PRACTICA No.

TINCION DE GRAM

Y
TINCION DE BACTERIAS ALCOHOL-ÁCIDO RESISTENTES

Q.F.B. Zeferino Fermín Rivera Cázares

Número de profesionales en formación por unidad de práctica

Duración de la practica 3 horas
Número de personas por mesa de trabajo 4 Alumnos
INTRODUCCIÓN

Las células además de ser demasiado pequeñas, tampoco presentan una coloración propia que permita
su observación a través del microscopio.
Para observar las características morfológicas de los microorganismos se utilizan las preparaciones fijas
y teñidas o coloreadas.
Para teñir un microorganismo se dispone de un gran número de compuestos llamados colorantes, que
de acuerdo a su estructura química pueden ser derivados del trifenilmetano, de la oxacina, o de la
tiacina. El colorante consta de dos partes: grupo cromóforo (confiere el color) y grupo axócromo
(confiere su capacidad a comunicar el color a la estructura).
Otra clasificación de los colorantes es de acuerdo a su comportamiento químico, es decir puede ser un
comportamiento, un colorante ácido o aniónico presenta una carga negativa, tiñen a los componentes
básicos de la célula; Los colorantes básicos poseen carga positiva y tiñen a los compuestos ácidos de las
células. También existen los colorantes neutros que son una sal compuesta por un colorante ácido y un
colorante básico. Lo colorantes generalmente vienen ya preparados (generalmente en forma de polvo o
cristales a pulverizar), a los cuales solo hay que añadir agua, alcohol o ambos.
El fundamento químico de una tinción, propone un mecanismo de intercambio iónico entre los
componentes del colorante y los sitios activos de la superficie o interior de la célula.

Azul de metileno (MB+ Cl-) (célula bacteriana)- MB+ + Na+ Cl –

(Célula bacteriana)- Na+ célula teñida

Existen diferentes tipos de coloraciones:

a) Coloración simple
b) Coloración diferencial
c) Tinción negativa

Todas las formas de tinción nos muestran las cinco posibles formas de una bacteria.
1. Cocos: forma esférica u oval.
2. Bacilos: bacterias cilíndricas o en forma de bastón.
3. Espirilos: bacterias de formas espirales.
4. Espiroquetas: bacteria de forma espiral helicoidal.
5. Vibriones o en forma de coma: cuando la espiral es corta e incompleta.

La tinción de Gram, es una tinción diferencial ya que permite distinguir entre dos tipos de
microorganismos, los de color rosa denominados Gram (-) y los de color morado llamados Gram (+).
El hecho de que las bacterias Gram (+) aparecen teñidas del colorante básico (cristal violeta) y las Gram
(-) con el colorante de contraste (safranina), se debe a esta tinción está hecha en función de la distinta
estructura de la pared celular. Así, al penetrar el colorante, en el caso de las bacterias Gram (+) el alcohol
provoca una deshidratación, lo cual con lleva a un cierre de los poros y, por tanto, impedir la salida del
colorante. En cambio, en las bacterias Gram (-), la membrana externa se disuelve y se extrae el colorante
y para hacerlas visibles se utiliza la safranina.
Otro procedimiento de coloración diferencial de amplio uso, sobre todo en el género Mycobacterium,
es la tinción para ácidorresitencia. Las paredes celulares de las micobacterias, debido a su alto contenido
de lípidos, tienen la exclusiva capacidad de combinarse con el colorante carbol fucsina, resistiendo la
decoloración con alcohol ácido. Esta reacción a la tinción acidorresistente junto con su característica
forma y tamaño, constituyen una valiosa ayuda para la detección precoz de la infección y control de la
terapia antimicobacteriana.
A fin de que el colorante primario penetre a través de las cápsulas cerosas de los bacilos
acidorresistentes, se requiere cierto tratamiento físico, en la técnica convencional de Ziehl-Neelsen se
utiliza el calor. Luego de cubrir el frotis con carbolfucsina, se pasa varias veces por el mechero hasta que
comience una evaporación de la solución colorante.
Una modificación a esta técnica es la de Kinyoun, denominada “método frío”, debido a que en lugar de
emplear calor, utiliza un detergente tensoactivo de nombre tergitol. En ambas técnicas se dice que los
colorantes se combinan con el ácido micólico de la pared celular micobacteriana.
Como en el caso de la tinción de Gram, la tinción de los microorganismos requiere una pared celular en
buen estado. El interior de la célula, rico en lípidos, conserva el colorante pero no la pared. La función
de ésta, y el fenómeno de resistencia a los ácidos, se debe a la insensibilidad de la pared frente a la
acción del aclarador, en este caso el ácido.

