principal utilizado en este estudio y las diluciones fueron los siguientes: proteína ácida fibrilar glial anti-vaca de conejo (GFAP) [1:800, DAKO,
Dinamarca]. La inmunohistoquímica se realizó utilizando el sistema VECTASTAIN ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) con el método del complejo avidina/
biotina peroxidasa (ABC). Los controles negativos incluyeron el reemplazo de los anticuerpos primarios con suero de conejo normal [1:200, DAKO]. La
inmunorreactividad frente a muestras de control positivo de rata de los anticuerpos primarios se determinó antes de su uso.

Hibridación in situ de ARN (ARN-ISH)

RNA-ISH se realizó después del protocolo RNAscope de Advanced Cell Diagnostics (ACD). Las secciones de parafina se desparafinaron con Histoclear,
se rehidrataron en etanol graduado (EtOH) y H2O2se aplicó durante 10 min a temperatura ambiente seguido de 2 lavados en H2O. Las secciones se
colocaron en reactivo de recuperación caliente y se calentaron durante 15 min. Después de lavados en H2O y EtOH al 100%, las secciones se secaron
al aire. Las secciones se trataron con proteasa plus durante 30 min a 40-C, lavado con H2O, y se incubó con la sonda objetivo (p16) durante 2 horas a
40-C. Posteriormente, los portaobjetos se lavaron con H2O seguido de incubación con AMP1 (30 min a 40-C) y luego se lava con tampón de lavado
(WB) y AMP2 (15 min a 40-C), WB y AMP3 (30 min a 40-C), WB y AMP4 (15 min a 40-C), WB y AMP5 (30 min a TA) y WB y, por último, AMP6 (15 min a TA).
Por último, se utilizó un RNAscope 2.5 HD Reagent kit-RED para el marcaje cromogénico. Después de contrateñir con hematoxilina, se montaron las
secciones.
Para el análisis de citoquinas (Il-6 y Cxcl1), las secciones se tiñeron conjuntamente con anticuerpos para Plin2 y S100B.Brevemente, después del marcaje cromogénico para
las citocinas, las secciones se lavaron 3 veces en TBS durante 5 min cada una, seguido de bloqueo en BSA al 0,1 % en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Las
secciones se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios a 4-C. A continuación, las secciones se lavaron 3 veces en TBS durante 5 minutos cada una, seguidas de
una incubación con el anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de 3 lavados con TBS, las secciones se montaron utilizando medios de montaje
ProLong Gold que contenían DAPI. Sondas utilizadas: para detectar p16 usamos eGFP: 400281, para Il-6: 315891 y para Cxcl1: 407721 (todos de ADC). Para todos los
experimentos de ARN-ISH, los datos se analizaron cuantificando el % de células positivas (lo que significa que cada célula que contenía al menos 1 foco se contó como
positiva).

CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los datos se presentan como media ± SEM para todos los datos. Todos los análisis estadísticos, incluida la prueba de la normalidad de la distribución de datos,
se realizaron con GraphPad Prism 7.01 y un valor de P <0,05 se consideró significativo. El estudio fue diseñado para comparar los cambios en los parámetros
entre animales delgados y obesos y entre obesos y obesos tratados de forma independiente. Se evaluó la normalidad de todos los datos mediante la prueba de
normalidad de D'Agostino & Pearson (para n>7) o la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk (para n 7Rn>3). por diferencias

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entre 2 grupos (comparación planificada de 2 grupos) se usó la prueba t, los datos se probaron adicionalmente para determinar la igualdad de varianzas usando la prueba F.
Para conjuntos de datos no distribuidos normalmente (p<0,05 en las pruebas de normalidad de D'Agostino & Pearson o Shapiro-Wilk), se utilizó la prueba U de Mann-Whitney.
Para conjuntos de datos normalmente distribuidos, se utilizó la prueba t de Welch (si p<0,05 en la prueba F) o la prueba t de Student. Para las comparaciones de 2> grupos, se
usó ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Para conjuntos de datos divididos en dos factores independientes, se utilizó ANOVA de 2 vías. Las
correlaciones se evaluaron mediante la prueba de correlación de rangos de Pearson (para conjuntos de datos de distribución normal) o de Spearman (para conjuntos de
datos de distribución no normal). Todos los detalles sobre las pruebas estadísticas utilizadas para cada comparación están enTabla S1.

DISPONIBILIDAD DE DATOS Y SOFTWARE

Los datos de CyTOF (datos seleccionados, debido a restricciones de espacio) se han depositado en Mendeley:http://dx.doi.org/10.17632/w4gnsvjdf6.2. (Yi Zhu
proporcionará el conjunto completo de datos:zhu.yi@mayo.edu).

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