COMPETENCIAS A ALCANZAR:
Al término de la práctica el alumno es competente en la coloración de microorganismos porque:
➢ Realiza correctamente la tinción de un microorganismo mediante la técnica de Gram, con el fin de
observar la morfología de los microorganismos al microscopio
➢ Realiza correctamente la tinción de un microorganismo alcohol-acidorresistente mediante la
técnica diferencial de Ziehl-Neelseen, con la finalidad de identificar a este tipo de bacterias.

NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS DE LA PRÁCTICA

Como proceder en caso de

Tipo de peligro Como evitarlo
accidente
En caso de quemadura colocar la
Quemaduras por vapor u otro
Uso de guantes pomada correspondiente. Como
medio.
puede ser furacin.
Acudir de forma inmediata a la
Colocarse cubre bocas y lavarse las enfermería, para aplicar el
Contaminación por cepas
manos. tratamiento pertinente de
acuerdo a la cepa.
Lavar la herida con alcohol y
colocar mertiolate u otra solución
Cortadura con portaobjetos o
Uso de guantes antiséptica, tapar la herida con
cubreobjetos
una gasa según la magnitud de la
misma.
CUADRO DE DISPOSICIÓN DE DESECHOS

Tipo de desecho Como descartarlos Tipo de contenedor

Lavar los portaobjetos con agua,
Colorantes No requiere
jabón e hipoclorito.

El sobrante de medios de cultivo

se desecha en bolsas de
plástico, debido a que no
Medios de cultivo
contienen organismos vivos, se
pueden colocar los residuos en
bolsas de plástico.

Añadir al reciente que lo

contiene 2 mL de solución de
fenol al 2%
Esputo

NORMAS OFICIALES MEXICANAS

1.- NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-166-SSA1-1997. PARA LA ORGANIZACION Y FUNCIONAMIENTO

DE LOS LABORATORIOS CLINICOS.
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/166ssa17.html

2.- NORMA Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011, Para la organización y funcionamiento de los

laboratorios clínicos.
http://dof.gob.mx/nota_detalle.php?codigo=5240925&fecha=27/03/2012

3.- NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud ambiental -

Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/087ecolssa.html

a) REALIZA LA INVESTIGACIÓN DE LAS GENERALIDADES QUE SE INDICAN A CONTINUACIÓN.

GENERALIDADES

a) Colorantes y tipos de colorantes

b) Tinciones y su clasificación, el fundamento de cada una de las tinciones
c) Grupo de bacterias alcohol-acido resistente.
d) Composición bioquímica de la membrana de las micobacterias
e) Enfermedades que se transmiten por micobacterias
f) Técnica y fundamento de la Tinción alcohol-ácido resistente
 Contesta el cuestionario durante la práctica. (Checar la rúbrica para cuestionario en anexos)

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

MATERIAL
Equipo Sustancias por Equipo Muestras
12 Portaobjetos
1 Microscopio compuesto
1 Asa bacteriana
Etiquetas
1 Juego de colorantes de
1 Pizceta de 250 mL
Gram
1 Microscopio compuesto
Aceite de inmersión
1 Mechero Bunsen * Cultivos bacterianos
1 Fucsina básica fenicada
1 Asa bacteriana obtenidos en las prácticas
de Ziehl
1 Aceite de inmersión anteriores.
1 Ácido clorhídrico al 3%
1 Etiquetas * Esputo
en etanol al 95%
1 Tripie
1 Azul de metileno de
1 Tela de alambre
Loeffer
2 Vasos de precipitados de
250 mL
1 Triangulo de porcelana

METODOLOGÍA

I Tinción de Gram
1.Con el asa flameada y fría realizamos un frotis, utilizando una porción del cultivo y si es necesario una
gota de agua destilada.
2. Dejamos secar el frotis al aire libre o con calor suave.
3. Fijamos el frotis con calor.
4. Colocamos una gota de cristal violeta por un minuto.
5. Se lava ligeramente con lugol.
6. Colocamos lugol por un minuto.
7. Decolorar con alcohol- acetona durante unos 30 segundos.
8. Lavamos con agua.
9. Contrastamos con safranina durante 1 minuto.
10. Lavar con agua hasta eliminar el color rojo.
11. Secar al aire o con calor ligero y observar con objetivo de inmersión.
Fig. No. 11 Pasos de la tinción de Gram mostrando los cambios presentes en la célula bacteriana, durante el
proceso de tinción.

II Tinción ácido resistente

1. Con el asa flameada y fría realizamos un frotis, utilizando una porción del cultivo y si es necesario
una gota de agua destilada.
2. Deja secar el frotis al aire libre o con calor suave.
3. Fija el frotis con calor.
4. Se cubre el frotis con solución de carbolfucsina (fucsina básica fenicada) y se calienta hasta
emanación de vapores. Se tiñe durante 15 minutos. Tener cuidado de no evaporar todo el colorante.
5. Se lava con agua hasta eliminar el colorante.
6. Decoloramos con la mezcla de alcohol-ácido.
7. Lavamos con agua.
8. Contrastamos con azul de metileno de Loeffler durante 2 minutos.
9. Lavamos con agua hasta eliminar el color.
10. Secar al aire o con calor ligero y observar con objetivo de inmersión
 Fig. No.12 Procedimiento de la tinción alcohol ácido resistente par micobacterias.

EVALUACION DEL DESEMPEÑO

CONCEPTO PUNTAJE OBTUVO

Cumple con todos los requisitos para tener derecho a realizar la práctica: SI NO
Asistencia puntual, Bata Guantes, Muestras, Manual engargolado 5
Buen desarrollo de la práctica: Disciplina, Orden, limpieza, Obtención de
20
Resultados, Manejo adecuado de muestras y de RPBI
Cuestionario aplicado durante la práctica 15
Fundamentación técnica: Aplicación de lo obtenido a un caso de la vida
10
cotidiana y laboral.
TOTAL 50

REPORTAR

a) El reporte de esta práctica deberá incluir en los resultados:

➢ Las fotografías de los medios de cultivo con las cepas utilizadas para las tinciones señalando las colonias
a las cuales se les realizo la tinción.
➢ Las fotografías mostrando la técnica de tinción aplicada.
➢ Las fotografías que muestren los campos del microscopio describiendo lo que se observa en ellos,
señalando con flechas y letreros que permitan diferenciar a los microorganismos que se estén
presentes.
➢ Discusión de los resultados obtenidos y concluir en base a esta discusión.
➢ Explicar en un máximo de veinte renglones la aplicación de esta práctica en su vida profesional.
 Nota: Cabe señalar que es necesario explicar cada una de las fotografías y que estén numeradas.

b) Indica la bibliografía, citando se la siguiente manera la fuente de consulta:

Autor. Año.
Titulo. Edición
Editorial. País
Paginas

c) Contesta el cuestionario durante el desarrollo de la práctica y entrégalo al final de la misma.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es una tinción?

2. ¿Cuantos tipos de colorantes existen?
3. ¿Qué es un mordiente y que función tiene?
4. Explica en que consiste cada uno de los tipos de tinción.
5..Explica desde un punto de vista bioquímico porque las bacterias G+ se tiñen de violeta y las G- de rosa.
6. Que sucede en cada uno de los pasos de la tinción de Gram.
7. Menciona cinco características de las bacterias Gram positivas y cinco de las Gram negativas.
8. Qué similitud tiene la tinción alcohol acidorresistente con la de Gram.
9. Cuál es el fundamento de la tinción ácido resistente.
10. Como actúa cada uno de los reactivos durante la tinción.
11. Qué función realiza el fuego en la tinción.
12. Qué característica presenta la pared de las células ácido resistente.
13. Qué son las micobacterias y donde las podemos encontrar.
14. Qué enfermedades son transmitidas por las micobacterias.